人組織激肽釋放酶1熒光定量檢測試紙卡的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測人組織激肽釋放酶1(hK1)熒光定量檢測試紙卡及其相關(guān)抗體。本發(fā)明制備了多種單克隆抗體，并進(jìn)行配對篩選，獲得靈敏度及特異性均能滿足需求的抗體組合(A24及A32)；同時(shí)其方便大量生產(chǎn)，可滿足日后大規(guī)模臨床應(yīng)用的需求。對上述抗體組合進(jìn)行檢測體系的調(diào)試優(yōu)化工作，獲得操作簡便，靈敏度，特異性及相關(guān)檢測性能都較好的人組織激肽釋放酶1的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測卡。
【專利說明】
人組織激化釋放酶1黃光定量檢測試紙卡
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的設(shè)及檢測人組織激膚釋放酶1 OiKl)巧光 定量檢測試紙卡及其相關(guān)抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 屯、腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的主要慢性非傳染性疾病。其中冠屯、病及腦卒 中是世界上最常見的死亡原因。在我國，隨著人口的老齡化，W冠屯、病，腦卒中為代表的屯、 腦血管疾病的發(fā)病率，致死率及致殘率呈逐年上升的趨勢。但是，80%的腦卒中是可W預(yù)防 的。糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重危害糖尿病患者的生命質(zhì)量和醫(yī)療消費(fèi)質(zhì) 量。若不從循證醫(yī)學(xué)的高度采取積極的干預(yù)措施，糖尿病腎病就會(huì)在較短的時(shí)間內(nèi)發(fā)展為 不可逆轉(zhuǎn)的終末期腎病，嚴(yán)重威脅患者的生存壽命。因此，積極尋找有效的方法，早期診斷 腦卒中、糖尿病腎病W進(jìn)行有效的防護(hù)直接關(guān)系著患者的生命質(zhì)量及生存壽命。
[000引激膚釋放酶一激膚系統(tǒng)化allikrein-kinin system, KK巧又稱激膚系統(tǒng)，廣泛存 在于動(dòng)物體內(nèi)的多個(gè)系統(tǒng)，尤其是在屯、血管系統(tǒng)內(nèi)分布更為密集。該系統(tǒng)有廣泛生物學(xué)活 性，并且和凝血系統(tǒng)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)W及多種血管活性因子系統(tǒng)等存在密切的聯(lián) 系和交叉對話，共同維護(hù)人體多器官正常的生理機(jī)能和參與各種復(fù)雜的病理生理過程，具 有調(diào)節(jié)屯、血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)和葡萄糖代謝，舒張血管、參與炎癥反應(yīng)、疼痛刺激和休克反 應(yīng)。近年來關(guān)于激膚系統(tǒng)的臨床研究主要集中在屯、血管、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作 用。
[0004] 人組織激膚釋放酶是激膚系統(tǒng)最重要的組成部分，是一組分泌型絲氨酸蛋白酶， 包含15個(gè)成員。在所有已知的組織激膚釋放酶中，只有人組織激膚釋放酶1 (膜/腎激膚 釋放酶，Human kalIikrein l，hKl，KLKl，又稱激膚原酶，Kininogenase)能有效水解低分子 量激膚原（LMWK)，釋放具有活性的激膚，進(jìn)而發(fā)揮屯、血管系統(tǒng)及腎臟功能的調(diào)節(jié)作用?；A(chǔ) 研究表明，在多種高血壓動(dòng)物模型中已證實(shí)，hKl具有降低血壓，減輕腎臟和屯、臟肥大及纖 維化的作用；其在進(jìn)行屯、臟重塑，減輕腎臟損害，降低腦梗死發(fā)生率W及降低神經(jīng)損傷危害 等方面的作用。同時(shí)，通過外源性給藥的方法，亦證明了 hKl在防止中風(fēng)，屯、腦血管W及腎 臟疾病方面的作用。近些年來，進(jìn)一步的研究表明，MQ水平在人的屯、腦血管疾病的發(fā)生發(fā) 展的過程中具有重要的臨床意義，可能作為預(yù)測腦卒中發(fā)病率的指標(biāo)。MQ水平可預(yù)測腦卒 中的發(fā)病及五年無事件性生存率，可讓患者早期預(yù)防并采取相應(yīng)的措施，從而一定程度上 降低腦卒中的發(fā)生概率。另外，MQ較尿微量白蛋白排泄率可更早的診斷早期糖尿病腎病。 綜上可見，hKl的水平對于人的屯、腦血管疾病及糖尿病腎臟疾病具有重要的預(yù)測價(jià)值。因 此，準(zhǔn)確測定MQ的水平，在臨床及科研中均具有重要的意義。 陽0化]鑒于MQ在屯、腦血管疾病及糖尿病腎臟疾病中的治療及預(yù)測作用，制備MQ定量 檢測試劑盒具有重要臨床的應(yīng)用價(jià)值。國內(nèi)外已有MQ科研用定量檢測試劑盒：其中部分 試劑盒采用競爭法，抗體為多克隆抗體，其操作繁雜，計(jì)算繁瑣且易出現(xiàn)非特異性結(jié)合而導(dǎo) 致檢測結(jié)果誤差較大；部分試劑盒采用多克隆抗體的夾屯、法檢測模式，亦存在非特異性結(jié) 合的影響；另外一些試劑盒采用多克隆抗體及單克隆抗體的雙抗體夾屯、的模式，其檢測性 能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。雙抗體夾屯、法的檢測模式可有效避免上述問題。因此，多表位，高靈 敏度，特異性的抗體的制備是高質(zhì)量的人組織激膚釋放酶1定量檢測試劑盒的關(guān)鍵因素之 一。天然MQ存在多個(gè)糖基化位點(diǎn)，因而重組表達(dá)MQ在糖基化位點(diǎn)等其他構(gòu)象方面可能 與天然蛋白存在較大的差異。在特異性抗體篩選時(shí)采用重組MQ進(jìn)行篩選就會(huì)出現(xiàn)篩選的 特異性抗體不能有效識(shí)別天然MQ的問題。本發(fā)明采用人天然MQ進(jìn)行抗體的篩選工作， 可有效避免上述情況的發(fā)生，且已證實(shí)其與天然MQ的結(jié)合力。
[0006] 同時(shí)，為滿足市場的不同應(yīng)用需求，本發(fā)明制備了=種MQ定量檢測試劑盒：人組 織激膚釋放酶IELISA定量檢測試劑盒，可滿足一般小型綜合醫(yī)院的應(yīng)用需求，且日后可發(fā) 展升級為化學(xué)發(fā)光法定量檢測（全自動(dòng)），滿足大型綜合醫(yī)院的全自動(dòng)檢測的應(yīng)用需求。人 組織激膚釋放酶1膠體金定量檢測試紙卡及人組織激膚釋放酶1巧光定量檢測試紙卡，均 可滿足快速檢測及床邊檢測的需求。其中膠體金定量檢測法靈敏度和準(zhǔn)確度雖不如巧光定 量檢測法，但其使用方便易于推廣且成本較低，可基本滿足疾病指標(biāo)的定量檢測，適合于基 層醫(yī)療系統(tǒng)中的即時(shí)檢測。巧光定量具備更高的檢測靈敏度，適用于檢測要求較高的檢驗(yàn) 中屯、或大型醫(yī)院臨床科室的床邊診斷的應(yīng)用需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供能有效的、特異性結(jié)合人組織激膚釋放酶1的抗 體。更具體地說：
[0008] 本發(fā)明的第一目的在于提供兩種抗人組織激膚釋放酶1抗體。
[0009] 第一種抗人組織激膚釋放酶1抗體（A24)，
[0010] 其重鏈可變區(qū)含有W下的互補(bǔ)決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID NO :1所示的 HCDR1、如序列沈Q ID NO :2所示的HCDR2和/或如序列沈Q ID NO :3所示的HCDR3 ; W11] 化及其輕鏈可變區(qū)序列含有W下的互補(bǔ)決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID NO :4 所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID N0:6所示的LCDR3。
[0012] 優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體A24的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示， 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0013] 第二種抗人組織激膚釋放酶1抗體（A32)，
