一種理氣舒心片hplc特征圖譜的構(gòu)建方法
【專利摘要】理氣舒心片特征圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1) 參照物溶液的制備：取柚皮苷精密稱定，加甲醇制成每的溶液，(2) 供試品溶液的制備：取理氣舒心片研細(xì)，精密稱定，精密加甲醇超聲處理補(bǔ)足減失甲醇，濾過(guò)；(3) 色譜條件設(shè)定；(4) 測(cè)定：精密吸取參照物溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀，得到理氣舒心片特征圖譜。本發(fā)明所建立的方法，能比較全面的反映所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，能有效表征其質(zhì)量，有利于全面控制產(chǎn)品質(zhì)量，克服了原質(zhì)量控制方法的片面性，是質(zhì)量控質(zhì)方法的有效補(bǔ)充。中藥特征圖譜技術(shù)是一種多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式，能夠全面、綜合地反映和控制中藥質(zhì)量。
【專利說(shuō)明】
一種理氣舒心片HPLC特征圖譜的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種中藥的質(zhì)量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中成藥理氣舒心片由當(dāng)歸、沉香、茯苓、木香、香附（醋制）、姜黃、莪術(shù)(醋制）、蒲 黃、佛手、五靈脂、陳皮、枳實(shí)(炒）、青皮(醋制）、枳殼(炒）、麥芽(炒）、香櫞、三棱(醋制）、丹 參等18味中草藥組成。本品主要功能為解肝郁，行氣滯，祛胸痹。用于氣滯血瘀癥冠心病，心 絞痛，心律不齊，氣短腹脹，胸悶心悸。目前所執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)收載于中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)： WS3-B-0827-91，標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)薄層鑒別及含量測(cè)定等質(zhì)量控制項(xiàng)，不利于有效監(jiān)控藥品的質(zhì)量 和療效。為提高理氣舒心片藥品質(zhì)量，前期已經(jīng)對(duì)全方進(jìn)行質(zhì)量控制方法研究，但因中藥復(fù) 方制劑藥味多，成分復(fù)雜相互干擾不易有效檢測(cè)等特點(diǎn)，方中只有幾中藥味能建立起專屬 性強(qiáng)的定性定量檢測(cè)方法，不能全面監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量，目前還沒查到有關(guān)理氣舒心片的質(zhì)量 研究和標(biāo)準(zhǔn)提升相關(guān)文獻(xiàn)資料。
[0003] 中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床用藥的主要形式，其質(zhì)量是臨床療效的關(guān)鍵。如何建立科學(xué) 合理的、體現(xiàn)中藥復(fù)方特點(diǎn)的質(zhì)量控制方法就顯得尤為重要，而中藥復(fù)方質(zhì)量控制方法一 直是中藥科研領(lǐng)域熱點(diǎn)研究方向之一。如何科學(xué)合理選定質(zhì)量控制的特征有效指標(biāo)性成 分，對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，是建立中藥復(fù)方質(zhì)量控制方法的關(guān)鍵所在。因此，本 發(fā)明中我們對(duì)理氣舒心片進(jìn)行了特征圖譜試驗(yàn)研究，建立了特征圖譜測(cè)定方法，并對(duì)建立 方法進(jìn)行了重復(fù)性、精密度等方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明方法穩(wěn)定可行?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不利于有 效控制藥品的質(zhì)量和療效，目前還沒查到有關(guān)理氣舒心片的質(zhì)量研究和標(biāo)準(zhǔn)提升相關(guān)文獻(xiàn) 資料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一是提供理氣舒心片HPLC特征圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0005] (1)參照物溶液的制備:取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每lml含100 ~300yg的溶液，即得。
[0006] (2)供試品溶液的制備：取理氣舒心片研細(xì)，取約1~3g，精密稱定，精密加入60~ 80%的甲醇12.5~50ml，稱定重量，超聲處理10~30分鐘，放冷，用60~80%甲醇補(bǔ)足減失 的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；
