一種表面等離子共振儀芯片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種表面等離子共振儀芯片及其制備方法；芯片是基于多巴胺接枝透明質酸和谷胱甘肽修飾的表面等離子共振儀芯片；包括玻璃片基底，上面鍍有鉻層和金膜層。首先通過酰胺化反應合成多巴胺接枝透明質酸，然后通過多巴胺氧化聚合時的粘附性將透明質酸連接到金膜表面，進一步通過邁克爾加成反應將谷胱甘肽修飾到透明質酸表面，從而獲得一種基于多巴胺接枝透明質酸與谷胱甘肽修飾的表面等離子共振儀芯片。本發(fā)明的芯片在單一蛋白(牛血清蛋白、溶菌酶、β?乳球蛋白)以及復雜體系牛奶中均具有比多巴胺接枝透明質酸修飾的芯片更好的抗污染性能。本發(fā)明的芯片具有優(yōu)良的抗污染性能，且制備方法簡便，原料易于合成，有很好的可行性和實用性。
【專利說明】
-種表面等離子共振儀巧片及其制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于表面等離子共振譜儀抗污染忍片的設計和制備方法;特別是一種基于 多己胺接枝透明質酸和谷脫甘膚修飾的表面等離子共振儀忍片及其制備方法，
【背景技術】
[0002] 表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,簡稱SPR)儀是20世紀80年代出現 的一種生物傳感器技術，當入射光從高折射率介質入射到低折射率介質時，會發(fā)生全反射， 此時若在介質交界面處鍛一層金屬薄膜(金或銀），入射光產生的漸逝波會引起金屬表面自 由電子發(fā)生集體振蕩，進而形成等離子體，當漸逝波與表面等離子體振蕩的頻率和波數相 等時，即產生共振現象(SPR)，導致能量從漸逝波轉移到表面等離子波中，使反射光的強度 大大減弱，呈現衰減全反射現象，當反射光的強度為零時的入射角稱為共振角。共振角與金 屬薄膜界面介質折射率有關，而折射率又隨結合在金屬薄膜表面的分子質量而變化，故可 通過分析共振角來獲得分子間相互作用的信息，由于其具有檢測快速且無需標記等特點， 已被廣泛應用于蛋白質組學、藥物研發(fā)、臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領域，并且顯示 出廣闊的應用前景。
[0003] SPR忍片是表面等離子共振儀最為核屯、的組件，提供產生SPR信號的必須物理條 件，主要包括禪合器件、金屬膜和表面基質。然而，應用表面等離子共振儀進行分析測試時， 傳感忍片的表面污染是一個普遍存在的問題，來自樣品中的生物分子或微生物的非特異性 吸附將降低定量檢測的準確性，產生假陽性結果。因此，開發(fā)有效抵抗非特異性吸附的表面 是提高表面等離子共振傳感器靈敏度和精確度的首要問題。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種基于多己胺接枝透明質酸(HADA)和谷脫甘膚(G甜)修飾 的表面等離子共振儀忍片及其制備方法。該忍片制備成本低，修飾方法簡單且不依賴于表 面的材料，相比單獨的多己胺接枝透明質酸具有更好的抗蛋白能力。
[0005] 本發(fā)明是通過W下技術方案加 W實現的：
[0006] -種表面等離子共振儀忍片;是基于多己胺接枝透明質酸和谷脫甘膚修飾的表面 等離子共振儀忍片。
[0007] 本發(fā)明的表面等離子共振儀忍片；如圖1所示，在玻璃片基底（1)上設置有涂層2- 3nm厚的銘層(2)，在銘層上設置有45-50nm厚的金膜層(3);在金膜(3)上修飾一層多己胺接 枝透明質酸層(4)，在多己胺接枝透明質酸層(4)上修飾一層谷脫甘膚層(5)。