[0014] 其重鏈可變區(qū)含有W下的互補(bǔ)決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID NO :9所示的 HCDR1、如序列沈Q ID NO :10所示的HCDR2和/或如序列沈Q ID NO :11所示的HCDR3 ; 陽0巧]W及其輕鏈可變區(qū)序列含有W下的互補(bǔ)決定區(qū)：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 12所示的LCDRl、如序列沈Q ID NO : 13所示的LCDR2和/或如序列沈Q ID NO : 14所示的 LCDR3。
[0016] 優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體A32的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:15所示， 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0017] 本發(fā)明第二個(gè)目的是提供兩種單鏈抗體，所述單鏈抗體A24的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示；所述單鏈抗體A32的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。優(yōu)選的，所述單鏈 抗體A24、A32中不含由六個(gè)組氨酸構(gòu)成的HIS標(biāo)簽。
[0018] 本發(fā)明第=個(gè)目的是提供兩種編碼上述單鏈抗體的核巧酸序列，編碼單鏈抗體 A24的核巧酸序列如SEQ ID NO: 19所示，和編碼單鏈抗體A32的核巧酸序列如SEQ ID NO: 20所示。
[0019] 本發(fā)明第四個(gè)目的是提供一種含有上述核巧酸序列的表達(dá)載體。
[0020] 本發(fā)明第五個(gè)目的是提供一種含有上述表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。所屬宿主細(xì)胞 可W是大腸桿菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選為畢赤酵母。
[0021] 本發(fā)明第六個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)上述單鏈抗體的方法，包括：
[0022] 1)在合適的條件下培養(yǎng)上述重組宿主細(xì)胞表達(dá)抗體； 陽023] 2)然后從宿主細(xì)胞中純化、收集抗體。
[0024] 本發(fā)明的第屯個(gè)目的在于提供上述抗人組織激膚釋放酶1抗體在檢測人組織激 膚釋放酶1含量中的應(yīng)用。
[00巧]本發(fā)明的第八個(gè)目的在于提供一組可進(jìn)行配對并檢測人組織激膚釋放酶1的抗 體對組合；該抗體對組合的檢測靈敏度高，特異性好。
[00%] 本發(fā)明的第九個(gè)目的在于提供一種利用所述抗人組織激膚釋放酶1抗體檢測人 組織激膚釋放酶1的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒，包括包被了 A24或A32抗體的酶標(biāo)板、樣品 稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品、含有酶標(biāo)抗體A32或A24的檢測液、洗涂液、顯色液及終止液。其檢測步驟 主要包括：
[0027] (1)向包被A24或A32抗體的酶標(biāo)板中加入樣本稀釋液后，再加入樣本稀釋液稀釋 的標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照及血清或血漿等待檢樣本；
[0028] (2)加入樣本稀釋液稀釋的檢測液；
[0029] 做加入顯色液
[0030] (4)加入終止液并讀取OD值。
[0031] 所述酶標(biāo)抗體A32或A24是辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體A32或A24 (A32-HRP或 A24-HR巧或者堿性憐酸酶標(biāo)記的抗體A32或A24(A32-AP或A24-AP);所述標(biāo)準(zhǔn)品為中國倉 鼠卵巢細(xì)胞（CHO)表達(dá)重組人組織激膚釋放酶1的純化蛋白。
[0032] 本發(fā)明的第十個(gè)目的在于提供一種利用所述抗人組織激膚釋放酶1抗體檢測人 組織激膚釋放酶1的膠體金免疫層析定量檢測卡，包括樣品吸收墊、金標(biāo)墊、反應(yīng)膜和吸水 墊；所述金標(biāo)墊噴涂有膠體金顆粒標(biāo)記的抗體A32或A24,所述反應(yīng)膜上有檢測帶和質(zhì)控 帶，檢測帶位置包被有抗體A24或A32,質(zhì)控帶位置包被抗化S標(biāo)簽抗體或Protein L。
[0033] 本發(fā)明第十一個(gè)目的在于提供一種利用所述抗人組織激膚釋放酶1抗體檢測人 組織激膚釋放酶1的時(shí)間分辨免疫巧光層析定量檢測卡，包括樣品吸收墊、巧光微球墊、反 應(yīng)膜和吸水墊；所述巧光微球墊噴涂有巧光微球標(biāo)記的上述所述抗體A32或A24,所述反 應(yīng)膜上有檢測帶和質(zhì)控帶，檢測帶位置包被有上述所述抗體A24或A32,質(zhì)控帶位置包被抗 His標(biāo)簽抗體或Protein L。
[0034] 所述反應(yīng)膜優(yōu)選硝酸纖維素膜。所述抗化S標(biāo)簽抗體優(yōu)選鼠抗化S抗體。
[0035] 本發(fā)明制備了多種抗體，并進(jìn)行配對篩選，獲得靈敏度及特異性均能滿足需求的 抗體組合（A24及A32);同時(shí)其方便大量生產(chǎn)，可滿足日后大規(guī)模臨床應(yīng)用的需求。對上述 抗體組合進(jìn)行檢測體系的調(diào)試優(yōu)化工作，獲得操作簡便，靈敏度，特異性及相關(guān)檢測性能可 滿足臨床樣本檢測的人組織激膚釋放酶1的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒、人組織激膚釋放酶 1的膠體金免疫層析定量檢測卡及人組織激膚釋放酶1的時(shí)間分辨免疫巧光層析定量檢測 卡。
【附圖說明】
[0036] 圖1.抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因電泳圖。Lane 1為標(biāo)準(zhǔn)DNA，Lane 2為抗體A24 重鏈可變區(qū)DNA，Lane 3為抗體A24輕鏈可變區(qū)DNA，Lane 4為抗體A32重鏈可變區(qū)DNA， Lane 5為抗體A32輕鏈可變區(qū)DNA。
[0037] 圖2.單鏈抗體結(jié)構(gòu)示意圖。Vh表示重鏈可變區(qū)序列，V L表示輕鏈可變區(qū)序列，His 標(biāo)簽為六個(gè)組氨酸。
[003引圖3.單鏈抗體表達(dá)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖（a)為A24基因 PCR產(chǎn)物； 圖化）為A32基因 PCR產(chǎn)物。
[0039] 圖4.重組畢赤酵母菌株誘導(dǎo)表達(dá)上清培養(yǎng)液鑒定圖。圖4(a)為抗體A24重組畢 赤酵母菌株誘導(dǎo)表達(dá)上清培養(yǎng)液鑒定圖；圖4(b)為抗體A32重組畢赤酵母菌株誘導(dǎo)表達(dá)上 清培養(yǎng)液鑒定圖。上述左圖為SDS-PAGE電泳鑒定圖、右圖為Western blot鑒定圖。
[0040] 圖5.單鏈抗體純化效果圖（SDS-PAGE)。圖（a)為抗體A24,圖化）為抗體A32。
[0041] 圖6.抗體A24及A32的Western Blot鑒定圖。泳道1為尤瑞克林扣K);泳道2 為酵母表達(dá)MQ ;泳道3為大腸桿菌表達(dá)MQ ;泳道4為C冊表達(dá)MQ。圖（a)為A32抗體 Western Blot 結(jié)果；圖（b)為 A24 抗體 Western Blot 結(jié)果。
[00創(chuàng)圖7.本發(fā)明酶聯(lián)免疫檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)為蛋白濃度（ng/mL);縱 坐標(biāo)為檢測0D450 ;r表示檢測相關(guān)系數(shù)，為0. 99980322。
[0043] 圖8.本發(fā)明酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測特異性。橫坐標(biāo)為檢測物濃度（ng/mL);縱 坐標(biāo)為檢測OD值。UK表示尤瑞克林，是從人尿液中提取的人組織激膚釋放酶1 ;KLK2表示 人組織激膚釋放酶2 ;KLK3表示人組織激膚釋放酶3。
