肝病的區(qū)分性診斷的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基本上非侵入性的肝病診斷，特別是能夠在早期階段干預該疾病進展的基本上非侵入性的肝病診斷。本發(fā)明還涉及使用血漿生物標記物來將非酒精性脂肪性肝炎(NASH)區(qū)分于非酒精性脂肪肝(NAFL)和非?非酒精性脂肪肝病(NAFLD)以及正常對照。具體而言，本發(fā)明涉及使用血漿中游離類二十烷酸和其他多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物水平來將NASH區(qū)分于NAFL和非?NAFLD的正常對照。
【專利說明】
肝病的區(qū)分性診斷
[0001] 相關申請數(shù)據(jù)
[0002] 本申請根據(jù)351].3.0§119(6)要求于2014年12月10日提交的美國專利申請如.61/ 914，345的優(yōu)先權權益，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文中。
[0003] 撥款信息
[0004] 本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院頒給的政府支持K23DK090303和美國國立衛(wèi)生研 究院頒給的政府支持GM U54 069338下完成的。政府對本發(fā)明具有一定權利。
技術領域
[0005] 本發(fā)明主要涉及肝病的診斷，具體涉及區(qū)分非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝 炎和正常對照。
【背景技術】
[0006] 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是美國慢性肝病最常見的病因。它廣義上可被細分為 非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，非酒精性脂肪肝(NAFL)被認為發(fā)展 為肝硬化的風險最小，而非酒精性脂肪性肝炎(NASH)被認為發(fā)展為肝硬化的風險較大。目 前用于區(qū)分患有NAFLD的患者患的是NAFL還是NASH的診斷黃金規(guī)則是肝活組織檢查。然而， 肝活組織檢查是侵入性的過程，其被取樣變化性、費用所限，且可能因病狀和偶發(fā)的死亡而 變得復雜化。
[0007] 目前還沒有可以準確且非侵入性的用于檢測NASH的生物標記物。基本上非侵入性 (例如除了取血之外）的NASH診斷是主要未得到滿足的醫(yī)療需求。
[0008] 以往的研究表明脂毒性在NASH的發(fā)病機制中起到了重要作用。最近的數(shù)據(jù)表明氧 化的低密度脂蛋白（oxLDL)及其他的脂質部分在患NASH的患者中比在患NAFL的患者中高。
[0009] 氧化的多不飽和脂肪酸(PUFA)和它們的代謝物參與各種炎癥性疾病，已經(jīng)報道自 氧化的亞油酸和亞麻酸在NAFLD中出現(xiàn)。隨著目前基于液相色譜-質譜的脂質組學技術的發(fā) 展，已經(jīng)開發(fā)了一種穩(wěn)健的綜合性方法，其針對如下物質進行脂質組學分析:數(shù)百上千的脂 肪酸、?；掖及泛脱仔灶惗樗?，包括它們源自于大量環(huán)氧合酶、脂肪氧合酶、細胞色 素 P450和產(chǎn)生異前列素的非酶促氧化的數(shù)量眾多的代謝物、及其組合。類二十烷酸及源自 于花生四烯酸(AA)和其他PUFA的相關氧化代謝物得到了特別關注?，F(xiàn)在超過150種這樣的 代謝物可以被常規(guī)地量化。
[0010]被診斷為NASH的病人患者發(fā)展成肝硬化的風險增加。目前肝硬化無藥可救，患者 僅限于接受能夠延緩疾病進展、降低最小化肝細胞損傷和減少并發(fā)癥的治療。NASH的早期 診斷可以阻止疾病進展并防止進展為肝硬化。然而，目前用于可靠地診斷NASH的唯一方法 是肝活組織檢查，其是侵入性非常大的過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明涉及基本上非侵入性的肝病診斷。本發(fā)明還涉及使用血漿生物標記物來將 非酒精性脂肪性肝炎（NASH)區(qū)分于非酒精性脂肪肝（NAFL)和非-非酒精性脂肪肝病 (NAFLD)以及正常對照。具體而言，本發(fā)明涉及使用血漿中游離類二十烷酸和其他多不飽和 脂肪酸(PUFA)代謝物水平來區(qū)分NASH與NAFL和非-NAFLD的正常對照。
[0012]正如在此討論的那樣，本發(fā)明對血衆(zhòng)類二十烷酸和其他氧化的PUFA的譜分析可以 區(qū)分患NASH的患者、患NAFL的患者和獨特表型的正常對照（例如，通過基于磁共振成像 (MRI)的測定，具有根據(jù)質子密度脂肪含量(MRI-PDFF)的文獻記載的肝臟脂肪含量小于 5%)〇
[0013] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種預測或評估被診斷患有肝病的患者的肝病進 展風險的方法。本方法通過測定從患者血漿樣品中獲得的脂質提取物中的一種或多種游離 類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物的特性（identity)和數(shù)量來予以實施。一 種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物相比于適當對照的升高或降低，如本文進一步 描述，表示增加的所述肝病進展風險，可以據(jù)此相應地調(diào)整療法。
[0014] 優(yōu)選地，測量患者血漿樣品（已從其中提取出含有靶分子的脂質）中的一種或多種 游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物。測定類二十烷酸和/或PUFA代謝物的特性和數(shù)量并與其 在正常對照中的水平相比較。
[0015] 在該實施方式的一個方面中，所述非酒精性肝病（NAFLD)為非酒精性脂肪肝 (NAFL)。在另一方面，所述NAFLD為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在再一方面，所述肝病進展 風險是進展為肝硬化。
