G種腸道病毒直接免疫熒光試劑及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測G種腸道病毒的免疫熒光試劑及其檢測試劑盒，是用熒光染料也可標(biāo)記的VP1單克隆抗體，所述的VP1單克隆抗體，是利用G種腸道病毒的VP1蛋白，采用雜交瘤單抗制備技術(shù)獲得；所述的VP1蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。既可用于臨床快速診斷G種腸道病毒感染，也可用于G種腸道病毒抗原在組織中的定位與鑒定；直接免疫熒光檢測時間短，40分鐘內(nèi)即可報告結(jié)果；特異性強(qiáng)，僅與G種腸道病毒反應(yīng)；重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，與間接免疫熒光方法的符合率為90%以上，可用于G種腸道病毒感染的快速診斷。
【專利說明】
G種腸道病毒直接免疫熒光試劑及其試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測G種腸道病毒直接免疫熒光試劑及其試劑 盒，適于G種腸道病毒感染的診斷及組織或細(xì)胞中羊腸道病毒抗原的定位與鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊G種腸道病毒(CEV)，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。羊腸道病毒感染是目前國內(nèi) 外新發(fā)的一種臨床上以消化道和呼吸道為主要特征的疫病，給養(yǎng)羊業(yè)帶來嚴(yán)重威脅。申請 人于2014年從吉林多地爆發(fā)的一種臨床上以嚴(yán)重腹瀉，高發(fā)病率和高致死率為主要特征的 不明疫病中的山羊體內(nèi)分離到G種腸道病毒CEV-JL14,經(jīng)過序列測定與分析發(fā)現(xiàn)，所分離的 毒株是一種新的腸道病毒。目前，針對該類病毒或該類疫病尚沒有特異性的檢測與診斷方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是為解決羊G種腸道病毒尚沒有特異性的檢測與診斷方法提供一種 檢測G種腸道病毒的直接免疫熒光檢測熒光試劑及其試劑盒。
[0004] 檢測G種腸道病毒的免疫熒光試劑，是用FITC標(biāo)記(但不僅限于FITC，其他熒光染 料也可）的VP1單克隆抗體，所述的VP1單克隆抗體，是利用G種腸道病毒的VP1蛋白，采用雜 交瘤單抗制備技術(shù)獲得;所述的VP1蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示； 所述的VP1蛋白是由堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示的G種腸道病毒基因表達(dá) 的。所述的G種腸道病毒基因 ΚΡΛ可采用PCR技術(shù)，以G種腸道病毒基因組cDNA為模板擴(kuò)增獲 得，也可人工合成； G種腸道病毒直接免疫熒光檢測試劑盒，免疫熒光試劑為上述檢測G種腸道病毒的免疫 焚光試劑。
[0005] 本發(fā)明提供了檢測G種腸道病毒的免疫熒光試劑及其檢測試劑盒，是應(yīng)用本發(fā)明 的檢測G種腸道病毒的免疫熒光試劑建立的直接免疫熒光檢測方法，既可用于臨床快速診 斷G種腸道病毒感染，也可用于G種腸道病毒抗原在組織中的定位與鑒定。直接免疫熒光檢 測時間短，40分鐘內(nèi)即可報告結(jié)果;特異性強(qiáng)，僅與G種腸道病毒反應(yīng);重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高， 與間接免疫熒光方法的符合率為90%以上，可用于G種腸道病毒感染的快速診斷。
[0006] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn) 1、 應(yīng)用本發(fā)明試劑建立的直接免疫熒光方法，可用于臨床快速診斷G種腸道病毒感染， 也可用于G種腸道病毒抗原在組織細(xì)胞中的定位與鑒定； 2、 直接免疫熒光方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、具有很好的重復(fù)性。40分鐘內(nèi)報告結(jié)果，可 用于G種腸道病毒的快速診斷； 3、 具有生物安全性，試劑盒所用的抗G種腸道病毒VP1的單克隆抗體為原核載體表達(dá)的 重組蛋白誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生，不含活的腸道病毒，因此不存在散毒危險； 4、 敏感性高，制備單克隆抗體具有很高的免疫效價，從而確保異硫氰酸熒光素(FITC) 標(biāo)記后試劑的敏感性； 5、 特異性強(qiáng)，制備的免疫熒光試劑與其他病原體無交叉反應(yīng)，只檢出G種腸道病毒，具 有很尚特異性； 6、 穩(wěn)定性好，熒光試劑4°C保存6個月，檢測結(jié)果與常規(guī)方法無明顯差異，具有很好的穩(wěn) 定性。