[0044] 圖9.本發(fā)明膠體金免疫層析定量檢測卡及時(shí)間分辨免疫巧光層析定量檢測卡結(jié) 構(gòu)示意圖。1為樣品墊、2為反應(yīng)膜、3為吸收墊、4為質(zhì)控線（C線）、5為檢測線燈線）、6 為金標(biāo)墊或巧光結(jié)合墊、7為PVC片材。
[0045] 圖10.本發(fā)明膠體金免疫層析定量檢測卡標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)為蛋白濃度（ng/ 血）；縱坐標(biāo)為T/C值；r2為0. 992。
[0046] 圖11.本發(fā)明時(shí)間分辨免疫巧光層析定量檢測卡標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)為蛋白濃 度（ng/mL);縱坐標(biāo)為檢測值；r2為0. 9952。
[0047] 圖12.時(shí)間分辨免疫巧光層析定量檢測與酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果相關(guān)性
【具體實(shí)施方式】 陽04引定義
[0049] "抗體"又稱免疫球蛋白，是一類由B淋己細(xì)胞分泌的大型Y形蛋白質(zhì)，能夠通過 Y形的其中兩個(gè)分叉頂端的互補(bǔ)位點(diǎn)（抗原結(jié)結(jié)合位）特異性結(jié)合祀抗原的免疫球蛋白分 子，所述祀抗原如蛋白質(zhì)、糖、多核巧酸、脂、多膚、小分子化合物等。
[0050] "單鏈抗體"（SCFv)指的是抗體的重鏈可變區(qū)（Vh)和輕鏈可變區(qū)（\)通過15~ 20個(gè)氨基酸短膚（linker)連接形成的單一鏈融合蛋白，用于連接的linker通常富含甘氨 酸和絲氨酸，W利于單鏈抗體的穩(wěn)定性與柔初性。連接方式可將\的N端連接至V H的C末 端，或者相反。盡管去除了恒定區(qū)并引入linker,單鏈抗體依然保留了抗體對抗原的特異 性，且其具有分子量小、穿透力強(qiáng)和抗原性弱等特點(diǎn)。
[0051] 互補(bǔ)決定區(qū)（complementarit^determining region, CDR)，也叫做高變區(qū)。成型 于抗體單體氨基酸的末端，是祀抗原與抗體結(jié)合的最關(guān)鍵區(qū)域，在免疫網(wǎng)絡(luò)理論中，每個(gè)抗 體的互補(bǔ)決定區(qū)又被稱為獨(dú)特型或者基因型。
[0052] W下實(shí)施例中所用標(biāo)準(zhǔn)品均為C冊系統(tǒng)表達(dá)重組MQ (Img/mU制備方法見專利 201310746269. X)
[0053] 實(shí)施例1.抗人組織激膚釋放酶1雜交瘤細(xì)胞株的制備 陽054] 1.動(dòng)物免疫 W55] W重組人組織激膚釋放酶1(中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)，制備方法見專利 201310746269.訝按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠（購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限 公司）。具體免疫情況參見《抗體制備與使用實(shí)驗(yàn)指南》。采用間接化ISA法跟蹤免疫小鼠 血清滴度，選取血清效價(jià)最高的免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn)。 [0056] 2.細(xì)胞融合 陽057] (1).脾臟細(xì)胞的制備
[0058] 將免疫小鼠，摘眼球取血，經(jīng)斷頸椎處死后置于75% (v/v)的酒精中浸泡10分鐘， 于無菌操作臺(tái)中取出其脾臟，置于細(xì)胞篩網(wǎng)中，充分研磨細(xì)胞，過篩網(wǎng)，用無菌1640培養(yǎng)基 (購自Gibco公司）離屯、洗涂數(shù)次后，重懸細(xì)胞W制成單細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)，備用。
[0059] (2).飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
[0060] 取8~10周齡的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球獲取陰性血清，經(jīng)斷頸椎處死后置 75% (v/v)酒精中浸泡10分鐘；無菌掲開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器將約IOmL 1640HT 培養(yǎng)基（購自SIGMA公司）注入小鼠腹腔，輕輕按摩腹部并吹打數(shù)次。吸取含有巨隧細(xì)胞 的培養(yǎng)基注入20% 1640HAT培養(yǎng)基中備用； 陽06U 取2~3周齡的雌性BALB/c小鼠一只，經(jīng)斷頸椎處死后置于75 % (v/v)酒精中浸 泡10分鐘；無菌取胸腺于細(xì)胞篩網(wǎng)中，研磨，過篩網(wǎng)，獲得胸腺細(xì)胞置于上述含有巨隧細(xì)胞 的20% 1640HAT培養(yǎng)基中，備用。 陽0創(chuàng) （3).細(xì)胞融合
[0063] 選擇處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0,收集并計(jì)數(shù)。取約IO8個(gè)上述脾 細(xì)胞與2 X IO7個(gè)上述SP2/0細(xì)胞株加入融合管中混合，100化pm離屯、10分鐘后棄上清（盡 量棄凈），將融合管置手掌上來回輕輕摩擦W使沉淀松散。60秒內(nèi)先慢后快地加入ImL預(yù)熱 的陽G1450(聚乙二醇1450,購自SIGMA公司），加入1640HT培養(yǎng)基30血終止，100化pm離 屯、10分鐘，去上清，輕輕摩擦使沉淀松散，加入步驟2所獲得的20%的1640HAT培養(yǎng)基中。
[0064] 將上述HAT培養(yǎng)基充分混勻后，W 200 y L/孔分裝至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37°C， 5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一周后用10% 1640HT培養(yǎng)基替換20% 1640HAT培養(yǎng)基，3 天后取上清進(jìn)行檢測。
[00化]3.抗人組織激膚釋放酶1特異性雜交瘤細(xì)胞株篩選
[0066] (1).檢測板的準(zhǔn)備：用CB包被液稀釋尤瑞克林0JK，購買于廣東天普生化醫(yī)藥公 司）至1 y g/mU包被96孔化ISA酶標(biāo)板，100 y L/孔，2~8°C包被過夜，洗涂一次拍干；含 2%酪蛋白的PBST緩沖液封閉（200uL/孔），37°C封閉2小時(shí)；拍干，備用。
[0067] 似.陽性克隆的篩選：將待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清lOOiiL/孔加入上述檢測板中，于 37°C作用30分鐘后洗涂并拍干，加入100 y L/孔的HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG,于37°C作用 30分鐘后洗涂并拍干，加入100 y L/孔的TMB顯色液，于37°C避光顯色15分鐘，每孔加入 50 y L的2M H2SO4終止反應(yīng)，并于0D450處讀取數(shù)值。陽性孔確定原則：0D450值/陰性對 照值>2.1。選取陽性克隆株進(jìn)行細(xì)胞克隆化篩選。經(jīng)過=至四輪的克隆化篩選后，單克 隆細(xì)胞株陽性率100%即確定為穩(wěn)定細(xì)胞株，對細(xì)胞株進(jìn)行定株。雜交瘤細(xì)胞株C24及C32 均具有較高的效價(jià)，遂后續(xù)進(jìn)一步對上述雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行抗體可變區(qū)序列測序分析。
[0068] 實(shí)施例2.雜交瘤細(xì)胞株抗體可變區(qū)序列的測定
[0069] 對上述雜交瘤細(xì)胞株C24及C32抗體可變區(qū)序列進(jìn)行測定。
[0070] a. RNA的提?。簠⒄占?xì)胞總RNA抽提試劑盒（購自Roche公司）說明書對上述雜 交瘤細(xì)胞株C24及C32進(jìn)行總RNA提取并立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；
