一種層粘連蛋白（ln）測試試劑盒及其測試方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種層粘連蛋白(LN)的測試試劑盒，該試劑盒由磁分離試劑，試劑R1，試劑R2，標準品、質(zhì)控品，校準品，清洗濃縮液、稀釋液及發(fā)光底物組成，本發(fā)明還公開了該試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒將化學發(fā)光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體系，與現(xiàn)有酶聯(lián)免疫的技術相比，本發(fā)明具有更高的特異性，靈敏度，獲得檢測結果的時間短，操作方式簡便，檢測結果準確可靠，大大降低了產(chǎn)品成本。
【專利說明】
一種層粘連蛋白（LN)測試試劑盒及其測試方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及測定血清中層粘連蛋白含量的試劑盒及其測 試方法。
【背景技術】
[0002] 層粘連蛋白（laminin,LN)主要存在于基膜(basal lamina)結構中，是基膜所特有 的非膠原糖蛋白，相對分子質(zhì)量為820kDa，含13-15%的糖，有三個亞單位，即重鏈(α鏈， 400kDa)和m(215kDa)、02(2O5kDa)兩條輕鏈。結構上呈現(xiàn)不對稱的十字形，由一條長臂和 三條相似的短臂構成。這四個臂均有棒狀節(jié)段和球狀的末端域。m和β2短臂上有兩個球形 結構域，α鏈上的短臂有三個球形結構域，其中有一個結構域同IV型膠原結合，第二個結構 域同肝素結合，還有同細胞表面受體結合的結構域。正是這些獨立的結合位點使LN作為一 個橋梁分子，介導細胞同基膜結合。所以LN的主要功能就是作為基膜的主要結構成分對基 膜的組裝起關鍵作用，在細胞表面形成網(wǎng)絡結構并將細胞固定在基膜上。
[0003] LN還有許多其他的作用，如在細胞發(fā)育過程中刺激細胞粘著、細胞運動。LN還能夠 刺激胚胎中神經(jīng)軸的生長，并促進成年動物的神經(jīng)損傷后重生長和再生。如同纖粘連蛋白， 細胞外的LN能夠影響細胞的生長、迀移和分化。LN在原生殖細胞的迀移中起關鍵作用。肝纖 維化時人層粘連蛋白與IV型膠原結合形成內(nèi)皮基膜，導致纖維化。血清人層粘連蛋白測定 是觀察慢性肝炎患者肝組織纖維化程度的一項重要指標之一
[0004] 中國專利CN200710073309公開了一種層粘連蛋白測試試劑盒及其測試方法，試劑 盒包含的試劑有:分離試劑、發(fā)光標記物、熒光素標記物以及采用納米免疫磁性微珠作為分 離試劑、采用抗LN單克隆抗體標記異魯米諾衍生物作為發(fā)光標記物的測試方法，該LN試劑 盒及其測試方法具有較高的靈敏度和特異性，但其出檢測結果的時間較長，且采用的試劑 量較多，無形中增加了試劑盒的試劑成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強，靈敏度高，獲得檢測結果的時間 短，操作方式簡便，檢測結果準備可靠的層粘連蛋白（LN)的測試試劑盒及其測試方法。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
[0007] 一種組合物，其中包括:牛γ球蛋白M、TRIS、NaC1和防腐劑。
[0008] 本提供的組合物中各組分的濃度為：牛γ球蛋白Μ〇. 5~lyg/mL; TRIS1~2g/L; NaCl 4~5g/L;防腐劑0.1 ~0.5mL/L。
[0009] -些實施例中，本提供的組合物中各組分的濃度為：牛γ球蛋白IgG 0.9yg/mL; TRIS 1.56g/L;NaCl 4.23g/L;防腐劑0.2mL/L。
[0010] 一些實施例中，防腐劑為Proclin300。
[0011] -些實施例中，pH值為7·4±0·05。
[0012] 本發(fā)明提供的組合物在制備層黏連蛋白檢測產(chǎn)品中的應用。
[0013] 本發(fā)明提供的組合物，用于LN的磁微?；瘜W發(fā)光法，能夠使得反應過程更加穩(wěn)定 可靠，具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達到了較佳的性能參數(shù)。試驗表明，以本發(fā)明提 供的組合物對LN進行檢測，最低檢測限可達0.03ng/mL，靈敏度高。批內(nèi)變異CV% 5 10.0% ; 批間變異CV%蘭15.0 % ;精密性良好。標準曲線，線性系數(shù):r彡0.9900 ;線性范圍：0.03-100ng/ml。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種層粘連蛋白檢測試劑盒，包括:磁分離試劑、試劑Ri、試劑R2、 清洗濃縮液和發(fā)光底物，其中：
[0015] 所述磁分離試劑中含有標記有小鼠抗人LN的單克隆抗體的納米磁性微球；
[0016] 所述試劑辦中含有堿性磷酸酶標記的LN抗體；
[0017]所述試劑辦中含有牛γ球蛋白IgG;
[0018] 所述清洗濃縮液中含有Tween-20;
[0019] 所述稀釋液中含有BSA;
[0020] 所述發(fā)光底物中含有IUMIPH0S530。
[0021 ]在實施例中，標記有小鼠抗人IV-C0L的單克隆抗體的納米磁性微球的濃度為132 ~167yg/mL〇
[0022] 在一些實施例中，標記有小鼠抗人IV-C0L的單克隆抗體的納米磁性微球的濃度為 132yg/mL〇
[0023] 在此實施例中，磁分離試劑中包括:標記有小鼠抗人IV-C0L的單克隆抗體的納米 磁性微球l32yg/mL;BSA V 3g/L;TRIS 4.58g/L;NaCl 6.8lg/L;Tween2〇 0.%g/L; Proclin300 0.2mL/L〇