[0007] (3)色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相為乙腈-0.1 %磷 酸溶液3-70:97-30的梯度混合溶液;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為286nm;流速為1.0ml/min;
[0008] (4)測(cè)定:精密吸取參照物溶液和供試品溶液各ΙΟμΙ，注入高效液相色譜儀，照高 效液相色譜法測(cè)定，得到理氣舒心片特征圖譜。
[0009] (5)方法學(xué)考察
[0010] 精密度試驗(yàn):取理氣舒心片，按步驟(2)方法制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，依法 檢測(cè)。結(jié)果，5次測(cè)定特征圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0~0.11%，表明儀器精 密度良好。
[0011] 穩(wěn)定性試驗(yàn):取理氣舒心片，按步驟(2)方法制成供試品溶液，分別在0、4、8、12小 時(shí)依法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:4次測(cè)定特征圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0~0.62%， 表明供試品溶液在12小時(shí)之間穩(wěn)定。
[0012] 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批理氣舒心片，按步驟（2)方法制備6份供試品溶液，依法測(cè) 定。結(jié)果，6次測(cè)定特征圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0~0.51 %，表明方法的重 復(fù)性較好。
[0013] 優(yōu)選地，步驟(1)所述參照物溶液的濃度為每lml甲醇含200yg對(duì)照品。
[0014]優(yōu)選地，步驟(2)所述供試品溶液的制備步驟如下：取理氣舒心片研細(xì)，取約2g，精 密稱定，精密加入70 %的甲醇25ml，稱定重量，超聲處理20分鐘，放冷，用70 %甲醇補(bǔ)足減失 的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；
[0015] 優(yōu)選地，步驟⑶所述流動(dòng)相為乙腈-0.1 %磷酸溶液3-70:97-30的梯度混合溶 液。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，理氣舒心片流動(dòng)相洗脫梯度如表1所示：
[0017] 表1理氣舒心片特征圖譜流動(dòng)相梯度
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供理氣舒心片的HPLC對(duì)照特征圖譜的構(gòu)建方法，按照前 述方法構(gòu)建10批理氣舒心片HPLC特征圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件生 成由10個(gè)共有峰構(gòu)成的理氣舒心片HPLC對(duì)照特征圖譜，共有峰中第5號(hào)峰為柚皮苷峰，第6 號(hào)峰為橙皮苷峰，第7號(hào)峰為新橙皮苷峰，第8號(hào)峰為丹酚酸B峰。
[0020] 在對(duì)照特征圖譜中，以柚皮苷峰為參照峰S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí) 間，所述相對(duì)保留時(shí)間在規(guī)定值的±5%之內(nèi)，所述規(guī)定值分別為：0.22-峰1、0.28-峰2、 0·66-峰3、0·96-峰4、1·00-峰5、1·03-峰6、1·07-峰7、1·20-峰8、1·58-峰9、1·64-峰10。 [0021]取理氣舒心片樣品，按上述同法操作，得到理氣舒心片樣品特征圖譜，采用中藥色 譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件對(duì)理氣舒心片的對(duì)照物征圖譜和樣品指紋圖譜進(jìn)行分析， 相似度大于〇. 90為合格產(chǎn)品。
[0022]本發(fā)明的有益效果如下：
[0023] (1)本發(fā)明的質(zhì)量檢測(cè)方法能有效地監(jiān)控理氣舒心片的質(zhì)量，保證其質(zhì)量的穩(wěn)定、 可控。具有方法簡(jiǎn)便，精密度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，能有效表征理氣舒心片中特征性成分，有 利于監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量。
[0024] (2)本發(fā)明的方法以柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷為對(duì)照品，建立的理氣舒心片HPLC 對(duì)照特征圖譜注重各個(gè)特征峰的前后順序和相互關(guān)系，注重整體面貌特征有利于全面監(jiān)控 產(chǎn)品的質(zhì)量，為藥品的質(zhì)量檢測(cè)提供可靠的依據(jù)。