[0071] b. RNA 反轉(zhuǎn)錄成為 DNA :參照 Hiermo Scientific Reverted First strand cDNA Synthesis Kit (購自化ermo公司）對上一步驟中所提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制得cDNA， 凍存于-20°C備用； 陽07引 C.可變區(qū)序列的PCR擴(kuò)增及回收：W上一步驟中所得CDNA為模板，W鼠 IgG亞型 單克隆抗體可變區(qū)序列通用引物為引物，對重鏈及輕鏈的可變區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收試劑盒（購自TIANGEN公司）進(jìn)行回收，見附圖1 ; 陽07引 d.可變區(qū)序列的克隆和序列測定：按照克隆載體PMD18-T kit(購自Takara公 司）說明書，將重鏈和輕鏈可變區(qū)基因分別與PMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌畑5a， 挑取陽性克隆，交由Invitrogen?公司進(jìn)行測序。
[0074] 測序得到雜交瘤細(xì)胞株C24的抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示、 輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示。Vbase2數(shù)據(jù)庫分析上述序列，其重鏈可變區(qū) 的各互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列分別是：如序列SEQ ID NO :1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO :2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :3所示的HCDR3 ;其輕鏈可變區(qū)的各互補(bǔ)決定 區(qū)的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO :4所示的LCDRl、如序列SEQ ID NO :5所示的LCDR2 和/或如序列SEQ ID NO :6所示的LCDR3。
[0075] 測序得到雜交瘤細(xì)胞株C32的抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示、 輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO :16所示。Vbase2數(shù)據(jù)庫分析上述序列，其重鏈可變 區(qū)的各互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列分別是：如序列SEQ ID NO :9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO :10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :11所示的HCDR3 ;其輕鏈可變區(qū)的各互補(bǔ)決 定區(qū)的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO : 12所示的LCDRl、如序列SEQ ID NO : 13所示的 LCDR2和/或如序列沈Q ID NO :14所示的LCDR3。
[0076] 實(shí)施例3.單鏈抗體的重組表達(dá)及純化
[0077] 根據(jù)實(shí)施例2中測序結(jié)果，分別將雜交瘤細(xì)胞株C24及C32的抗體重鏈及輕鏈可 變區(qū)之間加入連接膚（GGGG巧3,引入六個(gè)組氨酸，并將其全基因按照畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的 偏愛性進(jìn)行密碼子優(yōu)化的方法，進(jìn)行單鏈抗體的重組表達(dá)。所表達(dá)得到的抗體分別命名為 抗體A24和抗體A32,其結(jié)構(gòu)組成如附圖2所示。上述單鏈抗體的重組表達(dá)具有如下：
[0078] 1.融合蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 陽0巧]密碼子優(yōu)化后的抗體A24的基因序列如SEQ ID NO: 19所示、氨基酸序列如SEQ ID N0:17所示；密碼子優(yōu)化后的抗體A32的核巧酸序列如SEQ ID N0:20所示、氨基酸 序列如SEQ ID N0:18所示。將優(yōu)化后的抗體A24及A32全基因合成的片段上游引入 pPICZ a A載體中化Ol序列后DNA序列，下游引入甜al酶切位點(diǎn)，構(gòu)建到PMD19-T Simple Vector質(zhì)粒（購自Invitrogen公司）中，得到一種長期保存質(zhì)粒，質(zhì)粒記為pMD19-A24、 PMD19-A32。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中上游引物Pl為CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC GAC ;下游引物 P2為：AGCGGATAACAATTTCACACAGGA。常規(guī)PCR程序后，瓊脂糖凝膠電泳分析（附圖3)，顯 示兩種產(chǎn)物大小與預(yù)期大小（79化p、8(K)bp) -致。將PCR獲得基因產(chǎn)物回收純化后，采 用）(h〇U#R0146S，購自化W ^igland Biol油S 公司）和甜aU#R0145V,購自化W ^igland Biol油S公司）雙酶切，用T4連接酶連接到pPICZaA(V19520,購自Invitrogen)質(zhì)粒中， 轉(zhuǎn)化到D冊a感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Zeocin巧250-01，購自Invitrogen公司）的LB平板中 37°C培養(yǎng)過夜。第二天篩選陽性克隆菌測序，比對，與預(yù)期序列完全一致，即得到抗體A24 及A32的表達(dá)質(zhì)粒，分別記為pPICZ a -A24、pPICZ a -A24。
[0080] 2.融合蛋白基因在畢赤酵母宿主工程菌株的構(gòu)建、篩選及表達(dá)
[0081] 畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞、YPDS固體培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基：均購自 Invitrogen 公司。
[0082] 將pPICZ a -A24及pPICZ a -A32質(zhì)粒，用SacI限制性內(nèi)切酶酶切線性化。乙醇沉 淀后將線性化載體，分別電轉(zhuǎn)化進(jìn)入到X-33感受態(tài)酵母細(xì)胞，分別涂布到含有Zeocin的 YPDS固體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3-5天，就有陽性克隆產(chǎn)生。
[0083] 挑取上述獲得的單克隆于5mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至ODe。。= 2. 0~6. 0時(shí)， 取ImL保存菌種，并將剩余菌液重懸后轉(zhuǎn)移到BMMY中小量誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24h補(bǔ)加甲醇至 終濃度為1 % (v/v)。一周后，離屯、收集菌液上清，通過SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白免疫印跡 分析（Western blot)，觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)情況（附圖4) oWestern blot中一抗為抗HlS-hg 抗體化S-化g(2A8)Mouse mAb，M20001，購于艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司）。
[0084] 將上述獲得的A24及A32重組融合蛋白基因工程菌株分別接種于BMGY培養(yǎng)基中， 30°C，220巧m培養(yǎng)至菌體密度到ODe。。= 2. 0~6. 0,每隔24小時(shí)補(bǔ)加甲醇至終濃度為1. 0% (v/v)。一周后，收集發(fā)酵培養(yǎng)液。 陽0財(cái) 3.融合蛋白純化
