分散液液微萃取?高效液相色譜測定食用油中酚類抗氧化劑含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分散液液微萃取?高效液相色譜測定食用油中酚類抗氧化劑種類和含量的方法。它包括如下步驟：1)將待測食用油與分散劑混合，然后加入萃取劑混合，收集萃取相；2)采用高效液相色譜法分析測定所述萃取相中各個成分的保留時間和含量，經(jīng)與酚類抗氧化劑標準品的保留時間與含量的對比與計算，即得到食用油中酚類抗氧化劑的種類和含量。本發(fā)明具有快速靈敏、使用有機溶劑少的特點，能檢測量少的食用油待測樣品即能測定其中酚類抗氧化劑的含量和種類；并能應(yīng)用于多種食用油中酚類抗氧化劑的檢測。
【專利說明】
分散液液微萃取-高效液相色譜測定食用油中酚類抗氧化劑 含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種分散液液微萃取-高效液相色譜測定食用油中酚類抗氧化劑種類 和含量的方法，屬于分析化學領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 酚類合成抗氧化劑作為一種食品添加劑，已被廣泛的用來阻止或延緩運輸貯藏過 程中油脂的氧化變質(zhì)。國際上常用的酚類合成抗氧化劑有沒食子酸丙酯(PG)、特丁基對苯 二酚(TBHQ)、丁基羥基茴香醚(BHA)、沒食子酸十二酯(DG)、沒食子酸辛酯(0G)及2,6_二叔 丁基-4-甲基苯酚(BHT)，它們可以單獨使用或者復合使用。然而，很多研究表明，這些物質(zhì) 具有一定的毒性及致癌作用，過量攝入有害于人們的身體健康。因此，合成抗氧化劑在食品 中的用量受到嚴格控制，并且不同國家的限量值不同。如，TBHQ在美國允許使用，但在歐洲 卻禁止使用。一般來說，合成抗氧化劑單獨或者混合使用的使用值范圍為100-200mg kg一、
[0003] 植物油是油不飽和脂肪酸和甘油化合而成的復雜化合物，是從植物的種子、果實、 胚芽中得到的油脂。它是人類日常攝取油脂及礦物質(zhì)的主要來源，因此植物油的質(zhì)量控制 非常重要。常用檢測食用油中的抗氧化劑的方法有高效液相色譜法(HPLC)，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)、氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用(GC-MS)、伏安法、毛細管電泳 色譜法。然而，這些方法常常耗時長，在萃取過程中使用大量的有機溶劑并且需要大量的樣 品。因此，建立一種快速靈敏、節(jié)約有機溶劑、減少樣品量的分析食用油中的合成抗氧化劑 的方法是必要且迫切的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種分散液液微萃取-高效液相色譜測定食用油中酚類抗氧 化劑種類和含量的方法。本發(fā)明具有快速靈敏、使用有機溶劑少的特點，能檢測量少的食用 油待測樣品即能測定其中酚類抗氧化劑的含量和種類;并能應(yīng)用于多種食用油中酚類抗氧 化劑的檢測。
[0005] 本發(fā)明提供的分散液液微萃取-高效液相色譜測定食用油中酚類抗氧化劑種類和 含量的方法，包括如下步驟：1)將待測食用油與分散劑混合，然后加入萃取劑混合，收集萃 取相；
[0006] 2)采用高效液相色譜法分析測定所述萃取相中各個成分的保留時間和含量，經(jīng)與 酚類抗氧化劑標準品的保留時間與含量的對比與計算，即得到食用油中酚類抗氧化劑的種 類和含量。
[0007] 上述的方法中，所述待測食用油為芝麻油、橄欖油、葡萄籽油、棉籽油、花生油、大 豆油、玉米油和向日葵油中的至少一種。
[0008] 上述的方法中，所述分散劑為正己烷、異丙醇和丙酮中的至少一種，分散劑有利于 增加樣品的流動性，擴大接觸面積及加速相分離，分散劑必須同時與食用油及萃取劑相 容。；
[0009] 所述萃取劑為甲醇、乙腈和乙醇中的至少一種。
[0010] 上述的方法中，所述待測食用油的質(zhì)量與所述分散劑的體積比可為25mg: 200yL~ lmL，具體可為 25mg: 0 ? 5mL 或 25mg: 400此~0 ? 8mL;
[0011] 所述待測食用油的質(zhì)量與所述萃取劑體積比可為25mg:200iiL~lmL，具體可為 25mg: 0 ? 5mL 或 25mg: 300此~0 ? 7mL。