[0016] 再一方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物選自于由PGE2、dhk P⑶2、四降 12-HETE(tetranor 12-HETE)、15-HETE、11，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20-C00H AA、9_oxo0DE和12，13Ep0ME組成的組，或為其任意組合。在一個具體方面，所述一種或 多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為11，12-diHETrE、dhk P⑶2和/或20-C00H AA，或為 其任意組合。在一個優(yōu)選方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為dhk PGD2和20-C00H AA。在另一個優(yōu)選方面，所述一種游離類二十烷酸為20-C00H AA。
[0017]在一個另外的方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物用AUR0C測 量。在再一方面，所述AUR0C約至少0.8。在另一方面，所述AUR0C約至少0.9。在再另一方面， 所述AUR0C約至少0.99。
[0018]在一個另外的實施方式中，本發(fā)明提供一種在被診斷患有肝病的患者中區(qū)分非酒 精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝的方法。本方法通過測定從患者血漿樣品中獲得 的脂質提取物中的一種或多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物的特性 和數(shù)量來予以實施。
[0019]此外，優(yōu)選測量患者血漿樣品（已從其中提取了包含靶分子的脂質）中的一種或多 種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物，盡管可以對非脂質提取的血漿樣品進行測量。測定類 二十烷酸和/或PUFA代謝物的特性和數(shù)量并與其在正常對照中的水平相比較。相比于正常 對照以及(為區(qū)分)相比于從非酒精性脂肪肝和非-非酒精性脂肪肝病獲得的那些，一種或 多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物水平有統(tǒng)計學意義的升高或降低表明患者患有 NASH。然后可以相應地實施療法。
[0020] 一方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物選自于由PGE2、dhk P⑶2、四降 12-HETE、15-HETE、11，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20-C00H AA、9-oxoODE、12， 13EpOME組成的組，或為其任意組合。在一個具體方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/ 或PUFA代謝物為11，12-diHETrE、dhk PGD2和/或20-C00H AA，或為其任意組合。在一個優(yōu)選 方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為dhk PGD2和20-C00H AA。
[0021]在一個另外的方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物用AUR0C測 量。在再一方面，所述AUR0C為約至少0.8。在另一方面，所述AUR0C為約至少0.9。在又另一方 面，所述AUR0C為至少0.99。
[0022]在再一個實施方式中，本發(fā)明提供一種將非酒精性脂肪性肝炎(NASH)區(qū)分于非酒 精性脂肪肝和非-非酒精性脂肪肝病的方法，所述方法包括測量從患者血漿樣品中提取的 脂質中的一種或多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物的水平。與正常 對照和(為區(qū)分)在非酒精性脂肪肝和非-非酒精性脂肪肝病所獲得的那些相比較，一種或 多種游離類二十烷酸和/或HJFA代謝物水平的升高表明患者患有NASH。然后可以相應地實 施療法。
[0023] 一方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物選自于由PGE2、dhk P⑶2、四降 12-HETE、15-HETE、11，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20-C00H AA、9-oxoODE和 12， 13Ep0ME組成的組，或為其任意組合。在一個具體方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/ 或PUFA代謝物為11，12-diHETrE、dhk PGD2和/或20-C00H AA。在一個優(yōu)選方面，所述一種或 多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為dhk PGD2和20-C00H AA。
[0024]在一個另外的方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物用AUR0C測 量。在再一方面，所述AUR0C為約至少0.8。在另一方面，所述AUR0C為約至少0.9。
[0025] 有利地，通過對肝病的進展進行非侵入性的準確測試，本發(fā)明的方法能夠讓醫(yī)生 有可能在與以前可能的階段相比在該病的更早階段實施干預。
【附圖說明】
[0026] 圖1給出了源自于花生四烯酸的代謝物。對每種代謝物以三個臨床臂示出了血漿 游離花生四烯酸(AA)及其源自于環(huán)氧合酶(C0X)、5-脂肪氧合酶(5-L0X)、12-和15-脂肪氧 合酶（12/15-L0X)和細胞色素 P450(CYP)活性的代謝物的定量。結果顯示為盒須圖（Box-and-Whisker plot)，其中盒的下邊界表示第25百分位，盒中的線表示中值，盒的上邊界表 示第75百分位。所述須表示數(shù)據(jù)范圍的下限和上限。