[0086] 采用組氨酸標(biāo)簽親和柱純化抗體A24及抗體A32融合蛋白，預(yù)裝柱子選擇為 HisTrap HP，具體步驟如下：
[0087] (1)發(fā)酵液的除雜預(yù)處理：將上述表達(dá)得到抗體A24及A32融合蛋白發(fā)酵液 上清，離屯、收集上清，并加入結(jié)合緩沖液，使得上清終濃度為300mM化ClJOmM NaHzPCV IOmMImidazole,調(diào)抑7. 5,0. 45 Ji m 濾膜過濾。
[0088] (2)HisTrap HP親和柱純化：運(yùn)用全自動(dòng)智能蛋白純化系統(tǒng)（AKTA avantl50,購 自GE healcare公司）對預(yù)處理獲得的抗體A24及抗體A32融合蛋白發(fā)酵液進(jìn)行親和純 化，柱子為化sTrapHP(17-5248-02,購自GE healcare公司）。結(jié)合緩沖液為300mM化Cl, 20mM 化HzPCVlOmM Imidazole,抑7. 5,洗脫緩沖液為 SOOmM NaClJOmM 化HzPCVSOOmM Imidazole, pH7. 5。洗脫時(shí)進(jìn)行線性洗脫，并收集各個(gè)洗脫峰。通過SDS-PAGE電泳鑒定純 度，由附圖5可知，兩種純化后的蛋白純度均達(dá)到95% W上；合并符合要求的收集管，更換 緩沖液為PBS溶液并超濾濃縮（Img/ml)，過濾除菌于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0089] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，重組蛋白可W不帶標(biāo)簽，也可帶其他標(biāo)簽，也可加入其他形 式的連接膚。無論是否帶標(biāo)簽或者帶不同形式的標(biāo)簽都可采用Capto L純化。
[0090] 實(shí)施例4.抗體的性能評價(jià) W91] 1.抗體 A24 及 A32 的 Western blot 鑒定
[0092] a.聚丙締酷胺凝膠電泳：配置12%分離膠、5%濃縮膠，分別上樣標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、尤 瑞克林扣K)、畢赤酵母表達(dá)MQ、大腸桿菌表達(dá)hKl W及CHO系統(tǒng)表達(dá)MQ，恒壓下電泳1小 時(shí)；
[0093] b.轉(zhuǎn)膜：恒流（35mA/膜）條件下轉(zhuǎn)膜1小時(shí)，將兩塊聚丙締酷胺凝膠上的蛋白質(zhì) 分別轉(zhuǎn)移至兩張硝酸纖維素膜上?？捡R斯亮藍(lán)G250對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色， 觀察蛋白的殘留情況；
[0094] C.封閉：含5%脫脂奶的TBST緩沖液封閉（封閉液），4°C過夜；封閉后洗涂液 燈BST，詳見TaKaRa公司TBST buffer)洗涂一次，10分鐘； W95] d.抗原抗體反應(yīng)：封閉液稀釋（按1:400體積比）辣根過氧化物酶標(biāo)記 A24(A24-HRP，lmg/mU本公司采用經(jīng)典過艦酸鋼法標(biāo)記，下同）及辣根過氧化物酶標(biāo)記 A32 (A32-HRP，Img/mU本公司采用經(jīng)典過艦酸鋼法標(biāo)記，下同），分別加入上述兩張硝酸纖 維素膜中，室溫反應(yīng)1小時(shí)；TBST洗涂5次，每次10分鐘；
[0096] e.顯色及拍照：吸干硝酸纖維素膜上殘留液體，每張硝酸纖維素膜分別加入2血 穩(wěn)定型過氧化物酶溶液（ImL)與魯米諾/增強(qiáng)劑溶液（ImL)的混合液（購買于化ermo公 司），均勻潤濕硝酸纖維素膜的表面，室溫避光反應(yīng)一分鐘后于凝膠成像系統(tǒng)（購買于GE公 司）拍照，留取結(jié)果。
[0097] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（附圖6)表明，本發(fā)明兩種抗體均可與四種來源的MQ反應(yīng)，證明了本 發(fā)明兩種抗體的反應(yīng)性，且證明其與天然MQ均有較好的反應(yīng)。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，四種 來源MQ的分子量均與理論值相符：UK為天然此1，糖基化程度最高，故其分子量最大；大 腸桿菌表達(dá)hKl糖基化程度最低，故分子量最??；CHO系統(tǒng)表達(dá)hKl糖基化程度稍低于天然 蛋白但高于酵母表達(dá)MQ，故其分子量介于UK及酵母表達(dá)MQ之間。 陽09引 2.抗體A24及A32在ELISA檢測平臺(tái)的性能評價(jià)
[0099] 將上述制備例中抗體進(jìn)行配對組合，分別作為包被抗體或標(biāo)記抗體進(jìn)行配對檢測 標(biāo)準(zhǔn)品，檢測步驟如下：
[0100] 1)采用20mM PH7. 4的PB緩沖液將YO (非相關(guān)單鏈抗體，作為陰性對照，制備方法 參加
【申請人】在先申請：201410020156. 6)、A24或A32 (作為包被抗體）分別稀釋至8ug/mL， 分裝至酶標(biāo)板中（lOOuL/孔），4°C，過夜（16小時(shí)）；
[0101] 2)PBST(含 0. 05% Tween-20 的 20mM PB7. 4,下同）洗涂一次（200uL/ 孔）后拍 干； 陽10引如封閉液（含質(zhì)量體積比為2% BSA的PBST)封閉（200uL/孔），37°C，2小時(shí)；棄 去封閉液后拍干；
[0103] 4)樣本稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，至濃度（ng/mL)為200、100及0。分別將上述濃度溶 液加入至步驟3)獲得的包被有A24及A32的酶標(biāo)板中（lOOuL/孔），37°C反應(yīng)1小時(shí)；PBST 洗涂5次（200uL/孔）后拍干；
[0104] 5)按照1:2000體積比稀釋HRP標(biāo)記A24 (A24-HRP)或A32 (A32-HRP)(作為標(biāo)記抗 體）；向步驟4)所獲酶標(biāo)板中分別加入稀釋的A32-HRP或A24-HRP，37°C反應(yīng)30分鐘；PBST 洗涂5次后拍干； 陽105] 6)加入TMB顯色液（購買于湖州英創(chuàng)公司），IOOuL/孔，37°C反應(yīng)15分鐘； 陽1〇6] 7)加入2M H2SO4終止液，50uL/孔，立即于酶標(biāo)儀（購買于化ermo公司）讀取 孤450。 陽107] 結(jié)果如下表： 陽10引
陽109] 由上述結(jié)果可知，A32、A24組成的雙抗體夾屯、檢測系統(tǒng)可應(yīng)用于酶聯(lián)免疫檢測平 臺(tái)，且A24 (包被）-A32 (標(biāo)記），A32 (包被）-A24 (標(biāo)記）兩種配對均有較好的檢測效果。 與非相關(guān)抗體無非特異性反應(yīng)。
[0110] 3.抗體A24及A32在膠體金檢測平臺(tái)的評價(jià)
[0111] 用樣本稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至濃度為2(K)ng/ml，l(K)ng/ml，將運(yùn)兩個(gè)濃度和 0. 025mol/LpH7. 5的PBS分別添加50uL到膠體金檢測卡中（A24包被-A32標(biāo)記或A32包 被-A24標(biāo)記，具體制備參見實(shí)施例6)，IO-ISmin內(nèi)將檢測卡放在讀數(shù)儀上進(jìn)行檢測。檢測 結(jié)果如下： 陽112]
[0113] 上述結(jié)果可見，A32、A24組成的雙抗體夾屯、檢測系統(tǒng)可應(yīng)用于膠體金檢測平臺(tái)，且 A24 (包被）-A32 (標(biāo)記），A32 (包被）-A24 (標(biāo)記）兩種配對均有較好的檢測效果。
[0114] 4.抗體A24及A32在時(shí)間分辨巧光檢測平臺(tái)的評價(jià)
[0115] 用0. 025mol/L pH7. 5的PBS將A24或A32稀釋至Img/ml，劃線于硝酸纖維素膜 上；用0. 05mol/L P冊.0的棚酸緩沖液將時(shí)間分辨巧光微球標(biāo)記的A32或A24稀釋20倍， 噴點(diǎn)于結(jié)合墊上；按附圖9所示貼膜、切條、裝卡（具體制備參見實(shí)施例7)。將檢測卡分別 檢測濃度含量為200、l(K)ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品和0. 025mol/L pH7. 5的PBS，檢測結(jié)果如下： 陽116]