[000引和可W在金膜層（3)和多己胺接枝透明質酸層(4)之間設置一層5-10皿厚的二氧 化娃層(6)。
[0009]本發(fā)明的表面等離子共振儀忍片的制備方法;步驟如下：
[0010] 1)用抑=7.4的憐酸鹽緩沖液配制濃度為5-15111旨/111誠多己胺接枝透明質酸溶液； 將清洗干凈的SH?忍片浸入上述多己胺接枝透明質酸溶液中，常溫下浸泡2-1化后取出，用 乙醇和去離子清洗使忍片表面清洗潔凈，并用氮氣吹干備用；
[OOW 2)用抑=8.5的立徑甲基氨基甲燒-鹽酸鹽緩沖液配制濃度為5-15mg/mL的谷脫甘 膚溶液;將修飾有透明質酸的Sra忍片浸入上述谷脫甘膚溶液中，常溫下浸泡12-24h后取 出；用乙醇和去離子清洗使忍片表面清洗潔凈，并用氮氣吹干。
[0012] 憐酸鹽緩沖液包括IOmM憐酸鹽、138mM氯化鋼和2.7mM氯化鐘。
[0013 ] S徑甲基氨基甲燒-鹽酸鹽緩沖液包括SOmMS徑甲基氨基甲燒。
[0014] =徑甲基氨基甲燒-鹽酸鹽緩沖液預先用高純氮進行脫氣處理。
[0015] 本發(fā)明的有益效果
[0016] 1)本發(fā)明研制的基于多己胺接枝透明質酸修飾的sra忍片化ADA-Au)具有較好的 抗蛋白能力。在溶菌酶、牛血清蛋白、e-乳球蛋白中非特性吸附量分別為2.27ng/cm2、 21.4211旨/畑12、16.0〇11旨/畑12，見附圖3，遠低于各蛋白在5邸裸金忍片表面的非特異性吸附量， 見附表1。而在牛奶中的非特異性吸附量為175.75ng/cm2,相比牛奶中的蛋白在裸金表面上 的非特異性吸附量提高了近一倍。
[0017] 2)本發(fā)明研制的基于多己胺接枝透明質酸與谷脫甘膚修飾的SPR忍片化ADA-G- Au)具有相比單純多己胺接枝透明質酸修飾的Sra忍片化ADA-Au)具有更好的抗蛋白能力。 在溶菌酶、牛血清蛋白、0-乳球蛋白中非特異性吸附量分別為0.59ng/cm2、7.51ng/cm2、 1.5化旨/畑12，在牛奶中的非特異性吸附量為34.41叫/畑12，見附圖3，相比于多己胺接枝透明 質酸修飾的SPR忍片(HADA-Au)抗蛋白能力提高一倍W上。
[0018] 3)本發(fā)明研制的基于多己胺接枝透明質酸與還原性谷脫甘膚修飾的SH?忍片 (HADA-G-Au)具有生物功能化作用，如可通過固載牛血清蛋白抗體進而檢測其抗原。
[0019] 4)本發(fā)明研制的基于多己胺接枝透明質酸與還原性谷脫甘膚修飾的SH?忍片 化ADA-G-Au)具有高穩(wěn)定性，干燥狀態(tài)下儲存3個月或抑為7.4憐酸鹽緩沖液中儲存7天后， 抗污染性能無變化。
[0020] 5)相比傳統(tǒng)商業(yè)化的抗污染材料SH?忍片的制備方法，本發(fā)明研制的基于多己胺 接枝透明質酸與谷脫甘膚修飾的Sra忍片化ADA-G-Au)的制備方法更為簡便，且成本低廉， 生物相容性好。
【附圖說明】
[0021] 圖1基于多己胺接枝透明質酸與還原性谷脫甘膚修飾的SPR忍片化ADA-G-Au);其 中，1-玻璃片基底，2-銘層，3-金膜層，4-多己胺接枝透明質酸層（HADA) ,5-谷脫甘膚層 (G甜)。
[0022] 圖2基于多己胺接枝透明質酸與還原性谷脫甘膚修飾的sra忍片化ADA-G-Si〇2); 其中，1-玻璃片基底，2-銘層，3-金膜層，4-多己胺接枝透明質酸層化ADA), 5-谷脫甘膚層 (G甜），6-二氧化娃層。
[0023] 圖3多己胺接枝透明質酸修飾的SPR忍片化ADA-Au)及多己胺接枝透明質酸與谷脫 甘膚修飾的Sra忍片(HADA-G-Au)對Img/mL的溶菌酶化ysozyme)、牛血清蛋白（BSA)、e-乳球 蛋白溶液W及牛奶中蛋白的非特異性吸附量。