[0027] 圖2給出了備選底物來源的代謝物。對于每種代謝物以三個臨床臂示出了血漿游 離亞油酸(LA)、α-亞麻酸(ALA)、二十碳三烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯 酸(DHA)及其源自于5-L0X、12/15-L0X和CYP活性的代謝物的定量。結果顯示為盒須圖，其中 盒的下邊界表示第25百分位，盒中的線表示中值，盒的上邊界表示第75百分位。所述須表示 數(shù)據(jù)范圍的下限和上限。
[0028] 圖3(表1)給出了研究人群中患者的基礎人口統(tǒng)計學、臨床、生物化學和組織學的 特征。
[0029] 圖4(表2)給出了正常對照、非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪性肝炎中的類二十 烷酸代謝物。
[0030] 圖5(表3)給出了區(qū)分開NAFL和NASH的血清生物標記物的診斷準確性。
【具體實施方式】
[0031] 本發(fā)明涉及肝病診斷。本發(fā)明還涉及使用血漿生物標記物來將非酒精性脂肪性肝 炎(NASH)區(qū)分于非酒精性脂肪肝(NAFL)和無非-非酒精性脂肪肝的疾病(NAFLD)的正常對 照。具體而言，本發(fā)明涉及使用血漿中游離類二十烷酸和其他多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝 物水平來將NASH區(qū)分于NAFL和非-NAFLD的正常對照。
[0032] 在闡述本發(fā)明的組合物和方法之前，應該理解本發(fā)明并不限于所闡述的具體的組 合物、方法和實驗條件，因為這樣的組合物、方法和條件可以變化。還應該理解此處使用的 術語僅用于闡述具體的實施方式而并不意圖進行限定，因為本發(fā)明的范圍僅受所附的權利 要求書的限制。
[0033] 如本說明書和所附的權利要求書所使用的那樣，單數(shù)形式的"a"、"an"和"所述"包 括復數(shù)引用，除非上下文明確指出不是這樣。因此，例如，"所述方法"包括在此闡述的一個 或多個方法和/或步驟，這對閱讀了本說明書等的本領域技術人員而言是顯而易見的。
[0034] 除非另行定義，在此使用的所有科技用語均與本發(fā)明所屬的技術領域的技術人員 通常所理解的具有相同的含義。盡管在本發(fā)明的實施或測試中可以使用與此處所闡述的相 似或相同的任何方法和材料，但還是闡述了優(yōu)選的方法和材料。下面給出的定義用于理解 本發(fā)明而不應被理解為代替本領域的技術人員對這些術語的理解。
[0035]
[0036] 肝病是一種肝臟損傷或肝臟疾病。有一百多種肝病。最廣泛傳播的肝病如下:肝片 吸蟲病;肝炎;酒精性肝病;脂肪肝病;肝硬化;肝臟;膽汁性;硬化性膽管炎;小葉中心壞死； 布加氏綜合征;遺傳性肝病(涉及體內(nèi)鐵蓄積的血色病、和Wilson?。?；與甲狀腺素運載蛋白 (transthyretin)相關的遺傳性淀粉樣變性;和Gilbert綜合征。
[0037] 正如在此使用的那樣，術語"肝病"指影響肝臟的任何疾病或紊亂。肝病的例子包 括但不限定于Alagille綜合征；與酒精相關的肝病;Alpha-Ι抗胰蛋白酶缺乏；自體免疫性 肝炎;肝臟良性腫瘤;膽管閉鎖;肝硬化;半乳糖血癥;Gilbert綜合征;血色?。患赘?；乙肝； 丙肝;肝細胞癌;肝性腦病;肝囊腫;肝癌;新生兒黃疸;非酒精性脂肪肝病(包括非酒精性脂 肪肝和非酒精性脂肪性肝炎）；原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC);原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC);瑞 氏綜合征；I型糖原貯積病和Wilson病。
[0038] 非酒精性脂肪肝病
[0039] 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是脂肪肝的一個病因，其在脂肪蓄積在肝臟中（并非過 量飲酒所致)時出現(xiàn)。NAFLD與胰島素抵抗和代謝綜合征有關，并且可能響應于最初開發(fā)用 于其他胰島素抗性狀態(tài)(如2型糖尿病)治療，如體重降低、二甲雙胍(metformin)和噻唑烷 二酮(thiazolidinedionehNAFLD可被細分為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪 肝(NAFL) JASH是更嚴重類型的NAFLD，被認為是未知病因肝硬化的主要病因。
[0040] 患NAFLD的患者大多沒有或少有癥狀?；颊呖赡鼙г蛊凇⒉贿m和不明顯的右上角 腹部不適。有時也發(fā)生輕度黃疸，盡管這很少見。最通常地，NAFLD在血常規(guī)測試中通過異常 肝功能測試進行診斷。NAFLD與胰島素抵抗和代謝綜合征（肥胖、混合型高脂血癥、糖尿病 (11型)和尚血壓)有關。
[0041] 通常的發(fā)現(xiàn)是肝酶升高和顯示脂肪變性的肝臟超聲。超聲也可用于排除膽結石問 題(膽石病）。肝活組織檢查(組織檢查)是被廣泛接受為可明確將NASH與其他形式的肝病區(qū) 分開的唯一測試，可用于評估炎癥及所產(chǎn)生纖維變性的嚴重性。
[0042] 非酒精性脂肪肝
[0043]非酒精性脂肪肝(NAFL)是一類NAFLD，是一種肝細胞中脂肪蓄積的病癥。NAFL進展 為肝硬化的風險最小。單純的脂肪肝通常不損傷肝臟，而是一種可通過肝活組織檢查鑒定 出的病癥。單純的脂肪肝與任何其他的肝臟異常例如疤痕產(chǎn)生或炎癥無關。其在體重過大 或患有糖尿病的患者中是常見的發(fā)現(xiàn)。當脂肪達到肝臟的至少5%時，患者就具有脂肪肝。 [0044] 非酒精性脂肪性肝炎
[0045]非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一種通常"沉默"的常見肝病。NASH的主要特點是肝 臟中有脂肪，并伴有發(fā)炎和損傷。患有NASH的患者大多感覺良好，并沒有意識到他們的肝臟 有問題。盡管如此，NASH可能是嚴重的，并可能導致肝硬化，肝硬化的肝臟被永久性損傷，產(chǎn) 生疤痕，不能再正常工作。