[0117] 由上述結(jié)果可知，A32、A24組成的雙抗體夾屯、檢測系統(tǒng)可應(yīng)用于時(shí)間分辨巧光檢 測平臺(tái)，且A24 (包被）-A32 (標(biāo)記），A32 (包被）-A24 (標(biāo)記）兩種配對均有較好的檢測效 果。
[0118] 實(shí)施例5.抗體A24及A32在酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒中的應(yīng)用
[0119] 本檢測方法采用雙抗體夾屯、法的原理。 陽120] 1.材料：
[0121] 包被緩沖液：0. 02M PH7. 4的PB緩沖液；封閉液：含2% BSA(質(zhì)量體積比，下同） 的PBST緩沖液；洗涂液：PBST緩沖液；樣本稀釋液：含1% BSA、0. 5%酪蛋白、5%山羊血 清、0. 02% Procline 300及0. 05% Tween-20的憐酸鹽緩沖液（PH7. 4);標(biāo)準(zhǔn)品：CH0系統(tǒng) 表達(dá)重組MQ (1111肖/111以制備方法見專利201310746269. X);顯色液：TMB (購買于湖州英創(chuàng)公 司）；終止液：2M H2SO4。 陽122] 2.儀器：
[0123] 酶標(biāo)儀（購買于化ermo公司），通用型微生物培養(yǎng)箱（購買于化ermo公司），全 自動(dòng)洗板機(jī)（購買于深圳匯松公司） 陽124] 3.方法：
[01巧](1)檢測板的制備：包被緩沖液將抗體A24稀釋至8ug/mL，IOOuL/孔加入至酶標(biāo) 板中，4°C放置過夜（16小時(shí)）；PBST洗涂一次后拍干；200uL/孔封閉液封閉，37°C放置2小 時(shí)后拍干，抽干過夜（16小時(shí)），侶錐袋真空包裝，4°C保存?zhèn)溆茫?陽126] (2)樣本稀釋液的制備：含1%BSA、0. 5%酪蛋白、5%山羊血清、0.02% Procline 300及0. 05% Tween-20的憐酸鹽緩沖液（20mM，PH7. 4)，按照上述成分比例配置樣本稀釋 液，于4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0127] (3)標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將IOuL標(biāo)準(zhǔn)品加入至19. 99血樣本稀釋液中，充分混勻后于 4 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0128] (4)檢測液的制備：將辣根過氧化物酶（HR巧偶聯(lián)至抗體A32 (A32-HRP，Img/ml); 將加 L A32-HRP加入至9. 995mL的樣本稀釋液中，充分混勻后于4°C保存?zhèn)溆?
[0129] 4.人激膚釋放酶1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法
[0130] (1)于4°C取出真空包裝的檢測酶標(biāo)板及相關(guān)試劑于室溫平衡后備用； 陽13U (2)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：將IOuL標(biāo)準(zhǔn)品加入至490uL樣本稀釋液中，充分混勻后即得 1〇11邑/血標(biāo)準(zhǔn)品溶液；將1〇11旨/血標(biāo)準(zhǔn)品溶液倍比稀釋，分別獲得終濃度（叫/111〇為5、2.5、 1. 25、0. 625、0. 3125、0. 15625及0. 078125的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；W樣本稀釋液為陰性對照，即 On邑/mL ; 陽132] (3)酶標(biāo)板中分別加入50uL/孔的樣本稀釋液；再向酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對 照W及待檢樣本巧Oul/孔）；37°C放置60分鐘；PBST洗涂5次后拍干； 陽13引 （4)檢測孔中加入檢測液，IOOuL/孔，37°C放置30分鐘；PBST洗涂5次后拍干； 陽134] 妨檢測孔中加入顯色液，IOOuL/孔，37°C放置15分鐘；
[0135] (6)檢測孔中加入終止液，50uL/孔，立即于酶標(biāo)儀讀取0D450。
[0136] 按照標(biāo)準(zhǔn)品各濃度對應(yīng)的0D450讀值，采用化rveExpert 1. 3軟件W濃度為橫坐 標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；將檢測樣本的OD值代入標(biāo)準(zhǔn) 曲線方程后計(jì)算出待檢樣本的濃度（ng/mL)。 陽137] 5.檢測性能評價(jià)：
[0138] 根據(jù)上述檢測條件進(jìn)行本發(fā)明所述檢測方法的性能評價(jià)。 陽139] (1)添加回收率：
[0140]回收率是驗(yàn)證檢測準(zhǔn)確性的指標(biāo)，遂本發(fā)明對基于A24及A32的檢測試劑盒進(jìn)行 添加回收率的驗(yàn)證。 陽141 ] 將20份血漿混合后獲得混合血漿，采用本發(fā)明的方法測量混合血漿B中的MQ含 量為Co;將濃度分別為Sng/血、2. Sng/血、1. 25ng/mL W及0. 625ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品（A液）加 入到混合血漿B中，所加入A液與血漿B之間的體積比為1:9,根據(jù)公式（1)計(jì)算出各個(gè)添 加量的回收率。
[0142]
...........................................................................(1) 陽143] 式中：R為回收率； 陽144] V為加入A液的體積； 陽145] V。為混合血漿樣本B的體積； 陽146] C為混合血漿樣本B加入A液后的檢測濃度；
[0147] C。為血漿樣本B的檢測濃度； 陽14引 Cs為A液的濃度。 陽149] 本發(fā)明檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線（附圖7)可見，該檢測具有良好的線性關(guān)系（r = 0. 99)且 具有高靈敏度（156pg/mL)及陰性本底值（OD = 0. 0525)。根據(jù)上述添加回收率計(jì)算方法， 計(jì)算結(jié)果見下表： 陽1加]
陽151] 表中可見，上述四個(gè)濃度添加回收率平均值為101. 17%，各濃度添加回收率與回 收率均值相差小于等于8. 29%，證明本檢測方法準(zhǔn)確性高。 陽152] 似特異性：
[0153] 經(jīng)蛋白序列比對可見，人組織激膚釋放酶1與人組織激膚釋放酶家族中的人組織 激膚釋放酶2化LK2)及人組織激膚釋放酶3化LK3)的同源性分別達(dá)到66%及60%，遂本實(shí) 驗(yàn)主要考察本發(fā)明所建立的檢測方法對KLK2及KLK3的檢測特異性。檢測方法如上所述， 分別加入樣本稀釋液梯度稀釋后的尤瑞克林扣K)，KLK2 (購買于R&D公司）及KLK3 (購買 于R&D公司），最終檢測該檢測方法的特異性。檢測結(jié)果（附圖8)可見，本發(fā)明所述的人組 織激膚釋放酶1酶聯(lián)免疫定量檢測法特異性好。 陽154] 做重復(fù)性
[0155] 將S份具有代表性的血漿樣本分別重復(fù)檢測10次，計(jì)算10次測量結(jié)果的平均值 M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，根據(jù)公式CV = SD/MX 100%得出變異系數(shù)CV，結(jié)果如下： 陽 156]
陽157] 上述結(jié)果可見，S份血漿檢測CV<10%，本發(fā)明ELISA檢測試劑盒具有較好的重復(fù) 性。
[0158] 6.本發(fā)明嘗試多種試劑盒制備方法，下表展示幾種不同制備方式（表中未列出的 步驟、參數(shù)等同本實(shí)施例所述）及相應(yīng)試劑盒的檢測性能。 陽 159]
[0160] 實(shí)施例6.抗人組織激膚釋放酶1的膠體金免疫檢測卡的制備 陽161] 1.膠體金的標(biāo)記