[0024] 表1SPR裸金忍片對Img/mL的溶菌酶化ysozyme)、牛血清蛋白（BSA)、0-乳球蛋白 (P-Iactoglobulin)、牛奶中蛋白的非特異性吸附量。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明：
[00%]在玻璃片基底（1)上涂覆一層2-化m厚的銘層（2)和45-50皿厚的金膜層(3)，即獲 得SH?裸金忍片。然后通過疏水相互作用在金膜（3)上修飾一層多己胺接枝透明質酸層 (HADAK4)，再利用多己胺基團氧化聚合時形成的釀基與還原型谷脫甘膚上的琉基之間的 邁克爾加成反應，將谷脫甘膚修飾在多己胺透明質酸層上，形成一層谷脫甘膚層(GSHK5)。 或在SPR裸金忍片的基礎上先修飾一層其他材料的薄層，如附圖2:在金膜層(3)上涂覆一層 5-lOnm厚的二氧化娃層(6)，然后利用多己胺基團與基底間的氨鍵作用在二氧化娃層(6)上 修飾一層多己胺接枝透明質酸層化ADAK4)，再通過邁克爾加成反應在多己胺透明質酸層 上修飾一層谷脫甘膚層(G甜)（5 )，即獲得SPR二氧化娃忍片。
[0027]基于多己胺接枝透明質酸化ADA)和谷脫甘膚(G甜)修飾的表面等離子共振儀忍片 制備方法，步驟如下：
[002引a)多己胺接枝透明質酸(HADA)的修飾
[0029] 用抑=7.4的憐酸鹽緩沖液(包括1 OmM憐酸鹽，13SmM氯化鋼和2.7mM氯化鐘)配制 濃度為5-15mg/血的多己胺接枝透明質酸(HADA)溶液;將清洗干凈的Sra忍片浸入上述多己 胺接枝透明質酸(HADA)溶液中，常溫下浸泡2-1化后取出，用乙醇和去離子清洗使忍片表面 清洗潔凈，并用氮氣吹干備用；
[0030] b)透明質酸表面谷脫甘膚(G甜)的修飾
[0031] 用pH = 8.5的S徑甲基氨基甲燒-鹽酸鹽緩沖液(包括SOmMS徑甲基氨基甲燒)配 制濃度為5-15mg/mL的谷脫甘膚(G細)溶液;將修飾有透明質酸的Sra忍片浸入上述谷脫甘 膚(G甜)溶液中，常溫下浸泡12-24h后取出；用乙醇和去離子清洗使忍片表面清洗潔凈，并 用氮氣吹干即可。
[0032] 實施例1
[0033] 1)裸金忍片制備
[0034] 如附圖1所示，采用電子束蒸發(fā)鍛膜技術在BK7玻璃基底（1)上涂覆一層2-3nm厚銘 層(2)和一層45-50nm厚金膜(3)，獲得了裸金忍片。
[0035] 2)裸金忍片預處理
[0036] 將步驟1)獲得的裸金忍片置于紫外臭氧清洗儀中，紫外燈光照30min后取出，用乙 醇、水依次清洗=次，氮氣吹干備用。
[0037] 3)多己胺接枝透明質酸(HADA)的合成
[0038] 用十二水合憐酸氨二鋼和憐酸二氨鐘配制pH = 7.4的IOmM憐酸鹽緩沖液。取1.2g 透明質酸化A)溶于120mL上述憐酸鹽緩沖液中，用1.OM鹽酸將溶液的抑調至5.5,然后向溶 液中加入575. lmg(3mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，攬拌15min后加入 568.92mg( 3mmol)多己胺，用IM鹽酸將溶液的抑值維持在5.5且在室溫下攬拌反應2小時。將 反應后的溶液置于透析袋(MWC0:8000-14000)中，且在抑=5.0的水溶液中透析2天，再在去 離子水中透析12h。將透析后的溶液凍干得到粉末狀的產物(HADA)，于-20°C下儲存?zhèn)溆谩?br>[0039] 4)裸金忍片表面多己胺接枝透明質酸修飾