[0012] 上述的方法中，所述酚類抗氧化劑為沒食子酸丙酯、特丁基對苯二酚、丁基羥基茴 香醚、沒食子酸十二酯、沒食子酸辛酯和2,6_二叔丁基-4-甲基苯酚中的至少一種。
[0013] 上述的方法中，所述待測食用油與所述分散劑和所述萃取劑的混合依次采用超聲 處理和離心處理。
[0014] 上述的方法中，所述超聲處理的時間為0~7min，具體可為2min或1~6min，超聲有 利于加速待測食用油與萃取劑之間的質(zhì)量傳遞，增加接觸面積縮短萃取時間；
[0015] 所述離心處理的時間可為0~lOmin，具體可為2min或1~8min;
[0016] 所述離心處理的轉(zhuǎn)速可為1000~6000r/min，具體可為3000r/min或2000~5000r/ min〇
[0017] 本發(fā)明中，步驟2)高效液相色譜法測定酚類合成抗氧化劑的條件與現(xiàn)有技術(shù)中相 同；高效液相色譜分析條件具體如下:流動相為乙腈(A)及含1%乙酸的水(B)。梯度洗脫程 序為：0~9min，30%-90% (A) ;9~13min，90%-100% (A);流速為 1.5mL/min，柱溫為25°C， 進樣量為1〇此，檢測波長為280nm。每次結(jié)束后，用甲醇/水沖洗柱子至少30min。
[0018]本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0019] 采用分散液液萃取技術(shù)結(jié)合高效液相色譜法對酚類合成抗氧化劑進行富集、檢測 的方法。整個預(yù)處理步驟僅消耗了待測食用油和有機溶劑的量少，具體可為25mg樣品，lmL 有機溶劑(〇.5mL乙腈及0.5mL正己烷），通過微萃取及離心分離兩步完成。本發(fā)明采用乙腈 作為萃取劑，有效的降低了實際待測食用油樣品中所含成分種類的復雜程度，保護了色譜 柱。本發(fā)明通過回收率實驗及精密度實驗，說明本發(fā)明方法適用于食用油中抗氧化劑含量 的質(zhì)量控制。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明中萃取劑種類對萃取效率的影響。
[0021] 圖2為本發(fā)明中分散劑種類對萃取效率的影響。
[0022]圖3為本發(fā)明中分散劑體積對萃取效率的影響。
[0023]圖4為本發(fā)明中超聲時間對萃取效率的影響。
[0024]圖5為本發(fā)明中實驗測得的色譜圖，其中圖5a是空白食用油色譜圖；圖5b是加入 100mg/L混合標準樣品的色譜圖。
【具體實施方式】
[0025] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0026] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0027] 下述實施例中，？6、了8即、8骱、06、06及冊1'的標準品均購買于31811^-41扣1(^試劑 公司。甲醇、乙醇、正己烷、乙腈及丙酮均為色譜純度，購買于Sigma-Aldrich試劑公司。不含 有合成抗氧化劑的空白棉籽油樣由農(nóng)業(yè)部棉花質(zhì)量監(jiān)督檢測中心提供。芝麻油、橄欖油、葡 萄籽油、棉籽油、花生油、大豆油、玉米油及向日葵油均購買于超市。實驗用水均為超純水。 使用標準品配制6種目標物的標準儲備混合液，濃度為500mg/100mL，保存在4°C冰箱中，并 且避光保存。
[0028] Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司），色譜柱（150X4.6mm，5wn)，KQ-200VDE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Eppend 〇rf AG離心機（德國艾本德公 司），XP504分析天平(Mettle-Toledo,瑞典）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。
[0029] 實施例1、
[0030] 分散液液微萃取-高效液相色譜測定食用油中酚類抗氧化劑種類和含量的方法， 具體步驟如下：
[0031] 1、樣品前處理過程:分散液液微萃取
[0032] 稱取25mg的食用油樣品止于配有螺旋蓋的2mL的離心試管內(nèi)。然后快速加入0.5mL 正己烷分散劑，以增加食用油的流動性。充分混勻后，將〇.5mL乙腈萃取劑快速注射進樣品 中，然后超聲2min，再3000r/min離心2分鐘。離心后，將萃取相轉(zhuǎn)移入樣品瓶中。