[0046] 通常首先懷疑在包括在血常規(guī)測試項目中的肝臟測試中發(fā)現(xiàn)有例如丙氨酸轉氨 酶(ALT)或天冬氨酸轉氨酶(AST)升高的人患有NASH。當進一步的評估并沒有給出明顯理由 是肝病而當肝臟的X-射線或成像研究表明有脂肪時，就懷疑患有NASH。提供對NASH的確切 診斷并將其與單純的脂肪肝區(qū)分開的唯一方式就是肝活組織檢查。當從活組織檢查觀察到 有脂肪并伴隨有發(fā)炎和肝臟細胞損傷時，就診斷為NASH。如果組織有脂肪而沒有發(fā)炎和損 傷，就診斷為NAFL或NAFLD。目前，沒有血液測試或掃描能夠可靠地提供該信息。
[0047] 類二十烷酸
[0048]類二十烷酸是由20碳脂肪酸氧化產(chǎn)生的信號分子，所述20碳脂肪酸例如花生四烯 酸或其他的多不飽和脂肪酸(PUFA)。它們對許多機體系統(tǒng)施加復雜的控制，主要在身體活 動的過程中或之后的生長方面、攝入毒性物質和病原體后的炎癥或免疫方面，并且在中樞 神經(jīng)系統(tǒng)中作為信使。類二十烷酸包括前列腺素、環(huán)前列腺素、凝血囉烷、白三烯和其它的 由氧通過酶促或非酶促加成到PUFA上而形成的代謝物。
[0049] 類二十燒酸源自于omega-3( ω-3)或omega-6 ( ω-6)脂肪酸。一般而言，ω-6類二 十烷酸是促炎性的，而ω -3促炎性較弱，甚或可能是抗炎性的。這些脂肪在人的飲食中的含 量和平衡將影響人體的類二十烷酸控制的功能，對心血管疾病、甘油三脂、血壓和關節(jié)炎產(chǎn) 生影響。抗炎性藥物例如阿司匹林和其他NSAID通過下調(diào)類二十烷酸的合成來發(fā)揮作用。
[0050] 類二十烷酸有很多個亞家族，包括前列腺素如環(huán)前列腺素、凝血囉烷、脂氧素和白 三烯。每一種還有2或3個另外的系列，其源自于ω-3或CO-6EFA。這些系列的不同活性基本 解釋了 ω -3和ω -6脂肪酸的健康效應。
[0051] 多不飽和脂肪酸
[0052] 多不飽和脂肪酸(PUFA)是其骨架中含有多于一個雙鍵的脂肪酸。這個類別包括許 多重要的化合物，例如必需脂肪酸。多不飽和脂肪酸可根據(jù)其化學結構劃分為不同組:亞甲 基間隔的多烯、綴合的脂肪酸和其他PUFAWUFA包括除含20個碳(二十碳）的脂肪酸以外的 其他脂肪酸，例如，含18個碳的亞油酸和亞麻酸、含22個碳的二十二碳五烯酸(DPA)和二十 二碳六烯酸（DHA)，還包括花生四烯酸和其他20碳脂肪酸的代謝物，例如二十碳三烯酸 (ΕΤΑ)和二十碳五烯酸(ΕΡΑ)，這些代謝物源自于環(huán)氧合酶、脂肪氧合酶、細胞色素 Ρ450和非 酶促氧化。作用于花生四烯酸和其他PUFA以產(chǎn)生PUFA的酶的例子包括已知的⑶X、5-L0X、 12/15-L0X和CYP。PUFA還可進行非酶促氧化。
[0053] 游離類二十烷酸和PUFA代謝物的例子包括但不限于PGE2(前列腺素 E2)、dhk P⑶2 (13，14-二氫-15-酮前列腺素 D2)、四降12-HETE(2,3,4,5-四降12(R)-HETE)、15-HETE(15-羥基Y-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸）、11，12-diHETrE(11，12-二羥基-二十碳三烯酸）、 14，15-乜冊1'也（14，15-二羥基-5,8，11-二十碳三烯酸）、20-〇)0!144(20-羧基-花生四烯 酸）、9-oxoODE (9-氧代-十八碳二烯酸）、12，13Ep0ME (12 (13)-異白細胞毒素）、TxB2 (凝血β 烷Β2)、12-HHTrE (12-羥基-十七碳三烯酸）、11-ΗΕΤΕ (11-羥基-5Ζ，8Ζ，12Ε，14Ζ-二十碳四烯 酸）、5-HETE (5-羥基-6E-8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酸）、5，6-diHETrE (5，6-二羥基-8Z，11Z， 14Z-二十碳三烯酸）、14，15-diHETrE(14，15-二羥基-5，8，11 -二十碳三烯酸）、13-H0DE(13-羥基-十八碳二烯酸）、9-H0DE(9-羥基-十八碳二烯酸）、9，lOEpOMe、9，lOdiHOME(來自于可 溶性的環(huán)氧化物水解酶對（± ) 12，13-EpOME的開環(huán)的二醇）、12，13diH0ME、9-H0TrE、15-HETrE(15S-羥基-8Z，11Z，13E-二十碳三烯酸）、12-HEPE( 12-羥基-5，8，10，14，17-二十碳五 烯酸）、14HDoHE(14-羥基-二十二碳六烯酸）、16HDoHE( 16-羥基-二十二碳六烯酸）和19， 20DiHDPA( 19，20-二羥基-4Z，7Z，10Z，13Z，16Z二十二碳五烯酸）、血漿游離的亞油酸（LA)、 α-亞麻酸(ALA)、二十碳三烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及它們 源自于5-L0X、12/15-L0X和CYP的代謝物。
[0054]本發(fā)明還提供一種預測或評估被診斷患有肝病的患者的肝病進展風險的方法，所 述方法包括測量該患者血漿中一種或多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代 謝物的水平，其中，游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物升高或者由于轉化(可以包括氧化)成 不同的類二十烷酸或PUFA而導致其中一種或多種特定物質降低表示所述肝病進展風險提 高。一個方面，所述非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是非酒精性脂肪肝(NAFL)。在另一個方面，所 述NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
[0055]在一個特別有用的方面，本文證明分析血漿類二十烷酸可以區(qū)分NAFL和NASH。正 如下面的實施例中所闡述的那樣，若干類二十烷酸部分被鑒定出在正常與NAFL與NASH之間 明顯不同，與NAFL、正常對照相比，11，12-diHETrE、dkP⑶2和20-C00N AA在NASH患者中以劑 量依賴的方式大幅升高。該數(shù)據(jù)證明了 11，12_diHETrE、dkPGD2和20-C00N AA是用于非侵入 性診斷NASH的主要類二十烷酸候選生物標記物。
