一種植物干花和干葉中金絲桃苷含量的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一套超高效液相色譜?電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)植物干花和干葉中金絲桃苷的含量進(jìn)行分離測(cè)定，靈敏度高、準(zhǔn)確性好、樣品前處理簡(jiǎn)捷、省時(shí)省力。該方法的建立對(duì)植物干花和干葉中黃酮類化合物的分離鑒定及中藥材質(zhì)質(zhì)量控制具有一定的指導(dǎo)意義。
【專利說(shuō)明】
一種植物干花和干葉中金絲桃苷含量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分析檢測(cè)領(lǐng)域，特別是一種定性和定量檢測(cè)植物干花和干葉中金絲桃 苷的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金絲桃苷廣泛存在于多種植物內(nèi)，譬如金絲桃科、薔薇科、桔?？啤⒋叫涂?、小檗 科、杜鵑花科、錦葵科等植物的果實(shí)及全草中。
[0003] 金花葵，又名菜芙蓉(Hibiscus manihot L.)，為錦葵科秋葵屬1年生草本植物，是 瀕于滅絕的珍稀植物。金花葵與黃蜀葵同屬，株高1.5-2m，春種秋收，用種子繁殖，全生育期 100多天。金花葵花在200多個(gè)秋葵植物中最具有食用、藥用、保健等功能，有較高的利用價(jià) 值。金花葵主要活性成分為生物黃酮，其中稀有黃酮單體金絲桃苷占總黃酮的50%以上。
[0004] 羅布麻是一類重要的野生植物資源，具有極高的藥用價(jià)值。最早發(fā)現(xiàn)于新疆羅布 泊，故命名為羅布麻。新疆是羅布麻的主要分布區(qū)，分布面積和產(chǎn)量分別占全國(guó)的40%和 50%。羅布麻富含黃酮類化合物，其中主要為金絲桃苷。《中國(guó)藥典》中羅布麻以金絲桃苷為 質(zhì)量控制指標(biāo)，規(guī)定本品按干燥品計(jì)算含金絲桃苷量不得低于〇. 30 %。
[0005] 黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬一年或多年生草本植物黃蜀葵的干燥花冠。黃蜀葵通常 夏、秋兩季開(kāi)花，花期長(zhǎng)，花朵淡黃色且大，觀賞性強(qiáng)。作藥用常在花盛開(kāi)時(shí)節(jié)采摘并及時(shí)干 燥備用。《中國(guó)藥典》記載，性味甘、寒，功能清利濕熱，消腫解毒。許多研究表明，黃蜀葵花中 至少有23個(gè)黃酮化合物單體，其中最常見(jiàn)的單體為金絲桃苷、槲皮素，《中國(guó)藥典》中黃蜀葵 以金絲桃苷為質(zhì)量控制指標(biāo)，規(guī)定本品按干燥品計(jì)算含金絲桃苷量不得低于0.5%。
[0006] 貫葉金絲桃為藤黃科一年生草本，花藥有黑色腺點(diǎn)，基部連成3束，子房上位，花柱 3,分離，頂端5裂。蒴果具背生的腺條及側(cè)和的囊狀腺體，頂端開(kāi)裂，種子多數(shù)，圓筒形?；ㄆ?6-7月。果期10月?！吨袊?guó)藥典》中貫葉金絲桃以金絲桃苷為質(zhì)量控制指標(biāo)，規(guī)定本品按干燥 品計(jì)算含金絲桃苷量不得少于〇. 10%。
[0007] 刺玫果為薔薇科薔薇屬植物山刺玫的干燥成熟果實(shí)，又名野薔薇果，廣泛分布于 東北及內(nèi)蒙、山西等省。文獻(xiàn)報(bào)道其含有蘆丁、金絲桃苷、銀鍛苷等黃酮類成分?！吨袊?guó)藥典》 中刺玫果以金絲桃苷為質(zhì)量控制指標(biāo)，規(guī)定按干燥品計(jì)算含金絲桃苷量不得少于0.10%。
[0008] 貫葉連翹為藤黃科多年生草本，秋季采收。藥用功效為清熱解毒，收斂止血，利濕。 治咯血，吐血，腸風(fēng)下血，外傷出血，風(fēng)濕骨痛，口鼻生瘡，腫毒，湯火傷。貫葉連翹富含黃酮 化合物，含量為全株干葉的3.35 % -7.4 %，其中主要為金絲桃苷及蕓香甙。
[0009] 金絲桃苷(取口61'〇8丨(16，簡(jiǎn)稱取口）又名槲皮素-3-〇-0-〇-吡喃半乳糖苷，屬于黃酮 醇苷類化合物，其苷元為槲皮素，糖基是吡喃半乳糖，由槲皮素的3位0原子以辦唐苷鍵與糖 基相連接。金絲桃苷具有以下作用：
[0010] 1、保肝作用
[0011] 研究發(fā)現(xiàn)金絲桃苷對(duì)CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷具有保護(hù)作用，可顯著降低模型大鼠 血清中的ALT、AST酶活性，降低肝組織勻漿中的MDA含量;顯著升高SOD、GSH酶活性;最終減 輕CCL4引起的肝組織損傷。
[0012] 2、心腦血管保護(hù)作用