[0040] 將30mg多己胺接枝透明質酸化ADA)溶于6mL的憐酸鹽緩沖溶液中，至最終濃度為 5mg/mL。然后將2)獲得的忍片浸泡在上述溶液中，在水浴搖床中于37°C且l(K)rpm的搖速下 反應地。反應后的忍片用無水乙醇、水依次清洗=次，氮氣吹干。即獲得基于多己胺接枝透 明質酸(如附圖1中的4所示)修飾的SPR忍片(HADA-Au)。
[0041] 5)透明質酸忍片表面谷脫甘膚修飾
[0042] 用S徑甲基氨基甲燒和鹽酸配制抑= 8.5的50mM立徑甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液。 用預先脫氣的上述S徑甲基氨基甲燒-鹽酸鹽緩沖液配制濃度為5mg/mL的谷脫甘膚溶液， 將4)獲得的透明質酸修飾的SH?忍片浸入上述溶液中，常溫下浸泡12h后取出。用乙醇和去 離子水依次清洗3次，并用氮氣吹干備用，即獲得如附圖1中的透明質酸與谷脫甘膚(如附圖 1中的4，5所示)修飾的Sra忍片(HADA-G-Au);
[0043] 6)多己胺接枝的透明質酸與谷脫甘膚修飾的SPR忍片化ADA-G-Au)表面蛋白吸附 量檢測
[0044] 將步驟5)獲得的多己胺接枝透明質酸與谷脫甘膚修飾的SPR忍片化ADA-G-Au)用 柏油貼合到sra系統(tǒng)的棱鏡上。W抑為7.4的憐酸緩沖液為流動相，流速為25化/min。待基線 平穩(wěn)后，往定量環(huán)中注入25化L Img/mL的牛血清白蛋白，經流動相推動蛋白溶液到達忍片 表面，由sra系統(tǒng)測定共振角實時變化曲線，2〇min后讀取sra共振角變化值，并計算非特異 性吸附量。
[0045] 實施例2
[0046] 具體操作方法如下：
[0047] 1)裸金忍片制備
[0048] 如附圖1所示，采用電子束蒸發(fā)鍛膜技術在BK7玻璃基底（1)上涂覆一層2-3nm厚銘 層(2)和一層45-50nm厚金膜(3)，獲得了裸金忍片。
[0049] 2)裸金忍片預處理
[0050] 將步驟1)獲得的裸金忍片置于紫外臭氧清洗儀中，紫外燈光照30min后取出，用乙 醇、水依次清洗=次，氮氣吹干備用。
[0051] 3)多己胺接枝透明質酸(HADA)的合成
[0052] 用十二水合憐酸氨二鋼和憐酸二氨鐘配制pH = 7.4的IOmM憐酸鹽緩沖液。取1.2g 透明質酸化A)溶于120mL上述憐酸鹽緩沖液中，用1.OM鹽酸將溶液的抑調至5.5,然后向溶 液中加入575. lmg(3mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，攬拌15min后加入 568.92mg( 3mmol)多己胺，用IM鹽酸將溶液的抑值維持在5.5且在室溫下攬拌反應2小時。將 反應后的溶液置于透析袋(MWC0:8000-14000)中，且在抑=5.0的水溶液中透析2天，再在去 離子水中透析12h。將透析后的溶液凍干得到粉末狀的產物(HADA)，于-20°C下儲存?zhèn)溆谩?br>[0053] 4)裸金忍片表面多己胺接枝透明質酸修飾
[0054] 將30mg多己胺接枝透明質酸化ADA)溶于3mL的憐酸鹽緩沖溶液中，至最終濃度為 lOmg/mL。然后將2)獲得的忍片浸泡在上述溶液中，在水浴搖床中于37°C且l(K)rpm的搖速下 反應化。反應后的忍片用無水乙醇、水依次清洗=次，氮氣吹干。即獲得基于多己胺接枝透 明質酸(如附圖1中的4所示)修飾的SPR忍片(HADA-Au)。
[0055] 5)透明質酸忍片表面谷脫甘膚修飾