[0056]這些結果與以前報道的結果的不同之處在于其僅測量以游離形式存在且未經(jīng)Κ0Η 處理的代謝物。盡管游離類二十烷酸的水平比酯化為脂質的類二十烷酸低得多，但本方法 捕捉到多得多的代謝物，并允許了廣得多的分析策略。其還避免了某些類二十烷酸和PUFA 由于堿處理或酸處理而遭到破壞，而堿處理或酸處理是分析酯化為脂質的類二十烷酸中的 必需步驟。在NAFLD中，正常的脂代謝被打亂，導致升高水平的游離脂肪酸和甘油三酯合成。 已經(jīng)表明游離脂肪酸引起肝毒性，并且可以經(jīng)由許多機制刺激NAFL進展為NASH。它們可以 具有直接的細胞毒性，刺激肝細胞中產(chǎn)生炎性途徑。這些脂肪酸也充當炎性類二十烷酸的 前體。與該結果相一致，NAFL和NASH中許多游離PUFA的血漿水平一直比健康對照高（圖1和 2)〇
[0057]然而，在NAFL和NASH之間沒有區(qū)別，表明血漿游離脂肪酸是區(qū)分各階段NAFLD差的 標記物。與此相對，它們轉化成類二十烷酸可能構成疾病進展中的關鍵性機制，分析類二十 烷酸水平而不是脂肪酸水平可能是區(qū)分NAFL和NASH的有用的臨床工具。
[0058] 所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物可以選自于由PGE2、dhk PGD2、 四降12-HETE、15-HETE、ll，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20-C00HAA、9-oxo0DE和12， 13Ep0ME組成的組，或為其任意組合。在一個具體方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/ 或PUFA代謝物為11，12-diHETrE、dhk PGD2和/或20-C00H AA，或為其任意組合。在一個優(yōu)選 方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為dhk PGD2和20-C00H AA。在另一 個方面，所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物為20-C00H AA。
[0059] 本方法通過測量患者血漿樣品中一種或多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪 酸(PUFA)代謝物的水平予以實施。正如在此處所使用的那樣，術語"樣品"是指來自于患者 的任何生物樣品。例子包括但不限定于唾液、毛發(fā)、皮膚、組織、痰液、血液、血漿、血清、玻璃 體、腦脊液、尿、精液和細胞。
[0060] 正如進一步在實施例中詳細闡述的那樣，脂質提取于血漿樣品。首先測定提取的 脂質中的類二十烷酸和/或PUFA代謝物的特性和數(shù)量，然后與適當?shù)膶φ障啾容^。所述測定 可以通過任何適當?shù)闹|分析技術來進行，優(yōu)選高通量的脂質分析技術，例如光譜分析(例 如Cheng，et al·，Lipid ,46 G): 95-103(2011)中記載的 sulfo-phospho-vani 11 in(SPV)色 譜分析方法）。適于測量和定量脂質含量的其他分析方法是本領域技術人員已知的，包括但 不限于ELISA、NMR、UV-Vis或氣相-液相色譜、HPLC、UPLC和/或MS或RIA方法、基于酶的發(fā)色 方法。提取脂質也可以根據(jù)本領域已知的各種方法進行，包括Bligh and Dyer, Can J Biochem Physiol. ,37,911(1959)中記載的用于液體樣品的常規(guī)方法。
[0061] 對于肝病進展的一般性測定，獲得的值可與正常對照相比較。用于在被診斷患有 非酒精性肝病（NAFLD)的患者中區(qū)分非酒精性脂肪性肝炎（NASH)與非酒精性脂肪肝 (NAFL)，例如，用于測定NASH或肝硬化，和/或用于區(qū)分NASH和NAFL。對照可以包括正常對 照。相對于對照，游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物升高表示肝病進展風險提高和/或對 NASH的期望區(qū)分，據(jù)此可以相應地實施療法。在某些情況下，如果正常的代謝物被氧化或轉 化為另一種代謝物，則一種或多種類二十烷酸和/或PUFA可能降低。
[0062] 游離類二十烷酸和PUFA代謝物的水平表示為AUR0C(Area under Receiver Operating Characteristic Curve，受試者工作特征曲線下面積）。通過用穩(wěn)定的同位素稀 釋法測量游離類二十烷酸和PUFA代謝物的水平來測定AUR0C。簡而言之，將相同量的氘化內(nèi) 標加到每個樣品中和用于制作標準曲線的所有基準標準中。通過確定內(nèi)源性代謝物與匹配 的氘化內(nèi)標之間的比率來計算類二十烷酸和PUFA代謝物的水平。通過線性回歸，將比率轉 換為絕對量。使用包括卡方檢驗、t-檢驗和AUR0C在內(nèi)的統(tǒng)計分析來評估各類二十烷酸代謝 物的診斷測試性能和區(qū)分NAFL與NASH的能力。
[0063] 肝病進展風險提高用AUR0C值測定，所述AUR0C值約至少0.8，約至少0.9，約至少 0.95，約至少0.96，約至少0.97，約至少0.98，約至少0.99或1.0。
[0064] 本發(fā)明的各方面將在下面的實施例中進一步闡釋。但本發(fā)明的范圍不受這些實施 例的限定，而是由所附的權利要求書定義。
[0065] 實施例1 [0066]隊列人口統(tǒng)計學
[0067] 本研究中包括19名患NAFLD的患者（10個NAFL病例和9個NASH病例）和10名非-NAFLD的正常對照。詳細的基礎特征記載在表1中，包括人口統(tǒng)計學、身高體重指數(shù)、生化測 試、脂質譜分析、針對對照的MR I -PDFF和針對患NAFLD的患者的肝活組織檢查數(shù)據(jù)。非_ NAFLD對照更為年輕，BMI較低，血清ALT、AST、GGT、葡萄糖和胰島素水平均較低，如所期望的 那樣。除了血漿甘油三酯在患NASH的患者中稍高以外，例行的肝臟相關的代謝測試不能顯 著區(qū)分NAFL和NASH(表1)。與患NAFL的患者相比，患NASH的患者具有更嚴重的肝臟組織學， 且具有更大程度的脂肪變性、氣球樣變性、小葉炎癥和纖維變性。