[0013] 金絲桃苷可減輕大鼠全腦缺血再灌注后腦水腫程度，緩解海馬區(qū)自由基代謝異 常，改善認(rèn)知功能。金絲桃苷部分通過(guò)激活ERK信號(hào)通路來(lái)保護(hù)H202導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
[0014] 3、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用
[0015]金絲桃苷具有明顯的抗抑郁作用。
[0016] 4、局部鎮(zhèn)痛作用
[0017] 金絲桃苷鎮(zhèn)痛效果弱于嗎啡，強(qiáng)于阿司匹林，且沒(méi)有依賴性，是一種新型局部鎮(zhèn)痛 藥物。
[0018] 5、消炎作用
[0019] 大鼠植入羊毛球后，每天20mg/Kg腹腔注射7天，顯著抑制發(fā)炎過(guò)程。
[0020] 金絲桃苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0022]人們利用金絲桃苷這些功效，制作了許多藥品和飲品。
[0023] 1、刺五加膠囊
[0024] 以刺五加莖葉提取物為原料的制劑，主要成分為黃酮類化合物，其中金絲桃苷為 刺五加葉的主要活性成分。功能主治:活血化瘀。
[0025] 2、心安膠囊
[0026] 由山楂葉提取物制成的制劑，富含黃酮類化合物，其中金絲桃苷為主要成分之一。 功能主治:擴(kuò)張冠狀心血管，改善心肌供血量，降低血脂。用于治療冠心病，心絞痛，胸悶心 f季，尚血壓等。
[0027] 3、郁可欣膠囊
[0028]由古方研制而成的中藥制劑，由貫葉連翹、酸棗仁、合歡皮、石菖蒲等中藥組成。主 要含有金絲桃苷、槲皮素、槲皮苷、綠原酸、咖啡酸、衣馬寧、金絲桃素等成分。功能主治:肝 氣不舒及情志不暢所致的心神不寧、精神不振、郁郁寡歡等精神抑郁癥。
[0029] 4、金花葵花茶
[0030]完整的金花葵鮮花、花蕾，經(jīng)低溫真空干燥而成。花蕾經(jīng)開(kāi)水泡發(fā)后，豐富的植物 總黃酮，結(jié)合維生類與微量元素類營(yíng)養(yǎng)元素能促進(jìn)人體全方位的自我調(diào)理，從而確保內(nèi)分 泌平衡、抗衰老、抗疲勞、增耐力、促進(jìn)血液循環(huán)加快等功效。
[0031 ]金絲桃苷在這些植物中的含量有較多研究，但差異較大。文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)：貫葉連翹為 0.254 % -ο. 266 %，菟絲子為0.076-0.102 %，江蘇江堰黃蜀葵花為1.12 %，江蘇興化黃蜀葵 花為0.98%，河北邢臺(tái)黃蜀葵花為1.03%，山楂提取物中為1.95-3.24mg/g，茱萸為0.636-0.682mg/g，羅布麻葉為0.71%，篇蓄為0.011-0.017%，水芹為0.16-0.29mg/g。金花葵中金 絲桃苷含量研究較少，且結(jié)果相差較大，易劍鋒測(cè)得宜春學(xué)院繁育的金絲桃苷的含量為 0.258%，而彭志兵測(cè)得同一繁育基地的金絲桃苷的含量為11.25mg/g，即1.125%。差異的 原因可能是因?yàn)樗麄兯玫臋z測(cè)儀器都是液相色譜儀，靈敏度和準(zhǔn)確度均不如液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀高。
[0032] 隨著人民生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越注重養(yǎng)生，針對(duì)這一心理，如今市面上涌現(xiàn) 出大量保健品，其中很多保健品都注明含有金絲桃苷成分，《中國(guó)藥典》中中草藥材以金絲 桃苷為質(zhì)量控制指標(biāo)，含量均有嚴(yán)格的規(guī)定。所以準(zhǔn)確度高，靈敏度好的檢測(cè)方法至關(guān)重 要。現(xiàn)有文獻(xiàn)方法除了彭志兵《高效液相色譜-質(zhì)譜法分析金花葵花中金絲桃苷》使用到質(zhì) 譜儀外，其余五篇文獻(xiàn)方法均為液相色譜法。植物樣品基質(zhì)干擾大，部分樣品中金絲桃苷含 量低，液相色譜法定性差，靈敏度低，難以使人信服，不能作為最終確證方法。
