基于細(xì)胞活性傳感器的貝類腹瀉性毒素的檢測(cè)裝置及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于細(xì)胞活性傳感器的貝類腹瀉性毒素的檢測(cè)裝置及方法，該裝置包括：電源適配器、廣角鏡頭、智能移動(dòng)設(shè)備、暗室、底座、細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)板裝載臺(tái)、冷光片、單片機(jī)、加熱器、溫度傳感器、CO2傳感器、電磁閥、橡膠氣管和CO2氣瓶。該方法首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；接種細(xì)胞，并加入混合了細(xì)胞活性試劑盒和毒素的新鮮培養(yǎng)基；放入裝置進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)，計(jì)算歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI；通過(guò)遍歷及最小二乘法擬合出檢測(cè)貝類腹瀉性毒性的最佳標(biāo)定曲線；通過(guò)分析待測(cè)樣品溶液的NCVI曲線，計(jì)算出待測(cè)樣品的貝類腹瀉性毒素。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了毒素對(duì)細(xì)胞活性的作用變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有高通量、同時(shí)同步、長(zhǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)、操作簡(jiǎn)便和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
基于細(xì)胞活性傳感器的貝類腹瀉性毒素的檢測(cè)裝置及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種高通量同時(shí)檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的裝置及技術(shù)，尤其涉及基于細(xì)胞活性傳感器的貝類腹瀉性毒素的高通量同時(shí)同步檢測(cè)裝置及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]貝類腹瀉性毒素是貝類從浮游藻類中聚集的有害有機(jī)物質(zhì)存于體內(nèi)蓄積而成，是一類毒性很強(qiáng)的非蛋白毒素，食用后能使人中毒，甚至死亡。目前國(guó)內(nèi)貝類腹瀉性毒素檢測(cè)方法通常使用方法是小鼠生物檢測(cè)法，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法、Elisa試劑盒檢測(cè)方法和細(xì)胞傳感器方法。小鼠生物檢測(cè)法個(gè)體差異性大導(dǎo)致毒性難以估計(jì)，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法操作繁瑣并且設(shè)備龐大，對(duì)實(shí)驗(yàn)員具有高要去。Elisa試劑盒檢測(cè)方法在分子水平上，能夠特異性地檢測(cè)貝類腹瀉性毒素，但無(wú)法直觀地反映對(duì)生物體的影響。細(xì)胞傳感器在細(xì)胞水平上反映了生物體對(duì)毒素反映的影響。目前所報(bào)道的細(xì)胞阻抗傳感器和細(xì)胞樂(lè)普波傳感器在貝類腹瀉性毒素的檢測(cè)上具有靈敏度高、檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。但還存在系統(tǒng)復(fù)雜度高、細(xì)胞培養(yǎng)方案不普及和成本高等不足。因此，海洋水產(chǎn)品毒素檢測(cè)領(lǐng)域迫切需要一種能夠高通量、同時(shí)同步、系統(tǒng)便攜、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低廉并且能夠反映毒素對(duì)生物體反映的貝類腹瀉性毒素檢測(cè)裝置及方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于細(xì)胞活性傳感器的貝類腹瀉性毒素的高通量同時(shí)同步檢測(cè)裝置及方法。
[0004]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種基于細(xì)胞活性傳感器的貝類腹瀉性毒素的高通量檢測(cè)裝置，該裝置包括:電源適配器、廣角鏡頭、智能移動(dòng)設(shè)備、暗室、底座、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)、冷光片、單片機(jī)、加熱器、溫度傳感器、0)2傳感器、電磁閥、橡膠氣管和CO2氣瓶;其中，暗室與底座通過(guò)隔板分離;單片機(jī)和電源適配器固定在底座內(nèi)；暗室中具有可抽拉的96孔檢測(cè)板裝載臺(tái)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板通過(guò)卡槽固定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)頂部，冷光片通過(guò)卡槽固定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)底部；電源適配器、加熱器、溫度傳感器、C02傳感器、電磁閥和冷光片均與單片機(jī)連接，由單片機(jī)控制冷光片發(fā)光、暗室內(nèi)的溫度和CO2濃度；電磁閥通過(guò)橡膠氣管和CO2氣瓶連接，CO2氣瓶向暗室提供CO2;在暗室的頂部開(kāi)有圓孔，廣角鏡頭固定在暗室頂部的圓孔正下方；智能移動(dòng)設(shè)備通過(guò)卡槽固定在暗室頂部外側(cè)，且其攝像頭可通過(guò)暗室的圓孔透過(guò)廣角鏡頭，對(duì)暗室內(nèi)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行圖像采集。