【附圖說明】
[0007] 圖1 PGEX-4T-1-VP1重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果（泳道M:DNA分子marker;泳道1 :pGEX-4T-1-VP1 EcoRI/XhoI雙酶切；泳道2:pGEX-4T-1-VPl EcoRI單酶切）； 圖2重組VP1蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果(泳道Μ:蛋白質(zhì)分子量marker;泳道1 : pGEX-4T-1-VP1重組菌未誘導(dǎo)總蛋白；泳道2:pGEX-4T-1-VPl重組菌誘導(dǎo)后總蛋白；泳道3:純化后的 重組VP1蛋白）； 圖3雜交瘤細(xì)胞染色體計數(shù)； 圖4.直接免疫熒光檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 實(shí)施例1 G種腸道病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 1、 引物設(shè)計 根據(jù)目標(biāo)序列的堿基組成，分別設(shè)計引物擴(kuò)增階_7基因，上下游分別含有EcoRI、Xho頂每 切位點(diǎn)。引物序列如下： 上游引物：5' TTGAATTCCAGGCTGGGTATGTGACT 3'（EcoRI) 下游引物：5' TCTCGAGTTAATGAAAATCACTGAGGGGTT 3'（Xhol) 2、 基因擴(kuò)增 常規(guī)Trizol法提取G種腸道病毒的基因組RNA，采用市售常規(guī)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明 操作獲得cDNA，并以其為模板擴(kuò)增基因，PCR反應(yīng)體系：
PCR 運(yùn)行條件：94°C 預(yù)變性 3min;94°C 變性 1.5min、54°C 退火 40sec、72°C 延伸 40sec，共 35個循環(huán);72°C再延伸6min。反應(yīng)結(jié)束后，取lyL進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0009] 3、目標(biāo)基因與PGEX-4T-1的連接、轉(zhuǎn)化 采用分子生物學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)酶切、連接等技術(shù)，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-VP1，并采 用CaCl2法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)中。利用含1〇〇 yg/mL氨芐霉素的LB培養(yǎng)平 板篩選陽性克隆，并進(jìn)行常規(guī)增菌培養(yǎng)，收獲菌體，提取質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRI/XhoI雙酶切鑒定， 如圖1所示。
[0010] 實(shí)施例2 VP1重組蛋白的表達(dá)及純化 將鑒定的陽性重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-VP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，涂板， 37°C培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落接種到3 mL含有100 yg/mL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 過夜，然后取1 mL上述培養(yǎng)物接種到200 mL含有100 yg/rnL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 。(:振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期（0D6qq=0 · 6)，加入IPTG(終濃度1 mmo 1/L)，20 °C誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，經(jīng) SDS-PAGE檢測，獲得了重組目標(biāo)蛋白VP1，如圖2所示(泳道2)。離心沉淀菌體，超聲破碎后 以1.5M尿素洗滌3次后獲得高純度的重組蛋白，如圖2所示(泳道3)。
[0011] 實(shí)施例3抗G種腸道病毒VP1蛋白單克隆抗體的制備 1、動物免疫:選擇6-8周齡健康BALB/c小鼠，以弗氏完全佐劑乳化純化的VP1蛋白，每只 小鼠腹腔注射l〇〇tig，14d后以弗氏不完全佐劑乳化蛋白腹腔注射lOOyg，最后一次加強(qiáng)免疫 時直接腹腔注射l〇〇yg純化的蛋白，融合前3~4d尾靜脈注射5(?^純化的蛋白。