[0024] 在另一實施例中，標記有小鼠抗人IV-COL的單克隆抗體的納米磁性微球的濃度為 167yg/mL〇
[0025] 在此實施例中，磁分離試劑中包括:標記有小鼠抗人IV-C0L的單克隆抗體的納米 磁性微球l67yg/mL;BSA V 3g/L;TRIS 4.58g/L;NaCl 6.8lg/L;Tween2〇 0.%g/L; Proclin300 0.2mL/L〇
[0026] 磁分離試劑的pH值為8 · 0 ± 0 · 05。
[0027] 磁分離試劑中標記有小鼠抗人LN的單克隆抗體的納米磁性微球的制備方法為：
[0028] (1)將DSS(辛二酸二琥珀酰亞胺）溶于DMS0中至濃度為20mg/mL，記為溶液1;將LN 抗體溶于pH值為9.5的0. lmol/L PB緩沖液中至濃度為2mg/ml，記為溶液2;
[0029] (2)溶液1與溶液2混合，置室溫90min，記為溶液3;
[0030] (3)將溶液3加入到Centricon-10濃縮管中，3000g離心30min至體積為0· 5ml，記為 抗體溶液；
[0031] (4)取0.5mL磁珠經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；以pH值為9.5的0 . lmol/L 1?緩沖 液清洗3次；
[0032] (5)抗體溶液與磁珠混合，室溫反應4小時，保持混勻狀態(tài)；
[0033] (6)加入lmol/L的Tris溶液37°C孵育15分鐘，獲得標記的磁珠;其中Tris的加樣量 為 lmg 抗體加 0· 15mlTris;
[0034] (7)以pH 7.2 0· lmol/L PB清洗標記的磁珠3次，獲得標記有小鼠抗人LN的單克隆 抗體的納米磁性微球。
[0035]本發(fā)明采用的LN抗體為LN的單克隆抗體，本發(fā)明對其來源不做限定，其可為自制 也可于市場購得，其實施皆在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明采用的LN單克隆抗體來自北 京菲斯特生物科技有限公司。
[0036]本發(fā)明采用的磁珠為四氧化三鐵微球，其直徑為0.01~5. Ομπι。
[0037] 在本發(fā)明中，試劑R1中堿性磷酸酶標記的IV-C0L抗體的濃度為0.5~2yg/mL。
[0038] 在實施例中，堿性磷酸酶標記的IV-C0L抗體的濃度為0.6~lyg/mL。
[0039] 在一些實施例中，堿性磷酸酶標記的IV-C0L抗體的濃度為0.6yg/mL。
[0040] 在此實施例中，試劑R1中包括：堿性磷酸酶標記的IV-C0L抗體0.6yg/mL;BSA V 3g/L；TRIS 6.06g/L；NaCl 13.0g/L；Proclin300 0.2mL/L；MgCl2 0.05g/L；Zncl2 0.05g/L〇 [0041 ]在另一實施例中，堿性磷酸酶標記的IV-COL抗體的濃度為lyg/mL。
[0042] 在此實施例中，試劑R1中包括:堿性磷酸酶標記的IV-C0L抗體lyg/mL;BSA V 3g/ L；TRIS 6.06g/L；NaCl 13.0g/L；Proclin300 0.2mL/L；MgCl2 0.05g/L；Zncl2 0.05g/L〇
[0043] 試劑 R1的 pH 值為7·4±0·05。
[0044] 堿性磷酸酶標記的LN抗體的制備方法為：
[0045] (1)將ALP溶解于生理鹽水，至濃度為2mg/mL，加入到Centricon-ΙΟ濃縮管中， 3000rpm離心大約20分鐘，獲得ALP溶液；
[0046] (2)每毫升ALP溶液加入0.2ml的0.1M NaI〇4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘后，裝入 透析袋中，用ImM pH值為4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，獲得醛化ALP;
[0047] (3)每毫升加20μ1 0.2MpH值為9.5的碳酸鹽緩沖液，使pH值為9.0~9.5，加入LN的 IgG抗體至抗體濃度為2.5mg/mL，在0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時；
[0048] (4)每毫升加0.1ml 4mg/ml NaBH4溶液，4°C放置2小時；然后以0.15MpH7.4PBS透 析，4°C過夜；
[0049] (5)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4°C放置1小時后，3000rpm離心半小時， 棄上清;沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于0.15MpH值為7.4的PBS中，以0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析約5個小時；
[0050] (6) lOOOOrpm離心30分鐘去除沉淀，制得堿性磷酸酶標記的LN抗體。
[0051 ] 在本發(fā)明中，試劑R2中包括:牛γ球蛋白IgG 0.5~lug/mL;TRIS 1~2g/L;NaCl 4 ~5g/L;防腐劑0 · 1 ~0 · 5mL/L。
[0052] 一些實施例中，牛 γ 球蛋白 IgG 0.9yg/mL;TRIS 1.56g/L;NaCl 4.23g/L;防腐劑 0.2mL/L〇
[0053] 一些實施例中，防腐劑為Proclin300。
[0054] -些實施例中，試劑R2的pH值為7.4±0.05。
[0055] 在本發(fā)明中，所述清洗濃縮液中包括:TRIS 12.54g/L;NaCl 325.6g/L;Tween20 5g/L；Proclin300 0.2mL/L〇