[0068] 實施例2
[0069] PUFA和代謝物脂質組學譜分析
[0070]目前，還沒有以充分的特異性將NASH與其他脂肪肝狀態(tài)區(qū)分開的非侵入性生物標 記物。肝活組織檢查仍是用于可靠鑒別NAFL和NASH的基準，但該過程是侵入性的，并帶有一 定的風險。因此，臨床界非常需要開發(fā)出非侵入性的能夠準確表征和分級NAFLD的方案，因 為這為治療可選項和預后提供有價值的信息。炎癥和氧化應激促進疾病從具有相對良性結 局的脂肪變性進展為有肝硬化和肝細胞癌風險的NASH。在此，液相色譜和質譜用于分析和 定量循環(huán)中的生物活性脂質和脂質過氧化產(chǎn)物，所述生物活性脂質和脂質過氧化產(chǎn)物是 NASH患者肝臟發(fā)炎的特征。
[0071]在清楚表征的疑似患有NAFL或NASH并根據(jù)其肝活組織檢查評分進行分級的患者 隊列中建立了完整的類二十烷酸譜，并估計了源自于花生四烯酸(20:4ω6)和相關的多不 飽和脂肪酸(PUFA)的游離類二十烷酸的血漿水平(表1)，所述多不飽和脂肪酸(PUFA)包括 亞油酸（18:2 ω6)、α-亞麻酸（18:3 ω 3)、二高-γ-亞麻酸(20:3 ω 6)、二十碳五烯酸(20:5 ω 3)和二十二碳六烯酸(22:6 ω 3)。最初的類二十烷酸譜由我們的分析平臺可以可靠測量的 158個單獨的代謝物組成。其中，26個類二十烷酸以可測水平存在于對照、NAFL或NASH血漿 樣品中（表2)。這些介質(mediator)通過復雜的生物合成機制和多個修飾和降解途徑產(chǎn)生 (27)。如圖1和2所示，源自于所有3個主要酶促途徑的類二十烷酸以不同水平存在于對照、 NAFL和NASH樣品中，所述3個主要酶促途徑是環(huán)氧合酶途徑(C0X-1和C0X-2)、脂肪氧合酶途 徑（5-L0X、12-L0X和15-L0X)和細胞色素 P450 (CYP)途徑。源自于C0X的凝血囉烷B2 (TXB2)和 12-羥基-庚三烯酸（12HHTrE)--人血小板中的凝血曝烷合成酶產(chǎn)生的主要AA代謝物之 一--在對照樣品中檢測到低水平，但在NAFL和NASH樣品中均明顯更高；然而，在NAFL和 NASH之間沒有看到顯著性差異。與此相對，前列腺素 E2(PGE2)僅在NASH樣品中升高，而在對 照和NAFL之間沒有看到差異（圖1)。在任何樣品中都沒有測到前列腺素 D2(PGD2)，但降解產(chǎn) 物13，14-二氫-15-酮?602((11^?602)在嫩3!1中明顯高于在祖?1^值〈0.0011)或對照（？值〈 0.0002)中（圖1)。
[0072] 源自于L0X的代謝物在NAFLD中也升高。值得注意的是，盡管5-L0X、12/15L0X途徑 的源自于AA的產(chǎn)物似乎在NAFL中最高（圖1)，但源自于包括亞油酸、α-亞麻酸、二高-γ -亞 麻酸、ΕΡΑ和DHA在內(nèi)的相關PUFAS的代謝物通常在NASH中較高（圖2)。相似地，相對于健康對 照，CPY途徑的源自于AA的代謝物在NASH中顯著升高，但在NAFL中卻沒發(fā)生變化（圖1和2)。 特別是，相對于NAFL或對照，11，12-二羥基-二十碳三烯酸（11，12-diHETrE)和14，15-二羥 基-二十碳三烯酸（14,15-diHETrE)在NASH中顯著升高。這些代謝物是由水溶性的環(huán)氧化物 水解酶（sEH)作用于環(huán)氧二十碳三烯酸產(chǎn)生的，所述環(huán)氧二十碳三烯酸是CYP環(huán)氧化酶 (epoxygenase)途徑作用于初始底物AA產(chǎn)生的主要產(chǎn)物。許多生物作用均歸因于環(huán)氧二十 碳三烯酸，包括心肌保護性血管舒張、白細胞抗迀移性和抗炎作用。通過sEH將環(huán)氧化物轉 化為其對應的二醇降低了其功能水平，因此降低了相關的健康作用。相似地，據(jù)報道，20-羥 基二十碳四烯酸（20-HETE)具有重要的血管活性，所述20-羥基二十碳四烯酸是通過CYP羥 化酶途徑合成的AA代謝物。在血漿中沒有測到20-HETE，但在NASH樣品中發(fā)現(xiàn)了 20-羧基花 生四烯酸（20-C00N AA)持續(xù)升高，但當比較NAFL和NASH時，它在這一具體樣品系列中并沒 有達到統(tǒng)計學顯著性(表2) 20-HETE轉化為20-C00N AA是由CYP酶催化的，這導致其生物活 性降低。
[0073] 實施例3
[0074]鑒定作為檢測NASH的診斷工具的一組類二十烷酸
[0075]基于表2,發(fā)現(xiàn)9種生物標記物在評價NAFLD中是有意義的。用AUR0C評價其各自的 診斷測試性能，并記載在表3中。作為用于將NAFL與NASH區(qū)分開的單一生物標記物的最好候 選者是11，12s diHETrE，其AUR0C是1。此外，發(fā)現(xiàn)包括dkPGD2和20-C00N AA在內(nèi)的一個系列 的AUR0C為1。
[0076] 實施例4 [0077] 方法
[0078] 研究設計和參與者本研究是源自于前瞻性巢式病例對照(nested case-control) 研究的橫向分析法，該研究中包括3組患有經(jīng)活組織檢查確診為NAFLD (包括NASH和NAFL)的 獨特表型的患者和正常的非-NAFLD對照。所有的參與者來自于UCSD NAFLD研究診所并在 2011年1月至2012年11月之間看過?。?8-20)。所有的參與者均提供了書面知情同意書并經(jīng) 歷了詳細的標準化臨床研究采訪，包括藥物史、飲酒和飲酒量化史(使用Audi t-skinner問 卷調(diào)查）、體檢、身體測量、人體測量、空腹生化測試，并作了其他肝病病因的詳細排除(請參 見下面的選入和排除標準）。在臨床研究采訪的早晨收集空腹血漿樣品并貯存在_80°C的冷 凍機中，該冷凍機裝在UCSD NAFLD轉化研究單元內(nèi)。
[0079] 隊列描述本研究中包括的所有NAFLD病例均患有經(jīng)肝活組織檢查確診的NAFLD。活 組織檢查由并不知曉臨床數(shù)據(jù)、脂質組學和成像數(shù)據(jù)的有經(jīng)驗的肝病醫(yī)生來評分。NASH CRN組織學評分系統(tǒng)用于對活組織檢查進行評分。記錄所有患者的NAFLD活性評分(NAS)以 及纖維變性評分。NAS評分在0-8的范圍，是脂肪變性(0-3)、小葉炎癥(0-3)和肝細胞氣球樣 變性(0-2)的程度的總和。肝臟纖維變性在0到4的范圍，其中0是沒有纖維變性，4是肝硬化。