[0033] 質(zhì)譜分析法是將不同質(zhì)量的離子按質(zhì)荷比(m/z)的大小順序收集和記錄下來(lái)，得 到質(zhì)譜圖，用質(zhì)譜圖進(jìn)行定性、定量分析及結(jié)構(gòu)分析的方法。質(zhì)譜先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜圖全掃 描，確定各目標(biāo)化合物的母離子，然后在選定的源內(nèi)碎裂電壓條件下，對(duì)選定的母離子進(jìn)行 子離子掃描，選取豐度相對(duì)最強(qiáng)的1對(duì)碎片離子作為定量離子，用于對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量 分析，次強(qiáng)的2對(duì)或3對(duì)碎片離子作為定性離子，用于對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量分析。彭志兵 《高效液相色譜-質(zhì)譜法分析金花葵花中金絲桃苷》雖然是用高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定金 絲桃苷，但只有金絲桃苷的分子離子，并未得到相應(yīng)的子離子，既無(wú)定性離子也無(wú)定量離 子，所得出的結(jié)論一樣不能使人信服。
[0034] 超高效液相色譜方法的突出優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在節(jié)省分析時(shí)間和溶劑用量上，尤其對(duì)基質(zhì) 復(fù)雜的痕量組分測(cè)定采用該方法以提高分析通量是今后發(fā)展的必然趨勢(shì)。
[0035]三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜工作原理：
[0036]化合物分子在真空條件下受電子流的"轟擊"或強(qiáng)電場(chǎng)等其他方法的作用，電離成 離子，同時(shí)發(fā)生某些化學(xué)鍵有規(guī)律的斷裂，生成具有不同質(zhì)量的帶正電荷的離子，這些離子 按質(zhì)荷比(m/z)的大小被收集并記錄的圖譜。
[0037] 電噴霧電離(ESI):
[0038]樣品溶液在電場(chǎng)的作用下形成帶高度電荷的霧狀小液滴，在向質(zhì)量分析器移動(dòng)的 過(guò)程中，液滴因溶劑不斷揮發(fā)而縮小，導(dǎo)致表面電荷密度不斷增大，當(dāng)電荷之間的排斥力足 以克服液滴的表面張力時(shí)，液滴發(fā)生裂分，如此反復(fù)進(jìn)行，最后得到帶單電荷或多電荷的離 子。
[0039]三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜優(yōu)點(diǎn)：
[0040] (1)不需進(jìn)行衍生化。
[0041] (2)在單個(gè)分析中實(shí)現(xiàn)確認(rèn)定量。
[0042] (3)在復(fù)雜很臟的基體中的低檢測(cè)限。
[0043] (4)提高實(shí)驗(yàn)室效率/產(chǎn)出率(使用固相萃取技術(shù)）。
[0044] (5)更可靠和可值得信賴的測(cè)試結(jié)果。
[0045] (6)質(zhì)量范圍：5-1200amu
[0046] (7)分辨率：彡 0.4Da
[0047] (8)靈敏度高
[0048] (9)定量重現(xiàn)性好

【發(fā)明內(nèi)容】

[0049] 本發(fā)明提供一套超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)植物干花和干葉中金絲桃 苷的含量進(jìn)行分離測(cè)定，靈敏度高、準(zhǔn)確性好、樣品前處理簡(jiǎn)捷、省時(shí)省力。該方法的建立對(duì) 植物干花和干葉中黃酮類化合物的分離鑒定及中藥材質(zhì)質(zhì)量控制具有一定的指導(dǎo)意義。
[0050] 本發(fā)明所述植物干花和干葉中金絲桃苷的含量測(cè)定方法包括下列步驟：
[0051 ] 1.將植物烘干或曬干，制成干葉或干花，碾成粉末后過(guò)40目篩；
[0052] 2.分別準(zhǔn)確稱取植物干葉或干花粉末兩份平行試料各l.OOg，加入10mL乙腈水溶 液(80:20，v/v)于50mL離心管中，35KHZ超聲提取30分鐘，10000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)入 另一個(gè)50mL離心管中，殘?jiān)偌尤?0mL乙腈水溶液(80:20，v/v)，重復(fù)提取一次，合并上清 液，提取液于60°C下氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇水溶液（10:90，v/v)定容至1.00mL，經(jīng)0.22nm孔 徑濾膜過(guò)濾后，供超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定；
[0053] 3.測(cè)定
[0054] (1)液相色譜條件
[0055] 色譜柱:Eclipse Plus C18(RRHD 1·8μπι，2· IX 100mm)
[0056] 流動(dòng)相:Α:純水，Β甲醇
[0057] 流速:0.25mL/min