[0056] 用S徑甲基氨基甲燒和鹽酸配制抑=8.5的SOmMS徑甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液。 用預先脫氣的上述=徑甲基氨基甲燒-鹽酸鹽緩沖液配制濃度為IOmg/血的谷脫甘膚溶液， 將4)獲得的透明質酸修飾的SH?忍片浸入上述溶液中，常溫下浸泡24h后取出。用乙醇和去 離子水依次清洗3次，并用氮氣吹干備用，即獲得如附圖1中的透明質酸與谷脫甘膚(如附圖 1中的4，5所示)修飾的Sra忍片(HADA-G-Au);
[0057] 6)多己胺接枝的透明質酸與谷脫甘膚修飾的SPR忍片化ADA-G-Au)表面蛋白吸附 量檢測
[0化引將步驟5)獲得的多己胺接枝透明質酸與谷脫甘膚修飾的SPR忍片化ADA-G-Au)用 柏油貼合到Sra系統(tǒng)的棱鏡上。W抑為7.4的憐酸緩沖液為流動相，流速為25化/min。待基線 平穩(wěn)后，往定量環(huán)中注入25化L Img/mL的牛血清白蛋白，經流動相推動蛋白溶液到達忍片 表面，由sra系統(tǒng)測定共振角實時變化曲線，20min后讀取sra共振角變化值，并計算非特異 性吸附量為16.98ng/cm2。
[0化9]實施例3
[0060] 具體操作方法如下：
[0061] 1)裸金忍片制備
[0062] 如附圖1所示，采用電子束蒸發(fā)鍛膜技術在BK7玻璃基底（1)上涂覆一層2-3nm厚銘 層(2)和一層45-50nm厚金膜(3)，獲得了裸金忍片。
[0063] 2)裸金忍片預處理
[0064] 將步驟1)獲得的裸金忍片置于紫外臭氧清洗儀中，紫外燈光照30min后取出，用乙 醇、水依次清洗=次，氮氣吹干備用。
[0065] 3)多己胺接枝透明質酸(HADA)的合成
[0066] 用十二水合憐酸氨二鋼和憐酸二氨鐘配制pH = 7.4的IOmM憐酸鹽緩沖液。取1.2g 透明質酸化A)溶于120mL上述憐酸鹽緩沖液中，用1.OM鹽酸將溶液的抑調至5.5,然后向溶 液中加入575. lmg(3mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，攬拌15min后加入 568.92mg( 3mmol)多己胺，用IM鹽酸將溶液的抑值維持在5.5且在室溫下攬拌反應2小時。將 反應后的溶液置于透析袋(MWC0:8000-14000)中，且在抑=5.0的水溶液中透析2天，再在去 離子水中透析12h。將透析后的溶液凍干得到粉末狀的產物(HADA)，于-20°C下儲存?zhèn)溆谩?br>[0067] 4)裸金忍片表面多己胺接枝透明質酸修飾
[006引將30mg多己胺接枝透明質酸化ADA)溶于3mL的憐酸鹽緩沖溶液中，至最終濃度為 lOmg/mL。然后將2)獲得的忍片浸泡在上述溶液中，在水浴搖床中于37°C且l(K)rpm的搖速下 反應地。反應后的忍片用無水乙醇、水依次清洗=次，氮氣吹干。即獲得基于多己胺接枝透 明質酸(如附圖1中的4所示)修飾的SPR忍片(HADA-Au)。
[0069] 5)透明質酸忍片表面谷脫甘膚修飾
[0070] 用S徑甲基氨基甲燒和鹽酸配制抑=8.5的SOmMS徑甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液。 用預先脫氣的上述=徑甲基氨基甲燒-鹽酸鹽緩沖液配制濃度為IOmg/血的谷脫甘膚溶液， 將4)獲得的透明質酸修飾的SH?忍片浸入上述溶液中，常溫下浸泡2地后取出。用乙醇和去 離子水依次清洗3次，并用氮氣吹干備用，即獲得如附圖1中的透明質酸與谷脫甘膚層(如附 圖1中的4，5所示)修飾的Sra忍片(HADA-G-Au);
[0071] 6)多己胺接枝透明質酸修飾的SPR忍片(HADA-Au)表面蛋白吸附量檢測