[0005]—種基于細(xì)胞活性傳感器的貝類腹瀉性毒素的高通量同時(shí)同步檢測(cè)的方法，該方法包括以下步驟:
[0006](I)樣品前處理，制備貝類腹瀉性毒素待測(cè)樣品溶液，包括以下子步驟:
[0007](1.1)取貝類生物，除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質(zhì)器均質(zhì)；
[0008](1.2)稱取Ig均質(zhì)后的樣品加入6ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，得到混合溶液；
[0009](1.3)在4°C下，將步驟(1.2)得到的混合溶液以3500r/min離心10分鐘，收集上清液；
[0010](1.4)在步驟(1.3)殘留的貝肉組織中加2ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，在4°C下，以3500r/min離心10分鐘，收集上清液，加入到步驟(1.3)收集的上清液中；
[0011](1.5)重復(fù)步驟(1.4)，待收集的上清液達(dá)到1ml時(shí)，用0.45um的濾膜過(guò)濾，得到濾液；
[0012](1.6)取20ul濾液，用樣品稀釋緩沖液PBS稀釋到lml，然后取10ul作為待測(cè)樣品溶液；
[0013](2)細(xì)胞培養(yǎng):選用肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行培養(yǎng)。HepG2的培養(yǎng)基為含有體積分?jǐn)?shù)為10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基中均添加了體積分?jǐn)?shù)為I %的青霉素-鏈霉素溶液。所有的細(xì)胞于37°C，體積分?jǐn)?shù)為5%C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時(shí)，使用含體積分?jǐn)?shù)為0.02%的胰酶將其消化下來(lái)，將HepG2細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔內(nèi)。
[0014](3)加入顯色劑:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔內(nèi)接種固定密度的細(xì)胞。培養(yǎng)24小時(shí)后，選用細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒作為顯色劑，按照說(shuō)明書(shū)，將其與不同濃度的貝類腹瀉性毒素，并進(jìn)一步與新鮮培養(yǎng)基混合。然后，將混合了試劑盒溶液的新鮮培養(yǎng)基加入培養(yǎng)孔中；
[0015](4)長(zhǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞活性對(duì)貝類腹瀉性毒素的響應(yīng):將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板固定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)上。單片機(jī)控制冷光片發(fā)光，并根據(jù)溫度傳感器反饋的溫度信息采用PID控制算法控制加熱器對(duì)暗室的室內(nèi)空間加熱，實(shí)現(xiàn)37°C環(huán)境溫度的恒溫控制，同時(shí)根據(jù)CO2傳感器的反饋，控制電磁閥，實(shí)現(xiàn)暗室的室內(nèi)體積分?jǐn)?shù)為5%C02的氣體環(huán)境。
[0016](5)確定檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的最佳標(biāo)定曲線:通過(guò)智能移動(dòng)設(shè)備連續(xù)采集96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的圖像;每一次采集到圖像后，對(duì)采集的圖像進(jìn)行處理，然后再進(jìn)行下一次采集。其中，對(duì)圖像的處理過(guò)程包括以下子步驟:
[0017](5.1)切割出96孔檢測(cè)板上的微孔所對(duì)應(yīng)的子圖像，子圖像的孔內(nèi)像素范圍為10X10;
[0018](5.2)將子圖像轉(zhuǎn)換至顏色孔間RGB，提取子圖像中每個(gè)像素的B分量，并計(jì)算子圖像像素B分量平均值；
[0019](5.3)計(jì)算細(xì)胞活性指數(shù)CVI，根據(jù)公式CVI = 255-C，其中，C為步驟(5.2)中所計(jì)算的子圖像像素B分量平均值；
[0020](5.4)計(jì)算歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI，根據(jù)公式NCVI = CVIt/CV1,其中，CVIt為各時(shí)間點(diǎn)所計(jì)算出的CVI值，CV1為O時(shí)間點(diǎn)所計(jì)算出的CVI值。
[0021]基于上述處理過(guò)程，每次采集得到的圖像對(duì)應(yīng)單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性傳感器響應(yīng)不同毒素濃度的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI連接，繪出細(xì)胞活性指數(shù)NCVI對(duì)時(shí)間的連續(xù)圖譜。然后，遍歷所有時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)最小二乘法擬合曲線算法，擬合出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI關(guān)于已知密度的細(xì)胞濃度以10為底的對(duì)數(shù)的標(biāo)定曲線。從所有的擬合標(biāo)定曲線中，選出擬合優(yōu)度和斜率最大的標(biāo)定曲線，即檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的最佳標(biāo)定曲線；