[0012] 2、細(xì)胞融合：取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0混合于融合管內(nèi)，以300Xg離心10 min，棄去上清，振蕩細(xì)胞，使兩種細(xì)胞盡量混合均勻，然后60s內(nèi)緩慢滴加預(yù)熱的PEG-^OO 溶液，再緩慢加入無血清的 1640 培養(yǎng)基終止融合，靜置后再以 1 000 r/min 離心 10 min，棄去上清后加入HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞混勻懸浮，于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第14d開始換 液，并檢測雜交瘤細(xì)胞。
[0013] 3、雜交瘤細(xì)胞克隆的篩選:采用間接ELI SA方法，即用純化的VP 1蛋白作為包被抗 原，包被反應(yīng)板，加入雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測;對ELISA陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn) 行克隆，直至所有孔都為陽性。通過3次細(xì)胞克隆，獲得20株雜交瘤細(xì)胞，其中用人工合成 VP1基因表達(dá)的VP1蛋白免疫，取免疫小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行雜交，獲得雜交瘤細(xì)胞12株;PCR方 法獲得的基因，獲得雜交瘤細(xì)胞8株； 按上述方法，經(jīng)多次重復(fù)，均獲得了篩選到了多株雜交瘤。
[0014] 4、單克隆抗體制備:取高壓滅菌的石蠟油0.5 mL，注射到小鼠腹腔，7d后腹腔注入 1〇6個雜交瘤細(xì)胞，一周后抽取腹水，置37°c 24 h后4°C過夜，然后離心腹水，上清56°C滅活 30 min備用。
[0015] 5、單克隆抗體純化：用4倍體積醋酸緩沖液稀釋腹水，調(diào)至pH4.5，緩慢滴加3.3 % 的正辛酸，攪拌30 min，離心取上清，加入1/10體積的10倍roS，調(diào)至pH7.4,4°C預(yù)冷后用45 %飽和硫酸銨沉淀，離心后將沉淀以PBS溶解后移入透析袋，在50倍體積PBS中透析，透析期 間每6小時換液1次，透析結(jié)束后，以紫外分光光度計測定蛋白濃度并分裝凍存。
[0016] 6、單克隆抗體特性鑒定 ⑴腹水效價確定。以間接ELISA方法測定。細(xì)胞培養(yǎng)上清與腹水以10X進(jìn)行倍比稀釋， 同時以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清和未接腫瘤細(xì)胞健康小鼠的腹水作為對照。檢測確定出單抗的 腹水效價為6.4X105。
[0017] (2)抗VP1蛋白單克隆抗體IgG亞類鑒定。按小鼠 mAblgG亞類檢測試劑盒說明書進(jìn) 行。具體方法是將純化的每株單克隆抗體1000倍稀釋后包被酶標(biāo)板，每孔100 tiL，37°C孵育 1 h，洗滌后每孔加入1000倍稀釋的抗體亞類試劑100 tiL，37°C孵育1 h，洗滌3遍后，加入羊 抗小鼠 IgG酶標(biāo)二抗，37°C孵育1 h，確定單克隆抗體的亞類為IgGl。
[0018] (3)雜交瘤細(xì)胞株染色體的分析采用秋水仙素法對雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行染色體分 析，結(jié)果顯示雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為86-90條。
[0019] (4)抗VP1單克隆抗體特異性鑒定。將所獲單克隆抗體分別與口蹄疫病毒(FMDV)、 牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛細(xì)小病毒(BPV)進(jìn)行間接ELISA，結(jié)果顯示，制備的單克隆抗體 與其它病毒病均無交叉反應(yīng)性，鑒定結(jié)果見表1
。
[0020] 實(shí)施例4免疫熒光抗體的制備 1、抗體稀釋:將VP1單克隆抗體以碳酸鹽緩沖液(0.025 M pH9.2 CBS)稀釋為蛋白濃度 為10 mg/mL，裝入透析袋中備用。
[0021] 2、熒光素溶液制備：稱取異硫氰酸熒光素(FITC)，用0.025 M pH9.2 CBS配制成 0.1 mg/mL，磁力攪拌避光溶解。
[0022] 3、抗體標(biāo)記:將抗體和熒光色素混合，加入到透析袋4°C避光標(biāo)記24 h。
[0023] 4、焚光標(biāo)記抗體的純化:取出透析袋中的標(biāo)記抗體，1000 r/min離心3 min，取上 清液過SephandxG-50層析柱，用滅菌0.01 M pH7.2 PBS洗脫，除去游離的熒光素和鹽;分管 收集第一峰，適當(dāng)濃縮，測定其工作濃度后分裝，保存于_20°C備用，即為牛腸道病毒免疫熒 光診斷試劑。