[0033] 2、高效液相色譜法分析測定萃取相中各個成分的保留時間和含量
[0034]高效液相色譜分析條件:流動相為乙腈(A)及含1 %乙酸的水(B)。梯度洗脫程序 為：0~91^11，30%-90%以）；9~13111111，90%-100%以）。流速為1.511117111111，柱溫為25°(：，進 樣量為1〇此，檢測波長為280nm。每次結(jié)束后，用甲醇/水沖洗柱子至少30min。
[0035] 實驗結(jié)果如下：
[0036] (1)線性及檢出限
[0037] DAD檢測器的靈敏度是通過分析6種酚類抗氧化劑(PG、TBHQ、BHA、DG、OG&BHT)# 準混合液來實現(xiàn)的。線性曲線是由峰面積與對應(yīng)的各種物質(zhì)濃度作圖而得。該法對這6種抗 氧化劑的線性范圍均為0.1~500mg ? I/1，并且相關(guān)系數(shù)均大于0.998。將標準溶液稀釋，以 信噪比S/N=3計，最低檢出限(L0D)為0.(U-0.07mg ? L-、
[0038] (2)萃取過程優(yōu)化
[0039]為了減少萃取劑的使用，萃取劑的體積定為0.5mL。食用油樣品的量也應(yīng)該少，因 為在萃取過程中油基質(zhì)可能會與有機溶劑共存，進樣到HPLC系統(tǒng)中，會對色譜柱有一定程 度的污染。一般來說，允許使用的抗氧化劑最大濃度是200mg/kg。如果一個食用油樣品中含 有200mg/kg的抗氧化劑并稱量樣品25mg，然后被0.5mL萃取劑稀釋，那么抗氧化劑的最終濃 度就是l〇mg/kg。這剛好在該方法的線性范圍中。即使抗氧化劑在實際油樣品中僅有5mg/ kg，稀釋后HPLC檢測出的濃度為0.25mg/kg，這仍在該法的線性范圍內(nèi)（0. l-500mg I/1)。因 此食用油樣品最少稱量為25mg。
[0040]按照上述實驗步驟采用不同萃取劑進行實驗，萃取劑具體如下：甲醇、乙腈、乙醇 及甲醇與乙腈的混合物（l:l，v/v)。將lOOyg的六種抗氧化劑加入到不含抗氧化劑的棉籽油 中，混勻，從中取各50mg置于四個離心管內(nèi)，進行萃取，最后取得的溶液直接進樣高效液相 色譜儀。測得的各種抗氧化劑的峰面積如圖1所示。由圖1可知，乙醇作為萃取劑，能與食用 油混溶，離心后沒有沉積相形成。其余三種有機溶劑都有不同程度的不溶于食用油樣品。單 獨使用甲醇的萃取效率遠遠低于使用甲醇與乙腈的混合物（1:1，v/V)的，這可能是由于混 合后溶劑極性的改變。乙腈的加入，油樣迅速成為了乳濁液，離心后有沉積相形成，這有利 用降低注射樣品的復雜程度，有效的保護了色譜柱。因此乙腈作為最優(yōu)萃取劑。
[0041] 按照上述實驗步驟采用不同的分散劑進行實驗，分散劑具體如下:選擇了正己烷、 異丙醇及丙酮。實驗結(jié)果如圖2所示，正己烷的萃取效率最大，這是由于正己烷與油樣的很 好的互溶性及目標分析物在混合溶液低分布率兩者的協(xié)同作用造成的。
[0042] 按照上述實驗步驟采用不同分散劑的體積(0.2-lmL)對萃取效率影響的測定，由 圖3可知，25mg待測食用油測定時，0.5mL正己烷時對6種氧化劑的萃取效率最強。因此最佳 的分散劑加入體積為〇. 5mL。
[0043]按照上述實驗步驟采用不同超聲時間（l-10min)對萃取效率影響的測定。由圖4 知，時間超過2分鐘后，6種酚類抗氧化物的峰面積變化很小，也就是說2min已經(jīng)可以使溶液 混勻。因此25mg待測食用油測定時，選擇2min作為超聲時間。然后，3000rpm離心分離2min樣 品，以使兩相有效分離。
[0044] (3)食用油樣品中萃取酚類抗氧化劑的色譜行為
[0045] 向不含抗氧化劑的空白油樣中加入一定量的6中抗氧化劑使最終濃度為100mg/L， 得到空白油樣及加入標準物的油樣的色譜圖。由圖5可知，PG，TBHQ，BHA，0G，DG，及BHT的保 留時間依次是3.76，5.42，7.81，7.99，11.13，11.75min。通過標準混合物質(zhì)保留時間及譜圖 來確定各種分析物，由圖5可知，油樣中的其他雜質(zhì)對分析物的檢測是幾乎沒有干擾的。 [0046] (4)回收率及精密度實驗
[0047] 將50.0、100.0及200.0 yg的各種抗氧化劑分別加入到1.000g不含抗氧化劑的棉籽 油中，混合均勻以保證抗氧化劑與油樣完全相溶。平均回收率及相對標準偏差結(jié)果如表1。 回收率為85.8%~102.5%，相對標準偏差均低于3.2%。
[0048] 表1樣品回收率測定(n = 3)
[0049]