[0025] (3)本發(fā)明的最佳紫外吸收波長(zhǎng)為286nm。采用本發(fā)明中方法用DAD檢測(cè)器對(duì)理氣 舒心片進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)三維掃描圖中所有色譜峰出現(xiàn)最大吸收的檢測(cè)波長(zhǎng)結(jié)果分別調(diào)取各 波長(zhǎng)下色譜圖，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為286時(shí)，特征峰數(shù)目較多，各峰面積較高且各特征峰之間分離 效果也最好。
[0026] 本發(fā)明所建立的方法，能比較全面的反映所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，能有效表 征其質(zhì)量，有利于全面控制產(chǎn)品質(zhì)量，克服了原質(zhì)量控制方法的片面性，是質(zhì)量控質(zhì)方法的 有效補(bǔ)充。中藥特征圖譜技術(shù)是一種多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式，能夠全面、綜合地反映和控制 中藥質(zhì)量，值得推廣并應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為理氣舒心片HPLC特征圖譜；
[0028]圖2為理氣舒心片的10批次原始特征圖譜；
[0029]圖3為理氣舒心片的對(duì)照特征圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1構(gòu)建理氣舒心片的HPLC特征圖譜 [0031] 1.儀器、試藥
[0032] 1.1儀器:安捷倫1200高效液相色譜儀;戴安雙三元高效液相色譜儀;MS205DU型分 析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(5μπι，4.6 X 250mm)〇
[0033] 1.2試藥:柚皮苷對(duì)照品、橙皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品、丹酚酸B對(duì)照品（購(gòu)于國(guó) 食品藥品檢定研究院）。甲醇為分析純，乙腈、磷酸均為色譜純，水為純化水。
[0034] 2.方法
[0035] 2.1參照物溶液的制備:取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每lml含200μ g的溶液，即得。
[0036] 2.2供試品溶液的制備:取理氣舒心片研細(xì)，取約2g，精密稱定，精密加入70%的甲 醇25ml，稱定重量，超聲處理20分鐘，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即 得；
[0037] 2.3色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相為乙腈-0.1 %磷 酸溶液按表1中規(guī)定梯度進(jìn)行洗脫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為286nm;流速為1.0ml/min;理論板數(shù)按 柚皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于100000。
[0038] 2.4測(cè)定:精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各ΙΟμΙ，注入高效液相色譜儀，照高 效液相色譜法測(cè)定，得到特征圖譜，如圖1所示。
[0039] 實(shí)施例2構(gòu)建理氣舒心片的HPLC對(duì)照特征圖譜
[0040]取理氣舒心片10批次(A公司8批、B公司1批、C公司1批），按實(shí)施例1條件進(jìn)行檢測(cè)， 得10批次樣品的HPLC圖譜，如圖2所示。通過(guò)10批HPLC圖譜的比較，采用中國(guó)藥典委員會(huì)推 薦的《中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件對(duì)HPLC圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有特征 峰，得到理氣舒心片對(duì)照特征圖譜。
[0041]在理氣舒心片對(duì)照特征圖譜中含有10個(gè)共有特征峰，其中參照峰為柚皮苷（5號(hào) 峰)。
[0042]相似度評(píng)價(jià)：以《中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件分析，計(jì)算供試品特征 圖譜與對(duì)照特征圖譜的相似度，結(jié)果均大于0.90。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表2。
[0043]表2HPLC特征圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果
[0045]通過(guò)上述方法所建立的理氣舒心片HPLC對(duì)照特征圖譜如圖3所示。
[0046]實(shí)施例3理氣舒心片的質(zhì)量檢測(cè)方法