[0024] 實(shí)施例5直接免疫熒光試驗(yàn)方法的建立 1、CEV感染細(xì)胞的制備:將G種腸道病毒(CEV)接種于已長成單層的96孔RAW264.7細(xì)胞 培養(yǎng)板，同時設(shè)正常RAW264.7細(xì)胞為陰性對照;于37°C 5% C02條件下培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)30 %左右時，棄上清液，以無菌PBS或生理鹽水洗滌1，每孔加入冷甲醇100 tiL，4°C固定30 min，棄去固定液同前洗滌1次，-20 °C凍存?zhèn)溆谩?br>[0025] 2、直接免疫熒光試驗(yàn)操作方法:取CEV感染細(xì)胞板，加入適量經(jīng)1 % BSA- PBS稀釋 的上述免疫熒光試劑工作液，置于濕盒內(nèi)，37°C感作30 min，用roS或生理鹽水洗滌3次后， 每孔加30 uL抗熒光衰減封片劑(50 %甘油-PBS)，置倒置熒光顯微鏡下觀察，以出現(xiàn)亮綠色 熒光病灶判定陽性結(jié)果，拍照保存。同時設(shè)未接種病毒的正常細(xì)胞孔作為陰性對照。
[0026]實(shí)施例6免疫熒光試劑特性鑒定 1、熒光試劑工作濃度的確定:取實(shí)施例5中制備的感染細(xì)胞板和陰性細(xì)胞板作為對照， 每孔分別加入預(yù)先經(jīng)1 % BSA-PBS系列稀釋的免疫熒光試劑，進(jìn)行直接免疫熒光試驗(yàn)，以出 現(xiàn)清晰、明亮、特異性熒光的稀釋倍數(shù)為試劑的最大稀釋倍數(shù)。結(jié)果顯示，熒光試劑的最高 稀釋倍數(shù)為1:1000。為保證試劑的敏感性和熒光強(qiáng)度，確定工作濃度為1:500。
[0027] 2、焚光試劑的特異性檢測：將焚光抗體適當(dāng)稀釋后，分別與FMDV、BVDV和BPV感染 的細(xì)胞感作，同時設(shè)陰性對照，每孔加1:500稀釋的熒光試劑30 uL，進(jìn)行直接免疫熒光試驗(yàn) 試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下僅CEV感染細(xì)胞孔出現(xiàn)亮綠色熒光病灶，呈陽性反應(yīng)，直接 免疫熒光試驗(yàn)的熒光特性與IFA相同；而其它病毒感染細(xì)胞及正常RAW264.7細(xì)胞均無交叉 反應(yīng)。表明制備的免疫熒光試劑特異性好，可用于CEV感染細(xì)胞的鑒定，見表2。
[0028] 3、免疫熒光試劑的重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，將抗VP1熒光試劑 分裝后分別置-20 °C保存1、2、3、4、5和6個月后，對CEV感染細(xì)胞進(jìn)行直接免疫熒光試驗(yàn)試 驗(yàn)，測定試劑保存期和批內(nèi)批間重復(fù)性。結(jié)果顯示，在-20°C保存至6個月熒光效價不變，因 此其保存期為6個月；同時，批內(nèi)和批間重復(fù)性較好，質(zhì)量穩(wěn)定。
[0029]實(shí)施例7其他顏色熒光染料標(biāo)記 采用紅色熒光料PE，按照實(shí)施例4操作，標(biāo)記抗G種病毒VP1單克隆抗體獲得的免疫熒光 試劑，其檢測效果與FITC標(biāo)記的免疫熒光試劑相似。
【主權(quán)項】
1. 檢測G種腸道病毒的免疫熒光試劑，其特征在于:是用熒光染料也可標(biāo)記的VP1單克 隆抗體，所述的VP1單克隆抗體，是利用G種腸道病毒的VP1蛋白，采用雜交瘤單抗制備技術(shù) 獲得;所述的VP1蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測G種腸道病毒的免疫熒光試劑，其特征在于:所述的VP1蛋 白是由堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示的G種腸道病毒基因表達(dá)的。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測G種腸道病毒的免疫熒光試劑，其特征在于:所述的G種腸 道病毒基因?yàn)槿斯ず铣伞?. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的檢測G種腸道病毒的免疫熒光試劑，其特征在于:所述的 熒光染料FITC標(biāo)記。 5. G種腸道病毒直接免疫熒光檢測試劑盒，免疫熒光試劑為權(quán)利要求1所述的檢測G種 腸道病毒的免疫焚光試劑。
【文檔編號】G01N33/577GK105974119SQ201610444162
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月21日
【發(fā)明人】王新平, 魯海冰, 郭昌明, 王明月, 劉亞靜, 張群, 朱利塞, 王芳
【申請人】吉林大學(xué)