[0072] 將步驟4)獲得的多己胺接枝透明質酸修飾的SPR忍片化ADA-Au)用柏油貼合到SPR 系統(tǒng)的棱鏡上。W抑為7.4的憐酸緩沖液為流動相，流速為25化/min。待基線平穩(wěn)后，往定量 環(huán)中注入25化L Img/mL的溶菌酶或牛血清白蛋白或(6-乳球蛋白或牛奶(30mg/mL)，經流動 相推動蛋白溶液到達忍片表面，由sra系統(tǒng)測定共振角實時變化曲線，2〇min后讀取sra共振 角變化值，并計算非特異性吸附量。如附圖3所示，在溶菌酶或牛血清白蛋白或0-乳球蛋白 中非特異性吸附量分別為2.27ng/cm2、21.4化g/cm2、16. OOng/cm2，遠低于各蛋白在SPR裸金 忍片表面的非特異性吸附量，見附表1。而對于來自牛奶中的蛋白，表面的非特異性吸附量 為175.75ng/cm2,相比裸金表面上牛奶的非特異性吸附量提高了近一倍。
[0073] 表1蛋白在SPR裸金忍片表面的非特異性吸附量
[0074]
[0075] 7)多己胺接枝透明質酸與谷脫甘膚修飾的Sra忍片化ADA-G-Au)表面蛋白吸附量 檢測
[0076] 將步驟5)獲得的多己胺接枝透明質酸與谷脫甘膚修飾的SPR忍片化ADA-G-Au)用 柏油貼合到sra系統(tǒng)的棱鏡上。W抑為7.4的憐酸緩沖液為流動相，流速為25化/min。待基線 平穩(wěn)后，往定量環(huán)中注入250化Img/mL的溶菌酶或牛血清白蛋白或0-乳球蛋白或牛奶 (30mg/mL)中，經流動相推動蛋白溶液到達忍片表面，由Sra系統(tǒng)測定共振角實時變化曲線， 20min后讀取Sra共振角變化值，并計算非特異性吸附量。如附圖3所示，表面蛋白的非特異 性吸附量分別為0.59ng/cm2、7.51ng/cm2、1.5化g/cm2,34.41ng/cm 2。相比于多己胺接枝透 明質酸修飾的SPR忍片(HADA-Au)抗蛋白能力提高一倍W上。
[0077] 實施例4
[007引具體操作方法如下：
[00巧]1)裸金忍片制備
[0080] 如附圖1所示，采用電子束蒸發(fā)鍛膜技術在服7玻璃基底（1)上涂覆一層2-3nm厚銘 層(2)和一層45-50nm厚金膜(3)，獲得了裸金忍片。
[0081] 2)裸金忍片預處理
[0082] 將步驟1)獲得的裸金忍片置于紫外臭氧清洗儀中，紫外燈光照30min后取出，用乙 醇、水依次清洗=次，氮氣吹干備用。
[0083] 3)多己胺接枝透明質酸的合成
[0084] 用十二水合憐酸氨二鋼和憐酸二氨鐘配制pH = 7.4的IOmM憐酸鹽緩沖液。取1.2g 透明質酸化A)溶于120mL上述憐酸鹽緩沖液中，用1. OM鹽酸將溶液的抑調至5.5，然后向溶 液中加入575.1mg(3mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，攬拌15min后加入 568.92mg( 3mmol)多己胺，用IM鹽酸將溶液的抑值維持在5.5且在室溫下攬拌反應2小時。將 反應后的溶液置于透析袋(MWCO: 8000-14000)中，且在抑=5.0的水溶液中透析2天，再在去 離子水中透析12h。將透析后的溶液凍干得到粉末狀的產物(HADA)，于-20°C下儲存?zhèn)溆谩?br>[0085] 4)裸金忍片表面多己胺接枝透明質酸修飾
[0086] 將30mg多己胺接枝透明質酸化ADA)溶于3mL的憐酸鹽緩沖溶液中，至最終濃度為 lOmg/mL。然后將2)獲得的忍片浸泡在上述溶液中，在水浴搖床中于37°C且l(K)rpm的搖速下 反應12h。反應后的忍片用無水乙醇、水依次清洗=次，氮氣吹干。即獲得基于多己胺接枝透 明質酸(如附圖1中的4所示)修飾的SPR忍片(HADA-Au)。