[0080] NASH定義下述患者被劃分為患有NASH:患有經(jīng)活組織檢查確診的NAFLD，具有顯著 的3區(qū)（zone-3)大泡狀脂肪變性和小葉炎癥以及存在典型的氣球樣變性。
[0081 ] NAFLD的選入和排除標準選入標準包括:在知情同意過程中年齡至少18歲、有能力 并愿意提供書面的知情同意書、最小的或沒有與NAFLD相一致的飲酒史(見排除標準)和在 肝活組織檢查90天內(nèi)收集血漿。排除標準包括臨床或組織學的酒精性肝病證據(jù):訪談之前 的2年內(nèi)的常規(guī)和過量飲酒被定義為男性每周飲酒超過14個飲酒單位或女性每周飲酒超過 7個飲酒單位。大約10g酒精相當于一個"飲酒"單位。一個單位相當于1盎司蒸餾酒、一罐12 盎司的啤酒或一瓶4盎司的葡萄酒，肝臟脂肪變性的次要病因包括以前的手術、減肥手術、 全腸道外營養(yǎng)、短腸綜合征、產(chǎn)生脂肪的藥物治療、特征在于血清中存在HBsAg的慢性乙肝 證據(jù)、特征在于血清中存在抗HCV或HCV RNA的慢性丙肝證據(jù)、其他肝病病因證據(jù)，例如 alpha-1-抗胰蛋白酶缺乏、Wilson病、糖原貯積病、β脂蛋白異常癥、已知的表型血色病、自 體免疫肝病、或藥物引起的肝臟損傷、或研究者認為可能干擾研究的伴隨的嚴重的潛在的 全身疾病。
[0082] 正常對照的定義本研究的新穎之處在于包含了獨特且清楚表征的非-NAFLD正常 對照組。通過采用MRI-PDFF的準確肝臟脂肪定量所得到的小于5%的脂肪含量，將參與者劃 分為正常的非-NAFLD(18,20)。肝活組織檢查對正常個體而言是不道德的。其他的非侵入性 測量例如超聲和計算機斷層成像不準確，且缺少靈敏度，尤其在肝脂肪含量在1-10%之間 時。因此，MRI-PDFF應用在本研究中，用于不存在肝臟脂肪變性的準確診斷(Noureddin et al.H印atologyUOlShSSiigSOhMRI-PDFF準確性高、靈敏、重現(xiàn)性好且精確。
[0083] 正常（非-NAFLD)對照隊列的選入和排除標準健康（非-NAFLD)對照組的選入標準 包括：（1)年齡大于18歲；（2)肝MRI-PDFF〈5% ;和(3)無已知的肝病史。排除標準包括：（1)年 齡小于18歲；（2)明顯的全身疾病；（3)不能進行MRI;和(4)可能患有肝病的證據(jù)，包括任何 以前的肝活組織檢查、陽性乙肝表面抗原、丙肝病毒RNA、或自體免疫血清、alpha-1抗胰蛋 白酶缺乏、血色病遺傳檢測、或低的血漿銅藍蛋白。
[0084]脂質提取在分別針對病例和對照的肝活組織檢查和MRI-TOFF 90天內(nèi)獲得用于脂 質組學譜分析的血漿樣品。所有的血漿樣品均儲存在-80°C，一旦解凍，立即用于如前所述 的游離脂肪酸和類二十烷酸分離。簡而言之，在50μ1血漿中摻入26種氘化內(nèi)標(分別購于 Cayman化學公司，Ann Arbor，ΜΙ)的混合物，并用10 %甲醇使體積達到lml。接著，通過在 Strata-X柱(Phenomenex，Torrance，CA)上的固相提取來純化樣品，使用由以下步驟組成的 活化過程：用3ml 100%甲醇再用3ml水連續(xù)洗滌。接著，類二十烷酸用lml 100%甲醇洗脫， 將洗脫物真空干燥并溶解在由60/40/0.02水/乙腈/乙酸= 60/40/0.02(v/v/v)組成的50μ1 緩沖液Α中，立即用于分析，分析過程如下:對于游離脂肪酸分析，在50μ1血漿中摻入氘化脂 肪酸標準品，并通過采用甲醇和異辛烷的選擇性提取來分離游離脂肪酸。如（Dumlao et al. (2011) ,1811:724)所述那樣，對提取的脂肪酸進行衍生化并用氣相色譜和質譜進行分 析。
[0085] 反相液相色譜和質譜通過液相色譜-質譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)來分析和定量血漿中 的類二十烷酸。簡而言之，用反相色譜分離類二十烷酸，反相色譜使用1.7uM 2.1x100mm BEH Shield色譜柱(Waters，Milford,ΜΑ)和Acquity UPLC系統(tǒng)(Waters，Milford,ΜΑ)。色譜 柱用緩沖液A平衡，5μ1樣品用自動取樣器注入。用以100%緩沖液A起始的步進梯度洗脫樣 品1分鐘，接著用50%緩沖液B(由50%乙腈、50異丙醇和0.02%乙酸組成)洗脫3分鐘，接下 來用100%緩沖液B洗脫1分鐘。液相色譜與lonDrive Turbo V離子源相連，用三級四極AB SCIEX 6500QTrap質譜儀(AB SCIEX，F(xiàn)ramingham，MA)進行質譜分析。使用陰離子模式和使 用最豐富和最特定的前體離子/產(chǎn)物離子轉換的多反應監(jiān)測(MRM)的電噴射離子化測量類 二十烷酸，以建立能夠檢測158個分析物和26個內(nèi)標的獲得方法。離子噴霧電壓在溫度550 °C下設為-4500V。以氮氣作為碰撞氣體實現(xiàn)了類二十烷酸前體離子的碰撞活化，且對各個 代謝物優(yōu)化了去簇電壓、入口電壓和碰撞能。通過將類二十烷酸的MRM信號和色譜保留時間 與純的標準品匹配來鑒定所述類二十烷酸。
[0086] 脂質定量類二十烷酸和游離脂肪酸通過穩(wěn)定的同位素稀釋法進行定量。簡而言 之，將相同量的氘化內(nèi)標加到每個樣品中和用于制作標準曲線的所有基準標準中。為了計 算樣品中類二十烷酸和游離脂肪酸的量，計算內(nèi)源性代謝物與匹配的氘化內(nèi)標之間的峰面 積的比率。通過對相同條件下獲得的標準曲線進行線性回歸分析，將比率轉換為絕對量。
[0087]統(tǒng)計分析卡方(x2)檢驗用于類別變量之間的比較，t_檢驗用于連續(xù)變量之間的比 較。我們檢測了正常對照、經(jīng)活組織檢查確診為輕度NAFL的患者和經(jīng)活組織檢查確診為 NASH的患者之間的血漿類二十烷酸譜的差別。最后，我們檢測了產(chǎn)生顯著性差異的9個生物 標記物作為將NAFL與NASH區(qū)分開的生物標記物的診斷準確性。認為雙尾檢驗的p值0.05有 統(tǒng)計學意義。使用343統(tǒng)計軟件包版本9.4(〇3^，％，343 1]1(3.)進行統(tǒng)計分析。
【主權項】