[0162] 抗體A32的膠體金標(biāo)記：用K2CO3調(diào)節(jié)膠體金抑值（每1ml膠體金中加入加 L 0. 2M K2CO3)，向膠體金溶液中緩慢加入W 0. 2M的PBS稀釋的抗體A32 (每1ml膠體金中加 入30ug抗體A32)，低速攬拌30分鐘；加入封閉液（1% BSA)至其終濃度為10% (質(zhì)量百 分比），攬拌20分鐘；靜置30min后1200化pm離屯、30min ;去上清用金標(biāo)抗體復(fù)溶液0.0 lM PB PH7. 4+1% BSA+0. 025% Tween 20巧％薦糖）復(fù)溶即得膠體金標(biāo)記的A32抗體。
[0163] 2.金標(biāo)墊及反應(yīng)膜制備
[0164] 將A32金標(biāo)抗體稀釋好后，噴涂在金標(biāo)墊6上，干燥備用；將抗體A24和抗化S標(biāo) 簽抗體分別用包被抗體稀釋液（3%甲醇巧5mM PBS緩沖液（pH7. 5))稀釋好后，分別包被在 反應(yīng)膜2 (硝酸纖維素膜）的T線5, C線4位置，干燥后備用。 陽1化]3.貼膜、切膜、組裝 陽166] 將樣品墊1、金標(biāo)墊6、包被有抗體的硝酸纖維素膜2、吸水墊3從左至右依次設(shè)置 (如圖9所示），且兩兩之間應(yīng)少許接觸，所述包被有抗體的硝酸纖維素膜的T線5在左、C 線4在右，并根據(jù)外殼大小進(jìn)行切割，裝入外殼，完成檢測卡制備。 陽167] 4.試劑盒組裝 陽16引將組裝好的檢測卡，干燥劑，滴管裝入侶錐袋中，熱封機(jī)封口，貼標(biāo)簽。
[0169] 5.抗人組織激膚釋放酶1的膠體金免疫檢測卡的使用方法
[0170] 1)樣本稀釋液（IOmM PH7. 4的PB緩沖液）恢復(fù)至室溫，震蕩混勻備用； 陽171] 2)檢測樣本稀釋：在潔凈的離屯、管加入1血樣本稀釋液，再精確吸取IOii L血清/ 血漿樣本，加入到離屯、管中，振蕩充分混勻。 陽172] 3)加樣及判讀：用移液槍吸取50 iiL稀釋后的樣本慢慢加入加樣孔中，開始計(jì)時(shí)， 10~15分鐘內(nèi)將檢測卡放置在讀數(shù)儀上進(jìn)行檢測，儀器將對檢測卡進(jìn)行掃描，并將結(jié)果顯 示在讀數(shù)儀的屏幕上。超過15min鐘判定，結(jié)果無效。 陽173] 6.抗人組織激膚釋放酶1的膠體金免疫檢測卡檢測效果評估
[0174] 1)線性范圍檢測 陽17引測定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（0. 125,0. 25,0. 5,1，2,4,8,16ng/ml)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線 性檢測范圍，結(jié)果如附圖10所示。檢測卡靈敏度為0. 125ng/ml。 陽176] 2)重復(fù)性檢測
[0177] 同一批次檢測卡對lng/ml、4ng/ml樣本進(jìn)行重復(fù)檢測10次，計(jì)算變異系數(shù)CV， 陽17引 CV =標(biāo)準(zhǔn)差SD/平均數(shù)MX 100% 陽 179]
[0180] 3)準(zhǔn)確度檢測（添加回收率） 陽181] 用于評估該檢測試劑盒準(zhǔn)確測定加入純分析物的能力。將混合血清分為體積相同 的3份，在其中2份中加入標(biāo)準(zhǔn)品，制成5ng/ml，1. 25ng/ml濃度的回收樣本，在另一份樣本 中加入同樣量的無被測物的PH7. 4的PB緩沖液，制成基礎(chǔ)樣本。 陽 182]
陽183] 7.除上述最優(yōu)制備方式外，本發(fā)明還嘗試了多種制備方案，例如下表的4種制備 例： 陽 184]
陽186] 實(shí)施例7.人組織激膚釋放酶1的時(shí)間分辨巧光免疫檢測卡的制備 陽187] 本檢測方法采用雙抗體夾屯、免疫層析法的原理。
[0188] 1、溶液配制 陽 189] 0. 05mol/L P冊.0 的棚酸緩沖液制備：取 0.1mol/L 的 HsBCyOml，用 0. 025mol/L 的 胞284〇7 ? 10&0調(diào)節(jié)抑至8.0,并定容至100ml，置于4。(：備用，有效期3個(gè)月。 陽190] 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC，購自SIGMA公司）溶液制備： 1. 5姐DC加入100mL去離子水，配成水溶液置于4°C備用，有效期3個(gè)月。 陽191] 封閉液的制備：含10% BSA(所述百分比均為質(zhì)量體積比），0. 05mol/L P冊.0的 棚酸緩沖液，用0. 22um濾膜過濾，置于4°C備用，有效期7天。 陽192] 巧光抗體稀釋液制備：含l%BSA，10%薦糖，0.025%吐溫-20,0.05mol/Lp冊.0 的棚酸緩沖液，用0. 22um膜過濾，置于4°C備用，有效期7天。 陽193] 包被抗體稀釋液制備：含1%薦糖，3%甲醇0. 025mol/L pH7. 5的PBS，用0. 22U膜 過濾，置于4°C備用，有效期7天。
[0194] 樣本稀釋液：含0. 1 % BSA，0. 025 %吐溫-20,0.0 l %安替比林，0. 02 % proclin300,0. 05mol/L P冊.0的棚酸緩沖液，10-30°C保存有效期1年。 陽195] 2、人組織激膚釋放酶1巧光檢測卡制備 陽196] 1)時(shí)間分辨巧光微球標(biāo)記 陽197] A32抗體標(biāo)記方法如下（W 500uL反應(yīng)體系為例）：加400uL棚酸緩沖溶液于2ml 離屯、管中，加入IOOuL濃度1 %粒徑200皿的空載巧光微球（購自Thermo公司），縱滿振蕩 混勻。再加入IOuLEDC溶液，室溫振蕩15min。14000;rpm 10°C離屯、lOmin，去上清，沉淀用 0. 5ml棚酸緩沖液溶解，超聲分散，功率100W，時(shí)間Imin (超聲3s間隔3s)。 陽19引活化后的微球中加入濃度Img/ml的A32抗體50uL，250r/min20°C恒溫震蕩反應(yīng) 2h;加入55uL封閉液，恒溫震蕩反應(yīng)地。14000巧m 10°C離屯、15min，洗涂2次，去上清，沉 淀用0. 5ml棚酸緩沖液溶解，最后一次離屯、后沉淀用巧光抗體稀釋液溶解并超聲分散，置 于4°C恒溫保存。 陽199] 2)巧光結(jié)合墊的噴點(diǎn) 陽200] A32抗體巧光結(jié)合墊噴點(diǎn)方法如下：用巧光抗體稀釋液將上述制備的A32巧光抗 體稀釋20倍，噴點(diǎn)于整條結(jié)合墊上。 陽201] 3)硝酸纖維素膜的包被 陽202] 硝酸纖維素膜包被方法如下：取0. 5ml濃度4mg/ml的A24抗體，加到5ml刻度離 屯、管中，加包被抗體稀釋液至1ml，包被于硝酸纖維素膜2的T線5位置。取0. 5ml濃度為 4mg/ml抗HIS抗體，加到離屯、管中，加包被抗體稀釋液至1ml，包被于硝酸纖維素膜2的C 線4位置。 陽20引 4)貼膜、切條、裝卡 陽204] 樣品墊1、巧光結(jié)合墊6、包被有A24抗體的硝酸纖維素膜（反應(yīng)膜）2、將吸水墊3 從左至右依次設(shè)置，且兩兩之間少許接觸，所述硝酸纖維素膜的T線5在左、C線4在右（如 附圖9所示），并根據(jù)卡殼大小進(jìn)行切割，裝入卡殼，完成檢測卡制備。 陽2〇引 W試劑盒組裝 陽206] 取侶錐袋和干燥劑；打開熱封機(jī)，預(yù)熱；將檢測卡、干燥劑裝入侶錐袋中；用熱封 機(jī)封好侶錐袋；貼上標(biāo)簽。 陽207]同時(shí)，
【申請人】也采用A24抗體做巧光標(biāo)記、采用A32抗體包被在硝酸纖維素膜（反 應(yīng)膜）2T線處，其余步驟、參數(shù)不變，進(jìn)行巧光檢測卡制備。 陽20引 3、人組織激膚釋放酶1巧光檢測卡的使用方法 陽209] 1)稀釋待測樣本：在潔凈的離屯、管加入1血樣本稀釋液，再精確吸取IOii L血清/ 血漿樣本，加入到離屯、管中，振蕩充分混勻。
[0210] 2)加樣及判讀：用移液槍吸取50 iiL稀釋后的樣本慢慢加入加樣孔中，開始計(jì)時(shí)， 10~15分鐘內(nèi)用巧光免疫層析儀定量判定結(jié)果。超過15分鐘判定，結(jié)果無效。 陽211] 4、人組織激膚釋放酶1巧光檢測卡檢測效果評估 陽21引 1)精密性：將A32 (包被）-A24 (標(biāo)記）檢測卡檢測0. 25、l、4ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品各25 次重復(fù)測定，剔除離群值后計(jì)算檢測卡精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S個(gè)濃度檢測結(jié)果變異系數(shù) CV<15%。