[0022](6)檢測(cè)未知濃度的貝類腹瀉性毒素的濃度:將步驟(I)得到的待測(cè)樣品溶液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，重復(fù)步驟(3)-步驟(5.4)，得到該待測(cè)樣品溶液的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI，然后根據(jù)步驟(5)確定的最佳標(biāo)定曲線的時(shí)間點(diǎn)，獲得待測(cè)樣品溶液在該時(shí)間點(diǎn)的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI，帶入步驟(5)得到的檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的最佳標(biāo)定曲線，計(jì)算出待測(cè)樣品溶液的貝類毒素含量，根據(jù)步驟(I)的稀釋倍數(shù)，即可得到Iml待測(cè)樣品溶液的貝類腹瀉性毒素。
[0023]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了毒素對(duì)細(xì)胞活性的作用變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有高通量、同時(shí)同步、長(zhǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)、操作簡(jiǎn)便和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明較現(xiàn)有的貝類腹瀉性毒素檢測(cè)方法上，具有操作步驟簡(jiǎn)單，成本低廉，高通量同時(shí)同步，長(zhǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)貝類腹瀉性毒素等優(yōu)點(diǎn)，并且在細(xì)胞培養(yǎng)方法上具有普及性。根據(jù)以上優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的裝置及方法可成為海洋毒素檢測(cè)分析領(lǐng)域的新工具，并廣泛應(yīng)用于該領(lǐng)域。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1是本發(fā)明貝類腹瀉性毒素的高通量同時(shí)同步檢測(cè)裝置整體結(jié)構(gòu)圖；
[0025]圖2是本發(fā)明所使用的細(xì)胞活性傳感器的細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)構(gòu)圖；
[0026]圖3是本發(fā)明細(xì)胞活性傳感器監(jiān)測(cè)貝類腹瀉性毒素影響的算法流程圖；
[0027]圖4是本發(fā)明監(jiān)測(cè)不同OA濃度的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI譜線圖；
[0028]圖5是本發(fā)明確定的檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的最佳標(biāo)定曲線的結(jié)果圖；
[0029]圖中，電源適配器1、廣角鏡頭2、智能移動(dòng)設(shè)備3、暗室4、底座5、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板6、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)7、冷光片8、單片機(jī)9、加熱器10、溫度傳感器11、C02傳感器12、電磁閥13、橡膠氣管14和CO2氣瓶15。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但并不是限制本發(fā)明。
[0031]如圖1、2所示，本發(fā)明基于細(xì)胞活性傳感器的貝類腹瀉性毒素的高通量檢測(cè)裝置，包括:電源適配器1、廣角鏡頭2、智能移動(dòng)設(shè)備3、暗室4、底座5、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板6、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)7、冷光片8、單片機(jī)9、加熱器1、溫度傳感器11、CO2傳感器12、電磁閥13、橡膠氣管14和CO2氣瓶15;其中，暗室4與底座5通過(guò)隔板分離;單片機(jī)9和電源適配器I固定在底座5內(nèi)；暗室4中具有可抽拉的96孔檢測(cè)板裝載臺(tái)7，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板6通過(guò)卡槽固定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)7頂部，冷光片8通過(guò)卡槽固定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)7底部；電源適配器1、加熱器10、溫度傳感器11、C02傳感器12、電磁閥13和冷光片8均與單片機(jī)9連接，由單片機(jī)9控制冷光片8發(fā)光、暗室4內(nèi)的溫度和CO2濃度；電磁閥13通過(guò)橡膠氣管14和CO2氣瓶15連接，CO2氣瓶15向暗室4提供CO2;在暗室4的頂部開(kāi)有圓孔，廣角鏡頭2固定在暗室4頂部的圓孔正下方;智能移動(dòng)設(shè)備3通過(guò)卡槽固定在暗室4頂部外側(cè)，且其攝像頭可通過(guò)暗室4的圓孔透過(guò)廣角鏡頭2，對(duì)暗室4內(nèi)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板6進(jìn)行圖像采集。