[0058] 洗脫梯度:0-0 · 5min保持 10 % Β，0 · 5-5min 10 % B線性變化至90 % Β，5-5 · 8min保持 90%B，5.8-6min 90%B線性變化至 10%B，6-8min保持 10%B。
[0059] 進(jìn)樣量：5yL
[0060] (2)質(zhì)譜條件
[00611電離模式:電噴霧電離正離子模式(ESH;
[0062] 檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);
[0063] 毛細(xì)管電壓:3 000V;離子源溫度:30(TC;
[0064] 干燥氣溫度:300°C ;干燥氣流量:4L/min;
[0065] 霧化氣壓力:40psi;鞘氣溫度:350°C;鞘氣流量:llL/min。
[0066] 4.數(shù)據(jù)分析和處理 [0067]質(zhì)譜條件的優(yōu)化：
[0068]配制2.0mg/L的金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，不通過(guò)色譜柱直接進(jìn)入離子源，在ESr模式下 分別進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜圖全掃描，確定各目標(biāo)化合物的母離子，并優(yōu)化 得到源內(nèi)碎裂電壓，然后在選定的源內(nèi)碎裂電壓條件下，對(duì)選定的母離子進(jìn)行子離子掃描， 選取豐度相對(duì)最強(qiáng)的1對(duì)碎片離子作為定量離子，次強(qiáng)的2對(duì)碎片離子作為定性離子，并分 別對(duì)子離子的碰撞能進(jìn)行優(yōu)化。最后在MRM模式下分別對(duì)霧化氣壓力、干燥氣溫度和流量等 參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。
[0069]表1 MRM監(jiān)測(cè)模式下金絲桃苷質(zhì)譜優(yōu)化條件 *為定量 離子
[0070]
[0071] 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：
[0072] 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取適量金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1. Omg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液， 于-18 °C下避光儲(chǔ)存。
[0073] 標(biāo)準(zhǔn)中間液:取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液lmL，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中 間液，于-18°C下避光儲(chǔ)存。
[0074] 標(biāo)準(zhǔn)工作液:取上述標(biāo)準(zhǔn)中間液lmL，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1. Omg/1的標(biāo)準(zhǔn)工 作液，于-4°C下避光儲(chǔ)存。
[0075] 配制金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為50.0、80.0、10(h0、150.0、200.0、50(h0yg/U9 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以定量離子峰面積(y)對(duì)濃度(x，yg/L)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，金 絲桃苷在50.0~500.0 yg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好(r2>0.999)。取已測(cè)定含量的羅布麻干 葉、黃蜀葵和金花葵干花粉末樣品，添加不同質(zhì)量濃度的金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 條件由高至低的質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)，直至信噪比等于3(S/N=3)和信噪比等于10(S/N=10) 時(shí)，確定羅布麻干葉、黃蜀葵和金花葵干花樣品中金絲桃苷的檢出限(L0D)均為20.0 yg/kg， 定量限（L0Q)均為60.0yg/kg。