[0047] 取7批理氣舒心片樣品(Α公司3批、Β公司1批、C公司1批、D公司1批、Ε公司1批)按實(shí) 施例1的條件同法操作，得到理氣舒心片樣品特征圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià) 系統(tǒng)軟件對(duì)理氣舒心片對(duì)照特征圖譜和樣品特征圖譜進(jìn)行分析，相似度大于0.90為合格產(chǎn) 品。
[0048] 檢測(cè)結(jié)果表明，Α公司、Β公司、C公司樣品為合格樣品，D公司、Ε公司樣品為不合格 樣品。
[0049] 綜上所述，本發(fā)明質(zhì)量檢測(cè)方法的穩(wěn)定性好、重復(fù)性好，因此，本發(fā)明的技術(shù)方案 具有可行性。利用本發(fā)明質(zhì)量檢測(cè)方法檢測(cè)合格的理氣舒心片，藥效確切，作用穩(wěn)定。以下 利用實(shí)驗(yàn)例具體說(shuō)明。
[0050] 實(shí)施例4藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0051 ] 1.實(shí)驗(yàn)材料
[0052] 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0053] 大鼠250 士 20g，ICR小鼠20 士 2g，來(lái)源:吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格 證號(hào)：SCXK(吉）2014-0003。
[0054] 1.2實(shí)驗(yàn)儀器、試劑
[0055] BL-410生物信號(hào)采集系統(tǒng)：購(gòu)自成都泰盟有限公司；300、1?^、0(、0)!^31'試劑盒 購(gòu)于南京建成生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
[0056] 1.3實(shí)驗(yàn)藥品：
[0057]實(shí)驗(yàn)所用對(duì)照藥A為利用本發(fā)明質(zhì)量檢測(cè)方法檢測(cè)合格的理氣舒心片，對(duì)照藥E為 利用本發(fā)明質(zhì)量檢測(cè)方法檢測(cè)不合格的理氣舒心片。
[0058] 1.4劑量設(shè)計(jì)
[0059]理氣舒心片臨床給藥劑量為17.622g(生藥)/日/人，本實(shí)驗(yàn)采用臨床的2倍劑量進(jìn) 行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)比較，即折合大鼠實(shí)驗(yàn)劑量為：3.2g(生藥)/kg，小鼠實(shí)驗(yàn)劑量為：4.6g(生 藥)/kg。
[0060] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0061 ] 2.1對(duì)大鼠急性心肌缺血的作用
[0062] Wistar雄性大鼠50只，隨機(jī)分為5組，分別是假手術(shù)組，模型組，陽(yáng)性藥銀杏葉組， 理氣舒心片對(duì)照藥A、理氣舒心片對(duì)照藥E。每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7天。最后一次給藥 后30min，腹腔注射3 %的戊巴比妥鈉（lml/kg)麻醉動(dòng)物，將動(dòng)物仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，頸 部去毛，75%酒精消毒，沿胸骨上窩上正中切開皮膚約0.5cm，鈍性分離推開下頌下腺，分離 氣管前肌肉，使氣管充分暴露。于第2~3氣管環(huán)間行氣管橫行切開，切口長(zhǎng)度不超過(guò)氣管周 徑的1/3，清理氣管內(nèi)容物，迅速插入氣管插管，深度為0.5~lcm。連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸 頻率90次/min，潮氣量10~12ml，呼吸比為1:2。左前胸去毛，75%酒精消毒，胸骨左緣切開 皮膚，長(zhǎng)約2cm，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，在第4~5肋間開胸，拉鉤擴(kuò)胸，鈍性去除心包 膜，暴露心臟，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳下2~3_處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，迅速把心臟放回 胸腔，擠出胸腔內(nèi)的氣體，縫合胸壁。假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)操作基本相同，只是在冠狀動(dòng)脈左前降 支處穿線而不結(jié)扎。術(shù)后6h，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，3000rmp/min離心10min制備血清，用于檢測(cè) SOD，MDA，CK，LDH，AST。
[0063] 采血后，迅速取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水，除去血污，剔除多余的脂肪等非心肌 組織。-20°C保持過(guò)夜，次日取出從心尖到心基底部平行切成5片，置于0.025%TTC溶液中， 在37°C水浴中孵育15min，此過(guò)程要不斷晃動(dòng)染色液，使之充分的接觸心肌組織。取出后立 即用生理鹽水沖洗到多余的染料。通過(guò)BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算梗死面 積。