[0032]—種應(yīng)用上述裝置檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的方法，包括以下步驟:
[0033](I)樣品前處理，制備貝類腹瀉性毒素待測(cè)樣品溶液，包括以下子步驟:
[0034](1.1)取貝類生物，除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質(zhì)器均質(zhì)；
[0035](1.2)稱取Ig均質(zhì)后的樣品加入6ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，得到混合溶液；
[0036](1.3)在4 °C下，將步驟(1.2)得到的混合溶液以3500r/min離心1分鐘，收集上清液；
[0037](1.4)在步驟(1.3)殘留的貝肉組織中加2ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，在4V下，以3500r/min離心10分鐘，收集上清液，加入到步驟(1.3)收集的上清液中；
[0038](1.5)重復(fù)步驟(1.4)，待收集的上清液達(dá)到1ml時(shí)，用0.45um的濾膜過(guò)濾，得到濾液；
[0039](1.6)取20ul濾液，用樣品稀釋緩沖液PBS稀釋到lml，然后取10ul作為待測(cè)樣品溶液；
[0040](2)細(xì)胞培養(yǎng):選用肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行培養(yǎng)。HepG2的培養(yǎng)基為含有體積分?jǐn)?shù)為10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基中均添加了體積分?jǐn)?shù)為I %的青霉素-鏈霉素溶液。所有的細(xì)胞于37°C，體積分?jǐn)?shù)為5%C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時(shí)，使用含體積分?jǐn)?shù)為0.02 %的胰酶將其消化下來(lái)，將HepG2細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板6的培養(yǎng)孔內(nèi)。
[0041 ] (3)加入顯色劑:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板6的培養(yǎng)孔內(nèi)接種5000個(gè)/孔的細(xì)胞。培養(yǎng)24小時(shí)后，選用細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒CCK-8作為顯色劑，按照說(shuō)明書(shū)，將其與不同濃度的貝類腹瀉性毒素，這里選用了濃度為10、25、50、100、200、400和800ppb等的大田軟海綿酸OA進(jìn)行混合，并進(jìn)一步與新鮮培養(yǎng)基混合，配制成含有體積分?jǐn)?shù)為10%CCK-8試劑和10%大田軟海綿酸OA毒素的新鮮培養(yǎng)基。然后，將混合了試劑盒溶液的新鮮培養(yǎng)基加入培養(yǎng)孔中；
[0042](4)長(zhǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞活性對(duì)貝類腹瀉性毒素的響應(yīng):將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板6固定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)7上。單片機(jī)9控制冷光片8發(fā)光，并根據(jù)溫度傳感器11反饋的溫度信息采用PID控制算法控制加熱器10對(duì)暗室4的室內(nèi)空間加熱，實(shí)現(xiàn)37°C環(huán)境溫度的恒溫控制，同時(shí)根據(jù)CO2傳感器12的反饋，控制電磁閥13，實(shí)現(xiàn)暗室4的室內(nèi)體積分?jǐn)?shù)為5%C02的氣體環(huán)境。
[0043](5)確定檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的最佳標(biāo)定曲線:通過(guò)智能移動(dòng)設(shè)備3連續(xù)采集96孔細(xì)胞培養(yǎng)板6的圖像。每一次采集到圖像后，對(duì)采集的圖像進(jìn)行處理，然后再進(jìn)行下一次采集。其中，對(duì)圖像的處理過(guò)程包括以下子步驟:
[0044](5.1)切割出96孔檢測(cè)板上的微孔所對(duì)應(yīng)的子圖像，子圖像的孔內(nèi)像素范圍為10X10;
[0045](5.2)將子圖像轉(zhuǎn)換至顏色孔間RGB，提取子圖像中每個(gè)像素的B分量，并計(jì)算子圖像像素B分量平均值；
[0046](5.3)計(jì)算細(xì)胞活性指數(shù)CVI，根據(jù)公式CVI = 255-C，其中，C為步驟(5.2)中所計(jì)算的子圖像像素B分量平均值；
[0047](5.4)計(jì)算歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI，根據(jù)公式NCVI = CVIt/CV1,其中，CVIt為各時(shí)間點(diǎn)所計(jì)算出的CVI值，CV1為O時(shí)間點(diǎn)所計(jì)算出的CVI值。