[0076] 取已測(cè)定含量的羅布麻干葉、黃蜀葵和金花葵干花粉末樣品，添加金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn) 溶液分別為60、100.0、200.0yg/kg，然后按照本方法進(jìn)行樣品前處理和測(cè)定，每個(gè)添加水平 測(cè)定6次，日內(nèi)精密度通過(guò)Id內(nèi)測(cè)定3個(gè)加標(biāo)水平下的6個(gè)平行樣品得到，日間精密度為連續(xù) 6d(每天測(cè)定1次)測(cè)定3個(gè)加標(biāo)水平下的樣品得到，結(jié)果顯示，羅布麻干葉樣品添加金絲桃 苷濃度為60、100.0、200.0 yg/kg時(shí)，方法的平均回收率為86.5%~100.3%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn) 偏差為2.87 %~5.04%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.56%~6.95 % ;黃蜀葵干花樣品添加金絲 桃苷濃度為60、100.0、200.0 yg/kg時(shí)，方法的平均回收率為84.3%~102%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn) 偏差為2.24%~5.17 %，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.04%~7.21 %。金花葵干花樣品添加金絲 桃苷濃度為60、100.0、200.0 yg/kg時(shí)，方法的平均回收率為82.9%~102.8%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)偏差為3.35 %~5.19%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.57%~7.66% ;精密度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 見(jiàn)表2-4。
[0077] 表2羅布麻干葉中添加金絲桃苷日內(nèi)和日間精密度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 6)
[0079]表3黃蜀葵干花中添加金絲桃苷日內(nèi)和日間精密度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 6)
[0080]
[0081]表4金花葵干花中添加金絲桃苷日內(nèi)和日間精密度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 6)
[0083]試樣中金絲桃苷殘留量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)X計(jì)，數(shù)值以微克每千克(yg/kg)表示，單點(diǎn)校 正按式（1)、（2)計(jì)算：
[0086]式中：
[0087] Ci一試樣溶液中金絲桃苷濃度(yg/L);
[0088] Cs-對(duì)照溶液中金絲桃苷濃度(yg/L);
[0089] Ai-試樣溶液中金絲桃苷峰面積；
[0090] As-對(duì)照溶液中金絲桃苷峰面積；
[0091 ] X-試樣中金絲桃苷的含量(yg/kg);
[0092] V-樣液最終定容體積(mL);
[0093] m-試樣質(zhì)量(g);
[0094] 標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)按式(3)計(jì)算：
[0096] Ci-標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的試樣中金絲桃苷濃度(yg/L);
[0097] V-樣液最終定容體積(mL);
[0098] m-試樣質(zhì)量，單位為克(g)。
[0099] 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效 數(shù)字。
[0100] 在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于兩個(gè)測(cè)定值的算術(shù) 平均值的20 %。
[0101 ]本發(fā)明使用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)植物干花和干葉中金絲桃苷的 含量進(jìn)行分離測(cè)定，靈敏度高、準(zhǔn)確性好、樣品前處理簡(jiǎn)捷、省時(shí)省力。該方法的建立對(duì)植物 干花和干葉黃酮類化合物的分離鑒定及中藥材質(zhì)質(zhì)量控制具有一定的指導(dǎo)意義。
[0102]本發(fā)明與已有文獻(xiàn)和專利相比，具有更高的準(zhǔn)確度和更低的檢測(cè)限及定量限，表 現(xiàn)為如下幾點(diǎn)：