1. 一種預測或評估被診斷患有肝病的患者的肝病進展風險的基本上非侵入性的方法， 包括測量所述患者血漿樣品中一種或多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代 謝物的水平，其中游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物相比于正常對照的升高或降低表示增 加的所述肝病進展風險。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，包括：（a)從所述血漿樣品中提取脂質；（b)鑒定提取的 脂質中的所述類二十烷酸和/或PUFA代謝物；（c)對提取的脂質中的類二十烷酸和/或PUFA 代謝物的水平進行定量;和(d)將所測定的水平與正常對照中的水平相比較，其中游離類二 十烷酸和/或PUFA代謝物相比于所述對照的升高或降低表示增加的所述肝病進展風險。3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述肝病為非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其中所述NAFLD為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中獲得的結果被傳送給醫(yī)生。6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其中該醫(yī)生確認所述結果指示肝病進展，并相應地對所 述患者實施療法。7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物 選自于由PGE2、dhk P⑶2、四降 12-HETE、15-HETE、11，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20-C00H AA、9-oxoODE、12，13EpOME組成的組，或為其任意組合。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物 為11，12-乜冊1'也、(11^?602和/或20-〇)0!144，或為其任意組合。9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物 為dhk PGD2和20-C00H AA。10. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物為20-C00H AA。11. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物用AUROC測量。12. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述AUROC為約至少0.8。13. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述AUROC為約至少0.9。14. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述AUROC為約至少0.99。15. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述肝病進展風險是進展為肝硬化。16. -種在被診斷患有肝病的患者中將非酒精性脂肪性肝炎(NASH)區(qū)分于非酒精性脂 肪肝和非-非酒精性脂肪肝病的基本上非侵入性的方法，包括測量所述患者血漿中一種或 多種游離類二十烷酸和/或多不飽和脂肪酸(PUFA)代謝物的水平，其中所述一種或多種游 離類二十烷酸和/或PUFA代謝物水平的升高或降低表示所述患者患有NASH。17. 根據(jù)權利要求16所述的方法，包括：（a)從血漿樣品中提取脂質；（b)鑒定提取的脂 質中的所述類二十烷酸和/或PUFA代謝物；（c)對提取的脂質中的類二十烷酸和/或PUFA代 謝物的水平進行定量;和(d)將所測定的水平與被診斷患有肝病的患者的非酒精性脂肪肝 和非-非酒精性脂肪肝病中獲得的水平相比較并任選地進一步與正常對照相比較，其中，某 些游離類二十烷酸和/或PUFA代謝物相比于對照的升高或降低表示所述患者患有NASH。18. 根據(jù)權利要求16所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物選自于由 PGE2、dhk PGD2、四降 12-HETE、15-HETE、11，12-diHETrE、14，15-diHETrE、20- COOH AA、9-oxoODE、12，13EpOME組成的組，或為其任意組合。19. 根據(jù)權利要求18所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物為11，12-乜冊1'也、(11^?602和/或20-〇)0!144，或為其任意組合。20. 根據(jù)權利要求19所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物為dhk PGD2和20-C00H AA。21. 根據(jù)權利要求19所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物為20-C00H AA。22. 根據(jù)權利要求16所述的方法，其中所述一種或多種游離類二十烷酸和/或PUFA代謝 物用AUR0C測量。23. 根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述AUR0C為約至少0.8。24. 根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述AUR0C為約至少0.9。25. 根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述AUR0C為約至少0.99。
【文檔編號】G01N33/92GK105980861SQ201480067418
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年12月9日
【發(fā)明人】R·洛姆巴, O·昆亨伯杰, A·阿曼多, E·A·丹尼斯
【申請人】加利福尼亞大學董事會