[0064] 將沖洗干凈的心臟10 %的中性甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋，固定，切片，二甲苯 脫蠟，梯度酒精脫水，HE染色，中性樹脂封片等步驟。觀察大鼠心肌組織的形態(tài)學(xué)改變。
[0065] 結(jié)果：
[0066] 1 ·對(duì)大鼠血清SOD、MDA的影響
[0067] SOD、MDA測(cè)定結(jié)果模型組SOD活力有降低，MDA含量有增加，與假手術(shù)組比較有顯著 差異(p〈0.001);陽(yáng)性藥銀杏葉組S0D活力有升高，MDA含量明顯降低，與模型組比較有顯著 差異(p〈0.001)，理氣舒心片對(duì)照藥A S0D含量有明顯增加，MDA含量明顯降低，與模型組比 較有顯著差異(P〈〇.01)，對(duì)照藥對(duì)照藥ES0D活力有升高，與模型組比較比較有顯著差異(p〈 0.05)，MDA含量降低，但與模型組比較無(wú)顯著性差異。見表3。
[0068] 表3對(duì)大鼠血清SOD、MDA的影響（X 土 S)
[0070] 與假手術(shù)組比較#p〈0 · 01、林*p〈0 · 001，；與模型組比較#p〈0 · 05，##p〈0 · 01，###p〈 0.001
[0071] 2 ·對(duì)大鼠血清CK、LDH、AST的影響
[0072] CK、LDH、AST測(cè)定結(jié)果模型組CK、LDH、AST含量明顯增加，與假手術(shù)組比較具有顯著 差異（？〈0.001)。理氣舒心片對(duì)照藥厶0(、1^!^31'釋放增加，與模型組比較具有差異(？〈 0.05、p〈0.01);對(duì)照藥ECK釋放均有增加，與模型組比較有顯著性差異(p〈0.05)，LDH、AST與 模型組比較無(wú)顯著性差異。見表4。
[0073] 表4對(duì)大鼠血清CK、LDH、AST的影響（X 土 S)
[0075] 與假手術(shù)組比較*林p〈0 · 001;與模型組比較#ρ〈0 · 05、##p〈0 · 01
[0076] 3.對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響
[0077] 大鼠心肌梗死面積測(cè)定結(jié)果正常組未見心肌缺血，模型組心肌缺血最為嚴(yán)重，理 氣舒心片對(duì)照藥A心肌梗死面積最輕，好于理氣舒心片對(duì)照藥E，見表5。
[0078] 表5各組大鼠心肌梗死面積百分比
[0080] 2.2對(duì)大鼠心律失常的影響
[0081] Wistar大鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，分別是模型組，陽(yáng)性藥銀杏葉組，理氣 舒心片對(duì)照藥A、理氣舒心片對(duì)照藥E。每天灌胃給藥1次，連續(xù)7天，模型對(duì)照組給予等容積 CMC。各組大鼠于實(shí)驗(yàn)前12h禁食，不禁水。最后一次給藥lh后，腹腔注射10%的水合氯醛麻 醉。大鼠仰臥固定，以BL-410生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄Π導(dǎo)聯(lián)心電，穩(wěn)定30s，棄去心電圖不正 常的大鼠。烏頭堿(純品）經(jīng)大鼠舌靜脈給藥，劑量為20yg/kg體重，3s內(nèi)注入。觀察大鼠心電 圖的變化情況，記錄大鼠出現(xiàn)心律失常的時(shí)間(潛伏期)和心律失常的持續(xù)時(shí)間。結(jié)果:理氣 舒心片對(duì)照藥A、理氣舒心片對(duì)照藥E注射烏頭堿后出現(xiàn)心律失常時(shí)間長(zhǎng)于空白對(duì)照組(p〈 0.05、p〈0.01、p〈0.001);理氣舒心片對(duì)照藥A首次恢復(fù)正常心電圖和完全恢復(fù)正常心電圖 時(shí)間較模型組、理氣舒心片對(duì)照藥E早0<〇.〇5、？〈〇.〇1)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且呈現(xiàn)一定的 時(shí)效效關(guān)系，見表6。
[0082] 表6大鼠心律失常時(shí)間比較(X 土 S，η = 10)
[0084] 與對(duì)照組比較*Ρ <0 · 05、#Ρ< 0 · 01、< 0 · 001;與理氣舒心片對(duì)照藥Ε比較#Ρ <0.05、##Ρ<0.01
[0085] 2.3對(duì)小鼠常壓耐缺氧的影響
[0086] ICR小鼠，雌雄各半，40只，隨機(jī)分為4組，空白組、陽(yáng)性藥金納多組，理氣舒心片對(duì) 照藥Α、理氣舒心片對(duì)照藥Ε，每組10只。實(shí)驗(yàn)組每日給藥1次，連續(xù)7d，空白組給予等容積的 純化水，末次給藥lh后把小鼠分別置于經(jīng)容量標(biāo)定的250ml廣口瓶中，瓶?jī)?nèi)置一片濾紙和 l〇g鈉石灰以吸收水份和二氧化碳，瓶蓋涂以凡士林密封，記錄小鼠的死亡時(shí)間，即存活時(shí) 間。
[0087] 結(jié)果，理氣舒心片對(duì)照藥A能明顯延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間，與空白組比較有顯著性差異 (p〈0.05)且小鼠存活時(shí)間長(zhǎng)于理氣舒心片對(duì)照藥E。見表7。