[0056] 清洗濃縮液的pH值為7 · 4 ± 0 · 05。
[0057] 在本發(fā)明中，所述稀釋液中包括:BSA V 60g/L;NaCl 9g/L;Proclin-3000.5mL/L。
[0058] 在本發(fā)明中，發(fā)光底物中包括：LUMIPH0S530 250mL/L;TRIS 2.35g/L;NaCl 6.41g/L;Na2S〇3 0.0〇2g/L;Proclin_3〇0 0.2mL/L。
[0059] 發(fā)光底物的pH值為8.0 ±0.05。
[0060] 在本發(fā)明中，本發(fā)明提供的試劑盒中還包括標準品、質(zhì)控品和/或標準品；
[0061] 所述標準品、質(zhì)控品和標準品中含有LN抗原和BSA V。
[0062] 所述標準品為不同濃度的LN抗原溶液，其中含有BSA V。
[0063] 標準品中，LN 抗原的濃度分別為 0ng/mL、30ng/mL、90ng/mL、180ng/mL、450ng/mL、 900ng/mL〇
[0064] 各標準品中，BSA的濃度為6%。
[0065] 所述質(zhì)控品為不同濃度的LN抗原溶液，其中含有BSA V。
[0066]質(zhì)控品中，LN抗原的濃度分別為60ng/mL、450ng/mL。
[0067] 各質(zhì)控品中，BSA的濃度為6%。
[0068] 所述校準品為不同濃度的LN抗原溶液，其中含有BSA V。
[0069] 校準品中，LN抗原的濃度分別為90ng/mL、450ng/mL。
[0070] 各校準品中，BSA的濃度為6%。
[0071 ]本發(fā)明提供的試劑盒適用于全自動儀器檢測或半自動儀器檢測，采用全自動檢測 的實際和中，包括校準品。
[0072]本發(fā)明提供的試劑盒中還包括ID卡。
[0073] 本發(fā)明提供試劑和中各試劑的比例以體積份數(shù)計為:磁分離試劑4~6份，試劑h 4~6份，試劑R2 4~6份，校準品4~6份，質(zhì)控品1~3份，校準品1~3份，清洗濃縮液20~30 份，稀釋液10~20份，發(fā)光底物25~40份。
[0074] 本發(fā)明提供的試劑盒采用本發(fā)明提供的組合物，其適用于LN的化學發(fā)光法檢測， 其檢測靈敏度高，精密性，線性范圍較廣。其能夠檢測的物質(zhì)為LN的標準品、質(zhì)控品或校準 品，血清或全血。其可用于疾病的診斷或治療，也可僅用于科研目的的檢測。
[0075] 本發(fā)明提供的試劑盒用于非疾病診斷或治療目的LN的磁微?；瘜W發(fā)光法檢測。
[0076] 本發(fā)明提供的試劑盒的使用方法，包括：
[0077] 步驟1:將待測樣品與試劑R1、試劑R2、磁分離試劑混合，37 °C孵育30min;
[0078] 步驟2:磁分離沉淀lmin后，棄上清液、以經(jīng)稀釋的清洗濃縮液清洗后，與發(fā)光底物 混合，測定發(fā)光值，根據(jù)發(fā)光值，以標準曲線法確定LN濃度。
[0079] 標準曲線采用標準品繪制，以標準品濃度為橫坐標，以發(fā)光值為縱坐標，擬合曲 線，獲得公式。
[0080] 步驟1中試劑R1、試劑R2、磁分離試劑的體積比為1:1:1。
[0081] 步驟2中稀釋采用純化水，稀釋的比例為7倍。
[0082] 遇到高值HOOK樣本，以稀釋液對待測樣品稀釋后進行檢測。
[0083]本發(fā)明的有益效果在于：
[0084] (1)本發(fā)明公開了一種新的組合物，用于LN的磁微?；瘜W發(fā)光法，使得反應過程更 加穩(wěn)定可靠，具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達到了較佳的性能參數(shù)。
[0085] (2)本發(fā)明試劑盒將化學發(fā)光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的 反應體系，與現(xiàn)有技術相比，在出結果時間上較傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫法少10-20分鐘，同時抗體的 用量降低了20%以上，在提高產(chǎn)品性能的同時，大大降低了產(chǎn)品成本。
[0086] (3)試劑盒中各組分的配比均是反應體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用有效 期及檢測性能提供了有力保障。
[0087] (4)本發(fā)明試劑盒的精確度、靈敏度以及穩(wěn)定性均優(yōu)于市場同類產(chǎn)品，并且成本低 廉，操作簡單，應用前景廣闊。
[0088]試驗表明，以本發(fā)明提供的組合物對LN進行檢測，最低檢測限可達0.03ng/mL，靈 敏度高。批內(nèi)變異CV% g 10.0 % ;批間變異CV% g 15.0% ;精密性良好。標準曲線，線性系 數(shù):r彡0 · 9900;線性范圍：0 · 03-100ng/ml。
【具體實施方式】
[0089] 本發(fā)明公開了一種層粘連蛋白（LN)測試試劑盒及其測試方法，本領域技術人員可 以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本 領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法已經(jīng)通 過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所 述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0090] 下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0091] 實施例1