[0048]基于上述處理過(guò)程，每次采集得到的圖像對(duì)應(yīng)單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性傳感器響應(yīng)不同毒素濃度的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI連接，繪出細(xì)胞活性指數(shù)NCVI對(duì)時(shí)間的連續(xù)圖譜。然后，遍歷所有時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)最小二乘法擬合曲線算法，擬合出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI關(guān)于已知密度的細(xì)胞濃度以10為底的對(duì)數(shù)的標(biāo)定曲線。從所有的擬合標(biāo)定曲線中，選出擬合優(yōu)度和斜率最大的標(biāo)定曲線，即檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的最佳標(biāo)定曲線；
[0049](6)檢測(cè)未知濃度的貝類腹瀉性毒素的濃度:將步驟(I)得到的待測(cè)樣品溶液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，重復(fù)步驟(3)-步驟(5.4)，得到該待測(cè)樣品溶液的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI，然后根據(jù)步驟(5)確定的最佳標(biāo)定曲線的時(shí)間點(diǎn)，獲得待測(cè)樣品溶液在該時(shí)間點(diǎn)的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI，帶入步驟(5)得到的檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的最佳標(biāo)定曲線，計(jì)算出待測(cè)樣品溶液的貝類毒素含量，根據(jù)步驟(I)的稀釋倍數(shù)，即可得到Iml待測(cè)樣品溶液的貝類腹瀉性毒素。
[0050]圖4為本發(fā)明監(jiān)測(cè)不同OA濃度的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI譜線圖，從圖中可以看出，細(xì)胞活性傳感器對(duì)不同濃度毒素的響應(yīng)隨時(shí)間的變化情況，證明了本發(fā)明方法能夠長(zhǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)毒素對(duì)細(xì)胞活性的作用。圖5為本發(fā)明確定的檢測(cè)OA的最佳標(biāo)定曲線的結(jié)果圖，包含擬合優(yōu)度最大和斜率最大的曲線。由于斜率最大曲線擬合優(yōu)度過(guò)低，因此，選擇擬合優(yōu)度最大的時(shí)間點(diǎn)為最佳時(shí)間點(diǎn)，該時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)定曲線為最佳標(biāo)定曲線。從圖中可以看出，本發(fā)明方法的得出的最佳標(biāo)定曲線公式為NCVI = -1.87751g[C]+7.1240，NCVI為細(xì)胞活性指數(shù)，C為待測(cè)樣品的OA含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)待測(cè)樣品貝類腹瀉性毒素。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于細(xì)胞活性傳感器的貝類腹瀉性毒素的高通量檢測(cè)裝置，其特征在于，該裝置包括:電源適配器、廣角鏡頭、智能移動(dòng)設(shè)備、暗室、底座、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)、冷光片、單片機(jī)、加熱器、溫度傳感器、CO2傳感器、電磁閥、橡膠氣管和CO2氣瓶;其中，暗室與底座通過(guò)隔板分離;單片機(jī)和電源適配器固定在底座內(nèi)；暗室中具有可抽拉的96孔檢測(cè)板裝載臺(tái)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板通過(guò)卡槽固定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)頂部，冷光片通過(guò)卡槽固定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)底部；電源適配器、加熱器、溫度傳感器、CO2傳感器、電磁閥和冷光片均與單片機(jī)連接，由單片機(jī)控制冷光片發(fā)光、暗室內(nèi)的溫度和CO2濃度；電磁閥通過(guò)橡膠氣管和CO2氣瓶連接，CO2氣瓶向暗室提供CO2;在暗室的頂部開(kāi)有圓孔，廣角鏡頭固定在暗室頂部的圓孔正下方；智能移動(dòng)設(shè)備通過(guò)卡槽固定在暗室頂部外側(cè)，且其攝像頭可通過(guò)暗室的圓孔透過(guò)廣角鏡頭，對(duì)暗室內(nèi)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行圖像采集。2.—種基于細(xì)胞活性傳感器的貝類腹瀉性毒素的高通量同時(shí)同步檢測(cè)的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)樣品前處理，制備貝類腹瀉性毒素待測(cè)樣品溶液，包括以下子步驟: (1.1)取貝類生物，除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質(zhì)器均質(zhì)； (I.2)稱取Ig均質(zhì)后的樣品加入6ml體積濃度為80 %的甲醇水溶液，得到混合溶液； (1.3)在4°C下，將步驟(1.2)得到的混合溶液以3500r/min離心10分鐘，收集上清液； (1.4)在步驟(1.3)殘留的貝肉組織中加2ml體積濃度為80%的甲醇水溶液，在4°C下，以3500r/min離心10分鐘，收集上清液，加入到步驟(1.3)收集的上清液中； (1.5)重復(fù)步驟(1.4)，待收集的上清液達(dá)到1ml時(shí)，用0.45um的濾膜過(guò)濾，得到濾液； (1.6)取20ul濾液，用樣品稀釋緩沖液PBS稀釋到lml，然后取10ul作為待測(cè)樣品溶液； (2)細(xì)胞培養(yǎng):選用肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行培養(yǎng)。