[0087] 5)透明質酸忍片表面谷脫甘膚修飾
[00則用S徑甲基氨基甲燒和鹽酸配制抑=8.5的SOmMS徑甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液。 用預先脫氣的上述=徑甲基氨基甲燒-鹽酸鹽緩沖液配制濃度為IOmg/血的谷脫甘膚溶液， 將4)獲得的透明質酸修飾的SH?忍片浸入上述溶液中，常溫下浸泡2地后取出。用乙醇和去 離子水依次清洗3次，并用氮氣吹干備用，即獲得如附圖1中的透明質酸與谷脫甘膚層(如附 圖1中的4，5所示)修飾的Sra忍片(HADA-G-Au);
[0089] 6)多己胺接枝透明質酸與谷脫甘膚修飾的sra忍片化ADA-G-Au)表面蛋白吸附量 檢測將步驟5)獲得的多己胺接枝透明質酸與谷脫甘膚修飾的Sra忍片化ADA-G-Au)用柏油 貼合到Sra系統(tǒng)的棱鏡上。W抑為7.4的憐酸緩沖液為流動相，流速為25化/min。待基線平穩(wěn) 后，往定量環(huán)中注入25化L Img/血的牛血清白蛋白，經流動相推動蛋白溶液到達忍片表面， 由SPR系統(tǒng)測定共振角實時變化曲線，20min后讀取Sra共振角變化值，并計算非特異性吸附 量為 15.9 化 g/cm2。
[0090] 實施例5
[0091 ]具體操作方法如下：
[0092] 1)二氧化娃忍片的制備
[0093] 如附圖2所示，采用電子束蒸發(fā)鍛膜技術在BK7玻璃基底（1)上涂覆一層2-3nm厚銘 層(2)和一層45-50皿厚金膜(3)，然后在金膜上涂覆一層5-lOnm厚的二氧化娃層(6)，獲得 了表面為二氧化娃的忍片。
[0094] 2)二氧化娃忍片預處理
[00M]將步驟1)獲得的二氧化娃忍片置于紫外臭氧清洗儀中，紫外燈光照30min后取出， 用乙醇、水依次清洗=次，氮氣吹干備用。
[0096] 3)多己胺接枝透明質酸的合成
[0097] 用十二水合憐酸氨二鋼和憐酸二氨鐘配制pH = 7.4的IOmM憐酸鹽緩沖液。取1.2g 透明質酸化A)溶于120mL上述憐酸鹽緩沖液中，用1.OM鹽酸將溶液的抑調至5.5,然后向溶 液中加入575. lmg(3mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，攬拌15min后加入 568.92mg( 3mmol)多己胺，用IM鹽酸將溶液的抑值維持在5.5且在室溫下攬拌反應2小時。將 反應后的溶液置于透析袋(MWC0:8000-14000)中，且在抑=5.0的水溶液中透析2天，再在去 離子水中透析12h。將透析后的溶液凍干得到粉末狀的產物(HADA)，于-20°C下儲存?zhèn)溆谩?br>[0098] 4)二氧化娃忍片表面多己胺接枝透明質酸修飾
[0099] 將45mg多己胺接枝透明質酸化ADA)溶于3mL的憐酸鹽緩沖溶液中，至最終濃度為 15mg/mL。然后將2)獲得的忍片浸泡在上述溶液中，在水浴搖床中于37°C且l(K)rpm的搖速下 反應12h。反應后的忍片用無水乙醇、水依次清洗=次，氮氣吹干。即獲得基于多己胺接枝透 明質酸(如附圖2中的4所示)修飾的Sra忍片(HADA- Si〇2)。
[0100] 5)透明質酸忍片表面谷脫甘膚修飾
[0101] 用S徑甲基氨基甲燒和鹽酸配制抑= 8.5的50mM立徑甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液。 用預先脫氣的上述=徑甲基氨基甲燒-鹽酸鹽緩沖液配制濃度為15mg/血的谷脫甘膚溶液， 將4)獲得的透明質酸修飾的SH?忍片浸入上述溶液中，常溫下浸泡12h后取出。用乙醇和去 離子水依次清洗3次，并用氮氣吹干備用，即獲得如附圖2中的透明質酸與谷脫甘膚層(如附 圖2中的4，5所示)修飾的Sra忍片(HADA-G-S i 〇2);