[0092]以配制1L為例：
[0093] (1)稱取Tr i s (三羥甲基氨基甲烷，分子式：（H0CH2) 3CNH2) 1 · 56g和NaCl 4 · 23g于 1L燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.2ml于少量純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上 述1L容器中；
[0094] (2)用量筒量取800ml純化水于燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解；用4M HCL或4M NaOH調(diào)PH，測量其范圍在7.35-7.45之間；
[0095] (3)稱取牛γ球蛋白IgG 0.9g于800ml純化水的燒杯中；
[0096] (4)最后定容1000ml，完全溶解后，測PH值，范圍在7.35-7.45之間即符合要求，用 0.2um濾器過濾;過濾完后，貼好標簽于2-8 °C冷庫貯存；
[0097]試劑R2的配制（表1)
[0098]
[0099]
[0100] 實施例2:
[0101] 本發(fā)明的一種層粘連蛋白（LN)測試試劑盒，該試劑盒由磁分離試劑，試劑Ri，試劑 R2，標準品，質(zhì)控品，校準品，清洗濃縮液，稀釋液及發(fā)光底物組成，其中：磁分離試劑:標記 有小鼠抗人LN的單克隆抗體的納米磁性微球，所述標記有小鼠抗人LN的單克隆抗體的納米 磁性微球的濃度為167μg/ml;試劑心:含有堿性磷酸酶標記的LN抗體，所述堿性磷酸酶標記 的LN抗體濃度為lμg/ml;試劑R 2:含有牛γ球蛋白質(zhì)組分的緩沖液;標準品，質(zhì)控品和校準 品:含有一定量LN抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，所述標準品的濃度為0(S0)、30 (SI)、90(S2)、180(S3)、450(S4)、900(S5)ng/ml，所述質(zhì)控品的濃度為60，450ng/ml，所述校 準品的濃度為90，450ng/ml;清洗濃縮液:含有Tween-20和Procl in-300的緩沖液;稀釋液： 含有牛血清白蛋白組分五(BSA V)的溶液;發(fā)光底物:金剛烷的衍生物IUMIPH0S530，所述金 剛烷的衍生物IUMIPH0S530的濃度為10μg/ml;
[0102] 本實施例的一種層粘連蛋白（LN)測試試劑盒，由下述體積比組成的：磁分離試劑 4%，試劑心4,試劑R2 4,校準品4,質(zhì)控品1，校準品1，清洗濃縮液20,稀釋液10,發(fā)光底物 25；
[0103] 本發(fā)明上述層粘連蛋白（LN)測定試劑盒的制備方法，其具體步驟如下：
[0104] 第一步:磁分離試劑的制備過程
[0105] -、磁珠緩沖液配制操作規(guī)程:配方見表2,以配制1L為例：
[0106] (1)稱取Tris 4.58g和NaC16.81g于 1L容器中，稱取0.96g Tween-20于20ml容器中 加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
[0107] (2)用移液器將Proclin-300量取0.2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入 上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；
[0108] (3)調(diào)節(jié)？!1計測量其？!1值；用4]\1!1(：1或4]\1他0!1調(diào)？!1，測量其？!1在7.95 - 8.05之間 即符合要求；
[0109] (4)稱取BSA V(牛血清白蛋白）3g倒入上述1L容器中；
[0110] (5)最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7.95 -8.05之間即符合要求，用0.2um濾器 過濾即得;過濾完后貼好標簽于2-8 °C冷庫貯存；
[0111] 磁珠緩沖液(表2)
[0112]
[0114] 二、磁分離試劑的配制
[0115] (1)將l.Omg DSS(辛二酸二琥珀酰亞胺）溶于50ul DMS0中，即濃度為20mg/mL;取 2mgLN抗體溶于PH 9.5的O.lmol/L PB緩沖液中至總體積為lml;
[0116] (2)計算DSS的投入量，按照以下公式計算：（抗體質(zhì)量/16000)X10X368/CDSS)，其 中C DSS指代DSS的物質(zhì)的量濃度mol/L;
[0117] (3)用移液槍吸取相應體積的DSS加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min;
[0118] (4)將步驟3抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中，然后放入到sigma2-16k高速 冷凍離心機中在3000g的離心力下濃縮約30min至體積為0.5ml;
[0119] (5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直徑在0.01-5. Ομπι之間，加入5ml反應杯中，放入專 用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；
[0120] (6)每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混勻30秒，上架，去上清，重復操作3次； 將步驟4獲得的抗體溶液加入到磁珠中，混勻后室溫反應4小時，保持混勻狀態(tài)；