[0103] 1、首次使用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)植物干花和干葉中金絲桃苷的 含量進(jìn)行分離測(cè)定。
[0104] 2、取已測(cè)定含量的羅布麻干葉樣品添加金絲桃苷濃度為60、100.0、200.0yg/kg 時(shí)，方法的平均回收率為88.5%~100.3%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.87%~5.04%，日間相 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.56 %~6.95 %。
[0105] 3、取已測(cè)定含量的黃蜀葵干花樣品添加金絲桃苷濃度為60、100.0、200.0yg/kg 時(shí)，方法的平均回收率為84.3%~102%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.24%~5.17%，日間相對(duì) 標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.04%~7.21 %。
[0106] 4、取已測(cè)定含量的金花葵干花樣品添加金絲桃苷濃度為60、100.0、200.0yg/kg 時(shí)，方法的平均回收率為82.9%~96.3%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.35%~5.19%，日間相對(duì) 標(biāo)準(zhǔn)偏差為4 · 57 %~7 · 66 %。
[0107] 5、采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)羅布麻干葉、黃蜀葵和金花葵干花 樣品中金絲桃苷進(jìn)行測(cè)定，檢出限(L0D)均為20.0 yg/kg，定量限(L0Q)均為60.0 yg/kg。
【附圖說(shuō)明】
[0108] 圖1為實(shí)施例1中金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖。
[0109] 圖2為實(shí)施例1中MRM模式下，金花葵干花中金絲桃苷選擇離子色譜圖。 具體實(shí)施例
[0110] 實(shí)施例1: Com]本發(fā)明所述植物干花和干葉中金絲桃苷的含量測(cè)定方法包括下列步驟：
[0112] 1.羅布麻、黃蜀葵、金花葵烘干或曬干，制成干葉或干花，碾成粉末后過(guò)40目篩；
[0113] 2.分別準(zhǔn)確稱取羅布麻干葉、黃蜀葵和金花葵干花粉末兩份平行試料各1.00g，加 入10mL乙腈水溶液(80:20，￥八）于5〇1^離心管中，351012超聲提取30分鐘，1000(^/111丨11離心 5min，上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)50mL離心管中，殘?jiān)偌尤?0mL乙腈水溶液(80: 20，v/v)，重復(fù)提 取一次，合并上清液，提取液于60°C下氮?dú)獯蹈桑?0 %甲醇水溶液（10 : 90，v/v)定容至 1.00mL，經(jīng)0.22nm孔徑濾膜過(guò)濾后，供超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定；
[0114] 3.測(cè)定
[0115] (1)液相色譜條件
[0116] 色譜柱:Eclipse Plus C18(RRHD 1·8μπι，2· IX 100mm)
[0117] 流動(dòng)相:Α:純水，Β甲醇 [0118]流速:0.25mL/min
[0119]洗脫梯度:0-0 · 5min保持 10 % Β，0 · 5-5min 10 % B線性變化至90 % Β，5-5 · 8min保持 90%B，5.8-6min 90%B線性變化至 10%B，6-8min保持 10%B。
[0120] 進(jìn)樣量:5yL
[0121] (2)質(zhì)譜條件
[0122] 電離模式:電噴霧電離正離子模式(ESr);
[0123] 檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);
[0124] 毛細(xì)管電壓:3 000V;離子源溫度:300°C;
[0125] 干燥氣溫度:300°C ;干燥氣流量:4L/min;
[0126] 霧化氣壓力:40psi ;鞘氣溫度:350°C ;鞘氣流量:11 L/min。