HepG2的培養(yǎng)基為含有體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基中均添加了體積分?jǐn)?shù)為I %的青霉素-鏈霉素溶液。所有的細(xì)胞于37°C，體積分?jǐn)?shù)為5 %CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80-90 %時(shí)，使用含體積分?jǐn)?shù)為0.02 %的胰酶將其消化下來(lái)，將HepG2細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔內(nèi)。 (3)加入顯色劑:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔內(nèi)接種固定密度的細(xì)胞。培養(yǎng)24小時(shí)后，選用細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒作為顯色劑，按照說(shuō)明書(shū)，將其與不同濃度的貝類腹瀉性毒素，并進(jìn)一步與新鮮培養(yǎng)基混合。然后，將混合了試劑盒溶液的新鮮培養(yǎng)基加入培養(yǎng)孔中； (4)長(zhǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞活性對(duì)貝類腹瀉性毒素的響應(yīng):將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板固定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板裝載臺(tái)上。單片機(jī)控制冷光片發(fā)光，并根據(jù)溫度傳感器反饋的溫度信息采用PID控制算法控制加熱器對(duì)暗室的室內(nèi)空間加熱，實(shí)現(xiàn)37°C環(huán)境溫度的恒溫控制，同時(shí)根據(jù)CO2傳感器的反饋，控制電磁閥，實(shí)現(xiàn)暗室的室內(nèi)體積分?jǐn)?shù)為5%C02的氣體環(huán)境。 (5)確定檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的最佳標(biāo)定曲線:通過(guò)智能移動(dòng)設(shè)備連續(xù)采集96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的圖像;每一次采集到圖像后，對(duì)采集的圖像進(jìn)行處理，然后再進(jìn)行下一次采集。其中，對(duì)圖像的處理過(guò)程包括以下子步驟: (5.1)切割出96孔檢測(cè)板上的微孔所對(duì)應(yīng)的子圖像，子圖像的孔內(nèi)像素范圍為1X10; (5.2)將子圖像轉(zhuǎn)換至顏色孔間RGB，提取子圖像中每個(gè)像素的B分量，并計(jì)算子圖像像素B分量平均值； (5.3)計(jì)算細(xì)胞活性指數(shù)CVI，根據(jù)公式CVI= 255-C，其中，C為步驟(5.2)中所計(jì)算的子圖像像素B分量平均值； (5.4)計(jì)算歸一化細(xì)胞活性指數(shù)1^1，根據(jù)公式1^1= 0^/(^1()，其中，0^為各時(shí)間點(diǎn)所計(jì)算出的CVI值，CV1為O時(shí)間點(diǎn)所計(jì)算出的CVI值。 基于上述處理過(guò)程，每次采集得到的圖像對(duì)應(yīng)單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性傳感器響應(yīng)不同毒素濃度的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI連接，繪出細(xì)胞活性指數(shù)NCVI對(duì)時(shí)間的連續(xù)圖譜。然后，遍歷所有時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)最小二乘法擬合曲線算法，擬合出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI關(guān)于已知密度的細(xì)胞濃度以10為底的對(duì)數(shù)的標(biāo)定曲線。從所有的擬合標(biāo)定曲線中，選出擬合優(yōu)度和斜率最大的標(biāo)定曲線，即檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的最佳標(biāo)定曲線； (6)檢測(cè)未知濃度的貝類腹瀉性毒素的濃度:將步驟(I)得到的待測(cè)樣品溶液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，重復(fù)步驟(3)-步驟(5.4)，得到該待測(cè)樣品溶液的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI，然后根據(jù)步驟(5)確定的最佳標(biāo)定曲線的時(shí)間點(diǎn)，獲得待測(cè)樣品溶液在該時(shí)間點(diǎn)的歸一化細(xì)胞活性指數(shù)NCVI，帶入步驟(5)得到的檢測(cè)貝類腹瀉性毒素的最佳標(biāo)定曲線，計(jì)算出待測(cè)樣品溶液的貝類毒素含量，根據(jù)步驟(I)的稀釋倍數(shù)，即可得到Iml待測(cè)樣品溶液的貝類腹瀉性毒素。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK105954505SQ201610288829
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月4日
【發(fā)明人】王平, 蘇凱麒, 萬(wàn)梓健, 潘宇祥, 鐘隆潔, 黎洪波
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)