[0121] (7)加入0.3ml lmol/L的Tris溶液37°C15分鐘，其中Tris的加樣量為lmg抗體加 0.15mlTris；
[0122] (8)每次加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已經(jīng)標記的磁珠，混勻30秒，上架， 去上清，重復操作3次；
[0123] (9)用100ml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶，即為0.05%的LN磁分離試劑；
[0124] (10)將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的比例混勻，即得本發(fā)明試 劑盒中分離試劑。
[0125] 第二步:試劑的制備過程
[0126] -、試劑稀釋液配制操作規(guī)程:配方見表3,以配制1L為例：
[0127] (1)取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCh 0.05g 于燒瓶中；然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；
[0128] (2)用4M HC1 或4M NaOH調(diào)PH，測量使PH在7.35-7.45范圍內(nèi)；
[0129] (3)稱取BSA V 3g倒入上述燒瓶中；
[0130] (4)最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7.35-7.45之間即符合要求，用0.2um濾器 過濾;過濾完后，貼好標簽于2-8 °C冷庫貯存；
[0131] 試劑辦稀釋液表3
[0132]
[0134] 二、試劑辦的配制(堿性磷酸酶(ALP)標記的小鼠抗人LN單克隆抗體）
[0135] (1)取lOmgALP加入5ml生理鹽水中，加入到Centricon-ΙΟ濃縮管中，3000rpm離心 大約20分鐘，濃縮至1毫升。
[0136] (2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaI04溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
[0137] (3)將上述溶液裝入透析袋中，用ImM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜。
[0138] (4)加2(^10.21^!19.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化六1^的?!1升高到9.0~9.5，然后 立即加入2.5mg IgG抗體，在lml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。
[0139] (5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4°C2小時。
[0140] (6)將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4PBS透析，4°C過夜。
[0141] (7)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C1小時。
[0142] (8)3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于 少量0.15M PH7.4的PBS 中。
[0143] (9)將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析約5個小時，去除 銨離子后，l〇〇〇〇rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，加入體積1/100的1M Mgcl 2溶液4°C保存。收集到的堿性磷酸酶(ALP)與LN單克隆抗體的偶聯(lián)物用上述酶反應物 稀釋液以1:600的體積比混合均勻，即得本發(fā)明試劑盒中試劑Ru
[0144] 第三步:試劑R2的制備
[0145] 試劑R2配制操作規(guī)程:配方見(表4)，以配制1L為例：
[0146] (1)稱取Tr i s (三羥甲基氨基甲烷，分子式：（H0CH2) 3CNH2) 1 · 56g和NaCl 4 · 23g于 1L燒杯中；用移液器將Proclin-300量取0.2ml于少量純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上 述1L容器中；
[0147] (2)用量筒量取800ml純化水于燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解；用4M HCL或4M NaOH調(diào)PH，測量其范圍在7.35-7.45之間；
[0148] (3)稱取牛γ球蛋白IgG 0.9g于800ml純化水的燒杯中；
[0149] (4)最后定容1000ml，完全溶解后，測PH值，范圍在7.35-7.45之間即符合要求，用 0.2um濾器過濾;過濾完后，貼好標簽于2-8 °C冷庫貯存；
[0150] 試劑R2的配制(表4)
[0151]
[0152] 第四步:標準品和質(zhì)控品的配制：
[0153] (1)最高點：最高濃度點為X，目標點濃度為A，B，C，D，E，F(xiàn)，配制V體積的溶液時，需 加入原料的體積為分別為:表5
[0154]
[0155]