陽21引 陽214] 將八24(包| 表， 陽 215] 陽216] 2)檢測線性：將A32(包被）-A24(標(biāo)記）檢測卡檢測不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品：0.0625、 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、3211邑/1111，標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系（如附圖11)。檢測卡檢測靈 敏度為 〇.〇625ng/ml。
[0217] A24(包被）-A32(標(biāo)記）檢測卡靈敏度為0. 0625ng/ml。 陽21引 3)準(zhǔn)確度一回收率：將A32(包被）-A24(標(biāo)記）檢測卡檢測添加量分別為1、5、 20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測結(jié)果如下表。
陽 219] 陽220] 將A24(包導(dǎo) 表， 陽 221] 陽222] 5、準(zhǔn)確度方化子CLW : 陽223] 上述結(jié)果顯示A32 (包被）-A24 (標(biāo)記）的檢測卡性能較優(yōu)，因此將其作方法學(xué)比 對驗(yàn)證。選擇20份臨床病人標(biāo)本，按1到20的順序編號(hào)，用ELISA(實(shí)施例5制備）和巧 光檢測法同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照1，2, 3...... 18,19, 20, 20,19,18...... 3, 2,1的樣本順序進(jìn) 行測定。ELISA和巧光檢測法檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r2= 0. 98,說明巧光檢測法與化ISA檢 測結(jié)果有較好的相關(guān)性（如附圖12)。 陽224] 6、配方的對比：
[0225] 除上述最優(yōu)制備例1夕b
【申請人】還嘗試多種制備方案，例如下面5組檢測卡制備及 應(yīng)用結(jié)果如下表： 陽226]
[0227] 在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可W作出 各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說明性的 而非限制性的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人組織激肽釋放酶1的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測卡，包括樣品吸收墊、熒 光微球墊、反應(yīng)膜和吸水墊；所述熒光微球墊噴涂有熒光微球標(biāo)記的上述所述抗體A32或 A24,所述反應(yīng)膜上有檢測帶和質(zhì)控帶，檢測帶位置包被有上述所述抗體A24或A32 ;所述試 劑盒還含有樣本稀釋液； 所述抗體A24是抗人組織激肽釋放酶1抗體，包括： 重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補(bǔ)決定區(qū)：如序列SEQ ID N0:1所示的 HCDR1、如序列SEQ ID NO :2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :3所示的HCDR3 ; 以及其輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補(bǔ)決定區(qū)：如序列SEQ ID NO :4所示 的LCDR1、如序列SEQ ID NO :5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO :6所示的LCDR3 ; 所述抗體A32是抗人組織激肽釋放酶1抗體，包括： 重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補(bǔ)決定區(qū)：如序列SEQ ID N0:9所示的 HCDR1、如序列SEQ ID NO :10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :11所示的HCDR3 ; 以及其輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補(bǔ)決定區(qū)：如序列SEQ ID NO :12所示 的LCDR1、如序列SEQ ID NO :13所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO :14所示的LCDR3。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人組織激肽釋放酶1的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測卡， 其特征在于所述抗體A24重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列如SEQ ID NO:8所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人組織激肽釋放酶1的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測 卡，其特征是所述抗體A24為單鏈抗體，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗人組織激肽釋放酶1的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測 卡，其特征是所述抗體A24中不含由六個(gè)組氨酸構(gòu)成的HIS標(biāo)簽。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人組織激肽釋放酶1的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測 卡，其特征是所述抗體A32重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，輕鏈可變區(qū)的 氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人組織激肽釋放酶1的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測 卡，其特征是所述抗體A32為單鏈抗體，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗人組織激肽釋放酶1的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測 卡，其特征是所述抗體A32中不含由六個(gè)組氨酸構(gòu)成的HIS標(biāo)簽。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗人組織激肽釋放酶1的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢測 卡，其特征是所述樣本稀釋液：含〇. 1% BSA，0.025 %吐溫-20,0.01 %安替比林，0.02 % proclin300,0. 05mol/L ρΗ8· 0 的硼酸緩沖液。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗人組織激肽釋放酶1的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢 測卡，其特征是所述熒光微球標(biāo)記的抗體標(biāo)記時(shí)使用的封閉液是含10% BSA0. 05mol/L pH8. 0的硼酸緩沖液；熒光抗體稀釋液是含1% BSA、10%蔗糖、0. 025%吐溫-20、0. 05mol/ L pH8. 0的硼酸緩沖液。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗人組織激肽釋放酶1的時(shí)間分辨免疫熒光層析定量檢 測卡，其特征是檢測帶位置包被抗體包被抗體稀釋液含1 %蔗糖，3 %甲醇和0. 025mol/L ρΗ7· 5 的 PBS。
【文檔編號(hào)】G01N33/533GK105987997SQ201510050985
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月30日
【發(fā)明人】馬永, 時(shí)振華, 高云霞, 丁娜, 徐春林, 陳飛, 陳一飛
【申請人】江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司, 常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司