[0102] 6)多己胺接枝透明質酸與谷脫甘膚修飾的Sra忍片化ADA-G-Au)表面蛋白吸附量 檢測
[0103] 將步驟5)獲得的多己胺接枝透明質酸與谷脫甘膚修飾的SPR忍片化ADA-G-Au)用 柏油貼合到sra系統(tǒng)的棱鏡上。W抑為7.4的憐酸緩沖液為流動相，流速為25化/min。待基線 平穩(wěn)后，往定量環(huán)中注入25化L Img/mL的牛血清白蛋白，經流動相推動蛋白溶液到達忍片 表面，由SPR系統(tǒng)測定共振角實時變化曲線并計算蛋白吸附量。
[0104] 本發(fā)明公開和提出的一種表面等離子共振儀忍片及其制備方法，本領域技術人員 可通過借鑒本文內容，適當改變條件路線等環(huán)節(jié)實現，盡管本發(fā)明的方法和制備技術已通 過較佳實施例子進行了描述，相關技術人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內容】
、精神和范圍內對 本文所述的方法和技術路線進行改動或重新組合，來實現最終的制備技術。特別需要指出 的是，所有相類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括 在本發(fā)明精神、范圍和內容中。
【主權項】
1. 一種表面等離子共振儀芯片;其特征是基于多巴胺接枝透明質酸和谷胱甘肽修飾的 表面等離子共振儀芯片。2. 如權利要求1所述的芯片；其特征是在玻璃片基底（1)上設置有涂層2-3nm厚的鉻層 (2)，在鉻層上設置有45-50nm厚的金膜層(3);在金膜(3)上修飾一層多巴胺接枝透明質酸 層(4)，在多巴胺接枝透明質酸層(4)上修飾一層谷胱甘肽層(5)。3. 如權利要求2所述的芯片，其特征在金膜層(3)和多巴胺接枝透明質酸層(4)之間設 置一層5-1 Onm厚的二氧化娃層(6) 〇4. 權利要求1的表面等離子共振儀芯片的制備方法;其特征是： 1) 用pH = 7.4的磷酸鹽緩沖液配制濃度為5-15mg/mL的多巴胺接枝透明質酸溶液;將清 洗干凈的SPR芯片浸入上述多巴胺接枝透明質酸溶液中，常溫下浸泡2-12h后取出，用乙醇 和去離子清洗使芯片表面清洗潔凈，并用氮氣吹干備用； 2) 用pH = 8.5的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽緩沖液配制濃度為5-15mg/mL的谷胱甘肽溶 液;將修飾有透明質酸的SPR芯片浸入上述谷胱甘肽溶液中，常溫下浸泡12-24h后取出；用 乙醇和去離子清洗使芯片表面清洗潔凈，并用氮氣吹干。5. 如權利要求4所述的方法，其特征是磷酸鹽緩沖液包括IOmM磷酸鹽、138mM氯化鈉和 2.7mM氯化鉀。6. 如權利要求4所述的方法，其特征是三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽緩沖液為50mM三羥甲 基氨基甲烷。7. 如權利要求4所述的方法，其特征是三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽緩沖液進行預先脫氣 處理。
【文檔編號】G01N21/552GK105954237SQ201610268204
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】蘇榮欣, 黃仁亮, 葉慧君, 齊崴
【申請人】天津大學