[0156] (2)層粘連蛋白（LN)定量測定試劑盒LN標準品原料配制成濃度點為0，0.1，1，5， 50，100ng/ml;質(zhì)控品配制的濃度點為0.6，50ng/ml。校準品配制的濃度點為1，50ng/ml
[0157] (3)完全溶解后，貼好標簽于2-8 °C冷庫貯存；
[0158] 第五步:清洗濃縮液配制操作規(guī)程:配方見(表6)，以配制1L為例：
[0159] (1)稱取Tris 12.54g和NaCl 325.6g于 1L容器中；
[0160] (2)稱取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
[0161] (3)用移液器將Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml純化水的燒杯中完全溶解后， 倒入上述1L容器中；
[0162] (4)用量筒量取800ml純化水于上述1L容器中，充分攪拌，直至完全溶解；
[0163] (5)用4]\1!1(^或4]\1恥0!1調(diào)？!1，測量其范圍在7.35 - 7.45之間；
[0164] (6)最后定容1000ml，測PH值，范圍在7.35-7.45之間即符合要求，完全溶解后用 0.2um濾器過濾即得;過濾完后，貼好標簽于2-8 °C冷庫貯存；
[0165] 清洗濃縮液的配制(表6)
[0166]
[0168] 第六步:稀釋液配方見(表7 )，以配制1L為例：
[0169] (1)稱取NaC19.0g和BSA V 60g于 1L的容器中；
[0170] (2)用移液器將Proclin-300量取0.5ml加10ml純化水溶解，倒入上述1L的容器中；
[0171] (3)最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾，貼好標簽于2-8°C冷庫貯存；
[0172] 稀釋液的配制(表7)
[0173]
[0174]第七步:發(fā)光底物配制操作規(guī)程:配方見(表8)，以配制1L為例：
[0175] (1)稱取Tris2.35g、NaCl 6.41g、Na2S03 0.002g和Proclin-300 0.2ml于 1L燒杯 中；
[0176] (2)用量筒量取800ml純化水于燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解；用4M HC1或4M NaOH調(diào)PH，測量其范圍在7.95-8.05之間；
[0177] (3)最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7.95-8.05之間即符合要求，用0.2um濾器 過濾;過濾完后，加入250ml IUMIPH0S530，混勻后，貼好標簽于2-8°C冷庫貯存；
[0178] 發(fā)光底物的配制(表8)
[0179]
[0180] 本發(fā)明一種層粘連蛋白（LN)的測試方法，包括下列步驟：
[0181] (1)使用前，需使用試劑盒內(nèi)校準品（選)進行曲線校正，并用質(zhì)控品進行質(zhì)量控 制。測試結果在質(zhì)控范圍內(nèi)方可進行樣本的檢測。
[0182] (2)加4份LN標準品、質(zhì)控品、待測標本至對應試管底部；
[0183] (3)加4份試劑辦至每一試管中；
[0184] (4)加4份試劑R2至每一試管中；
[0185] (5)加4份磁分離試劑至每一試管中；
[0186] (6)用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37°C水浴30分鐘；
[0187] (7)試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘。緩 慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器 底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
[0188] (8)清洗濃縮液用純化水稀釋7倍后，加26.7份稀釋后的清洗液至每一試管中，置 多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s。加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出。混勻要徹 底；
[0189] (9)重復步驟6、7、6-遍；
[0190] (10)加25份底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準備好的發(fā)光檢測儀進行檢測。
[0191] (11)如遇到高值HOOK樣本，建議臨床醫(yī)師根據(jù)其余測試指標選擇合適的稀釋倍數(shù) 用稀釋液對樣品進行稀釋。
[0192] 實施例3:
[0193] 本發(fā)明的一種層粘連蛋白（LN)測試試劑盒，該試劑盒由磁分離試劑，試劑心，試劑 R2，標準品，質(zhì)控品，校準品，清洗濃縮液，稀釋液及發(fā)光底物組成，其中：磁分離試劑:標記 有小鼠抗人LN的單克隆抗體的納米磁性微球，所述標記有小鼠抗人LN的單克隆抗體的納米 磁性微球的濃度為132μg/ml;試劑R1:含有堿性磷酸酶標記的LN抗體，所述堿性磷酸酶標記 的LN抗體濃度為0.6μg/ml;試劑R2:含有牛γ球蛋白質(zhì)組分的緩沖液;標準品，質(zhì)控品和校 準品：含有一定量LN抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，所述標準品的濃度為0(S0)、 30(S1)、90(S2)、180(S3)、450(S4)、900(S5)ng/ml，所述質(zhì)控品的濃度為60,450ng/ml，所述 校準品的濃度為90，450ng/ml;清洗濃縮液:含有Tween-20和Procl in-300的緩沖液;稀釋 液:含有牛血清白蛋白組分五(BSA V)的溶液;發(fā)光底物:金剛烷的衍生物IUMIPH0S530，所 述金剛烷的衍生物IUMIPH0S530的濃度為10μg/ml;