[0127] 當(dāng)然，本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上的實(shí)施例僅是用來(lái)說(shuō)明本 說(shuō)明，而并非作為本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，對(duì)以上所述實(shí)施例的變化、 變型都將落在本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種植物干花和干葉中金絲桃苷含量的測(cè)定方法，其特征在于:包括下列步驟： a. 將植物烘干或曬干，制成干葉或干花，碾成粉末后過(guò)40目篩； b. 分別準(zhǔn)確稱取植物干葉或干花粉末兩份平行試料各l.OOg，加入IOmL乙腈水溶液 (80:20，v/v)于50mL離心管中，35KHZ超聲提取30分鐘，10000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)入另 一個(gè)50mL離心管中，殘?jiān)偌尤隝OmL乙腈水溶液(80:20，v/v)，重復(fù)提取一次，合并上清液， 提取液于60 °C下氮?dú)獯蹈桑?0 %甲醇水溶液（10:90，v/v)定容至1.0 OmL，經(jīng)0.22nm孔徑濾 膜過(guò)濾后，供超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定； c. 測(cè)定 (1) 液相色譜條件 色譜柱:Eclipse Plus C18(RRHD 1·8μπι，2· IX 100mm) 流動(dòng)相:Α:純水，B甲醇 流速:〇.25mL/min 洗脫梯度:〇-〇 · 5min 保持 10 % B，0 · 5-5min 10 % B線性變化至90 % B，5-5 · 8min保持90 % B，5.8-6min 90%8線性變化至10%8,6-8111丨11保持10%8; 進(jìn)樣量:5yL (2) 質(zhì)譜條件 電離模式:電噴霧電離正離子模式(ESr); 檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM); 毛細(xì)管電壓:3 000V;離子源溫度:300°C; 干燥氣溫度:300 °C ;干燥氣流量:4L/min; 霧化氣壓力:40psi ;鞘氣溫度:350°C ;鞘氣流量：I lL/min; d. 數(shù)據(jù)分析和處理。2. 如權(quán)利要求1所述的一種植物干花和干葉中金絲桃苷含量的測(cè)定方法，其特征在于： 所述植物可為羅布麻、黃蜀葵、金花葵中任意一種。3. 如權(quán)利要求1所述的一種植物干花和干葉中金絲桃苷含量的測(cè)定方法，其特征在于： 所述數(shù)據(jù)分析和處理方法如下：試樣中金絲桃苷殘留量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)X計(jì)，數(shù)值以微克每千克(yg/kg)表示，單點(diǎn)校正按 式rw彳+曾. I. ·.?.?? β W β W β W ?.?.· .? ( > i · ·''· ·'*'? ? · ·>·''* ? · ·''· ·'*'? ? · ·>·''* ? · ·''· ·'*'? ? · ·>·''* ? · · f Q \ ·: \ i-( / 式中： Ci一試樣溶液中金絲桃苷濃度(yg/L); Cs-對(duì)照溶液中金絲桃苷濃度(yg/L); Ai-試樣溶液中金絲桃苷峰面積； As-對(duì)照溶液中金絲桃苷峰面積； X-試樣中金絲桃苷的含量(yg/kg); V一樣液最終定容體積(mL); m-試樣質(zhì)量(g); 標(biāo)準(zhǔn)曲線柃準(zhǔn)桉式（3)計(jì)算：? ：· ：· · · ? ·. ·. · .· · · · ：· ：· · · ? ·. ·. · .· · · · ：· ：· · · ? ·. ·. · · · · ：,(3 ) C1 一標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的試樣中金絲桃苷濃度(yg/L); V一樣液最終定容體積(mL); m-試樣質(zhì)量，單位為克(g); 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù) 字； 在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于兩個(gè)測(cè)定值的算術(shù)平均 值的20 %。
【文檔編號(hào)】G01N30/14GK106018652SQ201610607106
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月28日
【發(fā)明人】胡麗芳, 范芳, 周瑤敏, 徐俊, 廖且根, 張金艷
【申請(qǐng)人】江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所