[0050] 使用日間相對標準偏差及日內(nèi)標準偏差來檢驗該方法的重復性。日內(nèi)精密度是通 過一天注射l〇mg/L的6種標準物質(zhì)混合液五次來實現(xiàn)的。日間精密度是連續(xù)五天測10mg/L 的6種標準物質(zhì)混合液來實現(xiàn)的。結(jié)果表明，日間及日內(nèi)精密度均低于3.8%(n = 5)。上述結(jié) 果說明抗氧化劑的穩(wěn)定性對樣品處理及HPLC檢測均沒有太大影響。
[0051] (5)實際樣品檢測
[0052]按照上述實驗步驟對8種食用油樣品（芝麻油、橄欖油、葡萄籽油、棉籽油、花生油、 大豆油、玉米油及向日葵油）中酚類抗氧化劑的種類和含量進行分析。采用外標法進行計算 實樣中的抗氧化劑含量，結(jié)果如表2所示。由表2可知，TBHQ是最常用的食用油抗氧化劑，有7 個樣品中檢測到了TBHQ，濃度從4.66mg/kg到44. lmg/kg。這8個樣品中均未檢測到BHA。這8 種食用油各自抗氧化劑含量總和或者單獨未超過標準200mg/kg。廠家僅僅標明含有抗氧化 劑，但未明確其種類及含量。本發(fā)明方法可以測得抗氧化劑的種類和含量。
[0053]表2實際樣品中抗氧化劑的檢測(n = 3)
[0054]
[0055] aRSD，相對標準偏差;n = 3.
[0056] b總量，各種抗氧化劑的總和 [0057] c ND，未檢測到.
[0058] d用A0AC方法檢測驗證 [0059] (6)與其他分析方法比較
[0060] 為了進一步驗證本發(fā)明方法的準確性，使用A0AC方法（AOAC Off icial Method983.15A0AC.1995)對食用油中抗氧化劑的起始含量進行測定。如表2所示，這兩種方 法的結(jié)果是一致的。然后將本發(fā)明方法與現(xiàn)有的其他分析方法進比較，本發(fā)明方法有較好 的靈敏度，及前處理有機溶劑使用量低，樣品消耗量低，處理時間短。
[0061]其中A0AC方法為:抗氧化劑用乙腈萃取后富集，用異丙醇進一步稀釋，然后用液相 色譜-紫外檢測器測定。流動相為:A，5%乙酸/水;B，乙腈/甲醇（l:l，v/v)。
【主權(quán)項】
1. 分散液液微萃取-高效液相色譜測定食用油中酚類抗氧化劑種類和含量的方法，包 括如下步驟:1)將待測食用油與分散劑混合，然后加入萃取劑混合，收集萃取相； 2)采用高效液相色譜法分析測定所述萃取相中各個成分的保留時間和含量，經(jīng)與酚類 抗氧化劑標準品的保留時間與含量的對比與計算，即得到食用油中酚類抗氧化劑的種類和 含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述待測食用油為芝麻油、橄欖油、葡萄籽 油、棉籽油、花生油、大豆油、玉米油和向日葵油中的至少一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述分散劑為正己烷、異丙醇和丙酮中 的至少一種； 所述萃取劑為甲醇、乙腈和乙醇中的至少一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于:所述待測食用油的質(zhì)量與所述 分散劑的體積比為25mg: 200yL~lmL; 所述待測食用油的質(zhì)量與所述萃取劑體積比為25mg:200yL~lmL。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于:所述酚類抗氧化劑為沒食子酸 丙酯、特丁基對苯二酚、丁基羥基茴香醚、沒食子酸十二酯、沒食子酸辛酯和2,6_二叔丁基-4-甲基苯酚中的至少一種。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于:所述待測食用油與所述分散劑 和所述萃取劑的混合依次采用超聲處理和離心處理。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述超聲處理的時間為0~7min; 所述離心處理的時間為〇~lOmin; 所述離心處理的轉(zhuǎn)速為1000~6000r/min。
【文檔編號】G01N30/06GK106053618SQ201610299961
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】徐雙嬌, 馬磊, 魏守軍, 王延琴, 周大云, 匡猛, 方丹, 楊偉華
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所