[0088]表7對(duì)小鼠存活時(shí)間的影響(X ± s)
[0090] 與空白對(duì)照組比較*ρ〈0·05
[0091] 2.4結(jié)論
[0092] 利用本發(fā)明質(zhì)量檢測(cè)方法監(jiān)控合格的中成藥理氣舒心片的抗心肌缺血、抗心率不 齊作用比較明顯且療效穩(wěn)定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 理氣舒心片特征圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟： (1) 參照物溶液的制備:取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每lml含100~300 yg的溶液，即得。 (2) 供試品溶液的制備：取理氣舒心片研細(xì)，取約1~3g，精密稱定，精密加入60~80 % 的甲醇12.5~50ml，稱定重量，超聲處理10~30分鐘，放冷，用60~80%甲醇補(bǔ)足減失的重 量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得； (3) 色譜條件:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱;流動(dòng)相為A相-B相3-70:97- 30的梯度混合溶液，A相為乙腈，B相為0.1%磷酸溶液;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為240~320nm;流速為 0 · 5~1 · 5ml/min;柱溫為25~45°C。 (4) 測(cè)定:精密吸取參照物溶液和供試品溶液各5~20μ1，注入高效液相色譜儀，照高效 液相色譜法測(cè)定，得到理氣舒心片特征圖譜。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的理氣舒心片特征圖譜的構(gòu)建方法，其特征是:所述供試品溶液 的制備步驟如下：取理氣舒心片研細(xì)，取約2g，精密稱定，精密加入70 %的甲醇25ml，稱定重 量，超聲處理20分鐘，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。3. 根據(jù)權(quán)利要求4所述理氣舒心片特征圖譜測(cè)定方法，其特征是:梯度選脫時(shí)流動(dòng)相比 例為：0~3511^11，厶相：3~25%、8相 ：97~75%;35~4011^114相：25~30%、8相：75~70% ;40 ~55min，A相：30~70%、B相：70~30% ;55~70min，A相：70%、B相：30% ;70~75min，A相： 70 ~3%、B相：30 ~97%。4. 理氣舒心片的HPLC對(duì)照特征圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，按照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng) 所述的方法構(gòu)建10批理氣舒心片HPLC特征圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟 件生成由10個(gè)共有峰構(gòu)成的理氣舒心片HPLC對(duì)照特征圖譜，所述共有峰中第5號(hào)峰為柚皮 苷峰，第6號(hào)峰為橙皮苷峰，第7號(hào)峰為新橙皮苷峰，第8號(hào)峰為丹酚酸B峰。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述對(duì)照特征圖譜中，以柚皮苷峰為參照 峰S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，所述相對(duì)保留時(shí)間在規(guī)定值的±5%之內(nèi)，所 述規(guī)定值分別為:· 22-峰1、0 · 28-峰2、0 · 66-峰3、0 · 96-峰4、1 · 00-峰5、1 · 03-峰6、1 · 07-峰 7、1·20-峰8、1·58-峰9、1·64-峰10。6. 理氣舒心片的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于，取理氣舒心片樣品，按權(quán)利要求1-4任一 項(xiàng)同法操作，得到理氣舒心片樣品特征圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件 對(duì)所述樣品特征圖譜和權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的理氣舒心片特征圖譜進(jìn)行分析，相似度 大于0.90為合格產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK106018594SQ201610326033
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月17日
【發(fā)明人】吳萍, 白冰, 郭文英, 于艷輝, 唐曉桐, 徐建, 高嵩
【申請(qǐng)人】吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司