[0194] 本實施例一種層粘連蛋白（LN)測試試劑盒，由下述體積比組成的：磁分離試劑 5.1，試劑R! 5.1，試劑R2 5.1，校準品5.1，質(zhì)控品1.7，校準品1.7，清洗濃縮液25，稀釋液17， 發(fā)光底物34;
[0195] 本實施例的測試方法，包括下列步驟：
[0196] (1)使用前，需使用試劑盒內(nèi)校準品（選)進行曲線校正，并用質(zhì)控品進行質(zhì)量控 制。測試結果在質(zhì)控范圍內(nèi)方可進行樣本的檢測。
[0197] (2)加5.1份LN標準品、質(zhì)控品、待測標本至對應試管底部；
[0198] (3)加 5.1份試劑辦至每一試管中；
[0199] (4)加5.1份試劑辦至每一試管中；
[0200] (5)加5 · 1份磁分離試劑至每一試管中；
[0201] (6)用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37°C水浴30分鐘；
[0202] (7)試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘。緩 慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器 底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
[0203] (8)清洗濃縮液用純化水稀釋7倍后，加26.7份稀釋后的清洗液至每一試管中，置 多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s。加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出?；靹蛞獜?底；
[0204] (9)重復步驟 6、7、6-遍；
[0205] (10)加34份底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準備好的發(fā)光檢測儀進行檢測。
[0206] (11)如遇到高值HOOK樣本，建議臨床醫(yī)師根據(jù)其余測試指標選擇合適的稀釋倍數(shù) 用稀釋液對樣品進行稀釋。
[0207]本實施例采用所述的試劑盒各組分的配制方法與實施例2相同。
[0208] 實施例4:
[0209] 本發(fā)明的一種層粘連蛋白（LN)測試試劑盒，該試劑盒由磁分離試劑，試劑心，試劑 R2，標準品，質(zhì)控品，校準品，清洗濃縮液，稀釋液及發(fā)光底物組成，其中：磁分離試劑:標記 有小鼠抗人LN的單克隆抗體的納米磁性微球，所述標記有小鼠抗人LN的單克隆抗體的納米 磁性微球的濃度為167μg/ml;試劑心:含有堿性磷酸酶標記的LN抗體，所述堿性磷酸酶標記 的LN抗體濃度為lμg/ml;試劑R 2:含有牛γ球蛋白質(zhì)組分的緩沖液;標準品，質(zhì)控品和校準 品:含有一定量LN抗原的牛血清白蛋白組分五(BSA V)溶液，所述標準品的濃度為0(S0)、30 (SI)、90(S2)、180(S3)、450(S4)、900(S5)ng/ml，所述質(zhì)控品的濃度為60，450ng/ml，所述校 準品的濃度為1，50ng/ml;清洗濃縮液:含有Tween-20和Procl in-300的緩沖液;稀釋液:含 有牛血清白蛋白組分五(BSA V)的溶液;發(fā)光底物:金剛烷的衍生物IUMIPH0S530，所述金剛 烷的衍生物IUMIPH0S530的濃度為10μg/ml;
[0210] 本實施例一種層粘連蛋白（LN)測試試劑盒，由下述體積比組成的：磁分離試劑6， 試劑R! 6，試劑R2 6，校準品6，質(zhì)控品3，校準品3，清洗濃縮液30，稀釋液20，發(fā)光底物40;
[0211] 本實施例的測試方法，包括下列步驟：
[0212] (1)使用前，需使用試劑盒內(nèi)校準品（選)進行曲線校正，并用質(zhì)控品進行質(zhì)量控 制。測試結果在質(zhì)控范圍內(nèi)方可進行樣本的檢測。
[0213] (2)加6份LN標準品、質(zhì)控品、待測標本至對應試管底部；
[0214] (3)加6份試劑辦至每一試管中；
[0215] (4)加6份試劑辦至每一試管中；
[0216] (5)加6份磁分離試劑至每一試管中；
[0217] (6)用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37°C水浴30分鐘；
[0218] (7)試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘。緩 慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器 底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
[0219] (8)清洗濃縮液用純化水稀釋7倍后，加26.7份稀釋后的清洗液至每一試管中，置 多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s。加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出。混勻要徹 底；
[0220] (9)重復步驟 6、7、6-遍；
[0221] (10)加40份底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準備好的發(fā)光檢測儀進行檢測。
[0222] (11)如遇到高值HOOK樣本，建議臨床醫(yī)師根據(jù)其余測試指標選擇合適的稀釋倍數(shù) 用稀釋液對樣品進行稀釋。
[0223] 本實施例采用所述的試劑盒各組分的配制方法與實施例2相同。
[0224] 實施例5:臨床試驗：
[0225] 1、檢測數(shù)據(jù)
[0226] 標本采自1000例正常體檢、供血者。樣本體檢結果均無肝、腦、腎、消化道疾病，半 年內(nèi)無輸血和大手術史，婦女不在妊娠期和哺乳期。分離血清進行檢測，將測值進行統(tǒng)計學 分析，得出正常血清參考范圍：5~130ng/ml。本數(shù)據(jù)僅供參考，不同地區(qū)、不同個體以及采 用不同方法進行檢測，所測得的LN水平也會有所不同，建議各實驗室建立自己的正常值范 圍。不可僅憑本方法得出的LN值作出診斷，僅作為中間數(shù)據(jù)參考作用，應結合臨床其他資料 分析結果，包括病人的具體情況和治療狀況。通過其他方法得到的樣品中的LN濃度值與本 試劑盒測定結果不具有直接的可比性。超出試劑盒測定范圍的樣本，系統(tǒng)將無法給出確切 的數(shù)值。如欲測定其確切的結果，建議稀釋后再進行測定。本試劑盒的檢測結果僅供臨床參 考，不能單獨作為確診或排除病例的依據(jù)，為達到診斷目的，此檢測結果要與臨床檢查、病 史和其它的檢查結合使用。本品可用于血清樣本的測定，用于其他體液樣本中LN濃度測定 的可靠性未得到充分確認。
[0227] 2、本發(fā)明試劑盒性能指標
[0228] 分析靈敏度定義為:對20次零標準品的測定，取其2倍的平均偏差，其在標準曲線 上所對應的濃度即為分析靈敏度;分析靈敏度:最低檢測限為0.03ng/ml;精密性:批內(nèi)變異 (^%蘭10.0%;批間變異(^%蘭15.0% ;線性系數(shù)4彡0.9900;線性范圍：0.03-1001^/1111:
[0229] 與主要類似物的交叉反應情況(表9):
[0230]
[0231]結果顯示，本發(fā)明試劑盒具有良好的靈敏性、精密型、線性范圍廣，且具有良好的 抗干擾能力。
[0232]最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在 形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。
【主權項】
1. 一種組合物，其中包括:牛γ球蛋白IgG、TRIS、NaCl和防腐劑。2. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于，各組分的濃度為： 牛 γ 球蛋白IgG 0.5~lug/mL;TRIS 1 ~2g/L;NaCl 4~5g/L;防腐劑0· 1 ~0·5mL/L。3. 權利要求1或2所述的組合物在制備層黏連蛋白檢測產(chǎn)品中的應用。4. 一種層粘連蛋白檢測試劑盒，包括:權利要求1或2所述的組合物、磁分離試劑、試劑 Ri、清洗濃縮液、稀釋液和發(fā)光底物，其中： 所述磁分離試劑中含有標記有小鼠抗人LN的單克隆抗體的納米磁性微球； 所述試劑辦中含有堿性磷酸酶標記的LN抗體； 所述清洗濃縮液中含有Tween-20; 所述稀釋液中含有BSA; 所述發(fā)光底物中含有IUMIPH0S530。5. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述磁分離試劑中標記有小鼠抗人LN的 單克隆抗體的納米磁性微球的濃度為1 〇〇~200yg/mL。6. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R1中堿性磷酸酶標記的LN抗體 的濃度為〇. 5~2yg/mL。7. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述清洗濃縮液中包括:TRIS 12.54g/ L；NaCl 325.6g/L；Tween20 5g/L；Proclin300 0.2mL/L〇8. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述稀釋液中包括:BSA V 60g/L;NaCl 9g/L； Prod in-300 0.5mL/L〇9. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述發(fā)光底物中包括：IUMIPH0S530 250mL/L;TRIS 2.35g/L;NaCl 6.41g/L;Na2S〇3 0.002g/L;Proclin-300 0.2mL/L。10. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，其中還包括標準品、質(zhì)控品和/或標準 品； 所述標準品、質(zhì)控品和標準品中含有LN抗原和BSA V。11. 權利要求4~10任一項所述的試劑盒用于非疾病診斷或治療目的LN的磁微?；瘜W 發(fā)光法檢測。12. 權利要求4~10任一項所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括： 步驟1:將待測樣品與試劑R1、試劑R2、磁分離試劑混合，37°C孵育30mi η; 步驟2:磁分離沉淀lmin后，棄上清液、以經(jīng)稀釋的清洗濃縮液清洗后，與發(fā)光底物混 合，測定發(fā)光值，根據(jù)發(fā)光值，以標準曲線法確定LN濃度。
【文檔編號】G01N21/76GK105973878SQ201610325733
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】朱馳
【申請人】北京豪邁生物工程有限公司