在線測定牛奶中苯甲酸δ¹³C值的方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在線測定牛奶中苯甲酸δ13C值的方法。具體而言，本發(fā)明涉及應(yīng)用液相色譜?穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜在線測定牛奶中苯甲酸δ13C值的方法，屬于穩(wěn)定同位素分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。該方法包括如下步驟：1)選用合適的液相色譜柱；2)配制酸性流動相；3)調(diào)整液相色譜?穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜至工作狀態(tài)；4)調(diào)整樣品中苯甲酸濃度；5)采用自動進樣器進行自動進樣并測定苯甲酸δ13C測定值；6)使用δ13C值已知的參考物質(zhì)校正儀器的測定系統(tǒng)偏差；7)根據(jù)系統(tǒng)偏正計算苯甲酸的δ13C值。本方法具有操作簡單、方便、檢測限低、結(jié)果穩(wěn)定的特點，避免了對手動進樣操作的依賴，可實現(xiàn)24h連續(xù)分析。【專利說明】在線測定牛奶中苯甲酸S13C值的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：[0001]本發(fā)明涉及在線測定牛奶中苯甲酸穩(wěn)定碳同位素比值(記作s13c)的方法，屬于穩(wěn)定同位素分析
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?！?br>背景技術(shù)：
】：[0002]"民以食為天，食以安為先"，我國對食品安全的監(jiān)管已上升到了國家戰(zhàn)略，2014年兩會政府工作報告及《食品安全法》修訂草案中提及"嚴守法規(guī)和標準，用最嚴格的監(jiān)管、最嚴厲的處罰、最嚴肅的問責，堅決治理餐桌上的污染，切實保障"舌尖上的安全"。但是，一些不法商人為追逐經(jīng)濟利益，在食品生產(chǎn)經(jīng)營活動中采用摻假、偷工減料、添加廉價原材料等行為牟取暴利，這種經(jīng)濟利益驅(qū)動型的摻假行為也會帶來食品安全問題，然而由于摻入的組分與食品既有成分相同，給檢測帶來了技術(shù)挑戰(zhàn)，也給監(jiān)管都來了難題。[0003]近年來，穩(wěn)定同位素技術(shù)在食品摻偽鑒別中起著越來越重要的作用，其原理是同位素自然分餾作用會影響物質(zhì)的同位素分布，而即使是同一種化合物，當來源不同時其同位素組成也是存在差異的，基于這一特點，穩(wěn)定同位素技術(shù)在食品摻偽鑒別中起著越來越重要的作用。[0004]牛奶是一種營養(yǎng)均衡的全價食品，在人們的膳食結(jié)構(gòu)中有其它食品無法替代的作用，年來我國乳業(yè)和乳品加工業(yè)得到了飛速發(fā)展。然而，生鮮牛乳產(chǎn)量急劇增長的同時，生鮮牛乳的質(zhì)量安全問題突現(xiàn)出來，已成為各級政府部門和消費者關(guān)注的焦點，尤其是三聚氰胺事件引起消費者對生鮮牛乳中非法添加成分的極大恐懼，引發(fā)消費者對國內(nèi)生鮮牛乳質(zhì)量安全的信任危機。[0005]苯甲酸(苯甲酸鈉以苯甲酸計)作為GB2760-2011中允許使用的食品添加劑，被廣泛應(yīng)用于酸性食品的保鮮，作為防腐劑以延長食品貨架期，然而并未將其列入生鮮牛乳的允許適用范圍之列。然而據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，動植物的代謝產(chǎn)物中天然存在著苯甲酸，因此，難以通過分析產(chǎn)品中苯甲酸的含量來辨別有無外源添加。天然存在的苯甲酸來自于動植物的生理代謝活動，而食品添加劑苯甲酸及其鈉鹽屬于工業(yè)制品，通常由是在鈷、錳等催化劑存在下用空氣氧化甲苯制得，或由鄰苯二甲酸酐水解脫羧制得的，因此在來源途徑上與天然苯甲酸完全不同，其同位素組成也會存在較大差異，因此可以結(jié)合穩(wěn)定同位素技術(shù)檢測食品及其相關(guān)制品中苯甲酸，分析是否有外源添加的可能。[0006]然而，穩(wěn)定同位素技術(shù)在食品領(lǐng)域的研究與應(yīng)用僅有40余年的歷史，該技術(shù)的研究與應(yīng)用仍處于發(fā)展中，而針對苯甲酸的碳同位素分析（S13C值）的報道比較少：Scharschmidt等（VariationofTransition-StateStructureasaFunctionoftheNucleotideinReactionsCatalyzedbyDehydrogenases-LiverAlcoholDehydrogenasewithBenzylAlcoholandYeastAldehydeDehydrogenasewithBenzaldehyde)人通過液液萃取法提取酵母提取液中苯甲酸，離線真空條件下將苯甲酸轉(zhuǎn)化成二氧化碳，再用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀分析，但該方法需要大量的苯甲酸樣品；Krummen等人（Anewconceptforisotoperatiomonitoringliquidchromatography/massspectrometry)和Heuer等人（Online513Canalysisofvolatilefattyacidsinsediment/porewatersystemsbyliquidchromatography-isotoperatiomassspectrometry)使用微進樣技術(shù)結(jié)合液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜技術(shù)測定了苯甲酸的S13C值，但是，該方法也僅適用于高純度苯甲酸樣品而且不能自動進樣，只能通過手動進樣的模式進行樣品分析，大大增加了工作量，無疑降低了工作效率，而與此同時，該方法雖然使用了液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀，但是該儀器僅起到了載流的作用，而不能分析混合物中的苯甲酉愛；Shexia(StablecarbonisotopiccompositionsoforganicacidsintotalsuspendedparticlesanddustsfromGuangzhou，China)等人使用氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀結(jié)合衍生降解技術(shù)測定了芳香族有機酸的S13C值，但該技術(shù)只能分析所有芳香族氨基酸平均的S13c值，而不能給出苯甲酸的S13c值，此外，前處理過程中的衍生和降解步驟也可能導(dǎo)致同位素分餾，使得測定結(jié)果不準確。有關(guān)牛奶中苯甲酸碳同位素分析的研究則未見報道。[0007]本發(fā)明開發(fā)了一種使用液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀在線測定牛奶中苯甲酸S13C的方法?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】：[0008](1)擬解決的問題[0009]苯甲酸作為一種高沸點有機物，需要一種簡單的、自動的測定混合物中苯甲酸的s13c值的方法，為牛奶中苯甲酸的來源分析提供方法基礎(chǔ)。[0010](2)本發(fā)明的具體方案[0011]本發(fā)明結(jié)合色譜分離理論、液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀的分析特性及穩(wěn)定同位素分析的原理和要求建立了牛奶中苯甲酸S13c值的測定。[0012]具體而言，本發(fā)明提供了測定牛奶中苯甲酸的S13c值的方法，優(yōu)選地，其中所述的牛奶需要經(jīng)過前處理后、以水為溶劑而值得制備液，如從牛奶中除去纖維素、蛋白質(zhì)、脂肪和大部分糖類(至少50%、60%、70%或80%的糖類，優(yōu)選90或95%的糖類）。[0013]本發(fā)明的方法采用液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測定牛奶樣品中苯甲酸的S13C值，其中包括牛奶樣品的前處理步驟、自動進樣、液相色譜分離、在線反應(yīng)裝置將苯甲酸氧化成二氧化碳，最后用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測定苯甲酸轉(zhuǎn)化來的二氧化碳的S13C值的步驟。[0014]更具體而言，本發(fā)明測定牛奶中苯甲酸S13C值的方法，包括以下步驟：[0015]D牛奶除雜；[0016]2)除去除雜過程中引入的有機溶劑；[0017]3)用水稀釋牛奶除雜后得到的制備液；[0018]4)過濾后放在液相色譜儀的樣品盤上；[0019]5)配有離子交換色譜柱的液相色譜，采用自動進樣器自動進樣，在流動相的作用下將牛奶中苯甲酸與其他有機組分分離；[0020]6)將液相色譜柱分離得到的苯甲酸直接導(dǎo)入在線反應(yīng)裝置中進行氧化處理，得到苯甲酸轉(zhuǎn)化的二氧化碳；[0021]7)用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測定該二氧化碳中S13C;[0022]8)計算牛奶樣品中苯甲酸的S13C值，優(yōu)選的，該值由苯甲酸標準物質(zhì)校正而來。[0023]上述步驟中，所述的牛奶除雜是指通過除去不溶性的纖維素、脂肪和蛋白質(zhì)，以及牛奶中大部分的糖類。[0024]所述的牛奶樣品經(jīng)處理后溶解在水中，苯甲酸的含量應(yīng)為0.1~1.2g/L，優(yōu)選為0.3g/L〇[0025]所述液相色譜條件參數(shù)如下：流動相為pH為2的硫酸溶液;色譜柱溫度為65°C;流動相流速為〇.3mL/min;進樣體積20yL。[0026]優(yōu)選地，液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的條件如下：[0027]色譜條件:HyperREZXPCarbonhydrateH+液相色譜柱（300mm*7.7mm*8iim);流動相為pH=2的硫酸溶液;進樣體積20yL;[0028]調(diào)整液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的參數(shù):設(shè)定流動相流速為0.3mL/min;設(shè)定色譜柱溫度為65°C;同時監(jiān)測m/z=32、33和34的離子流信號強度，確保m/z=32的離子流信號強度為l〇〇〇〇mV。[0029]任選地，確認穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀的工作環(huán)境、氣密性、離子室的真空度均符合要求，然后檢驗儀器測定C02中S13C的精密度和穩(wěn)定性，必要時調(diào)整離子源參數(shù)值;設(shè)置在線反應(yīng)裝置的參數(shù)，例如確保在線反應(yīng)裝置具有氧化性，溫度設(shè)置為99.8°C。[0030](3)有益效果：[0031]本發(fā)明的原理是通過除雜排除蛋白質(zhì)、脂肪和糖對牛奶樣品中苯甲酸分析的干擾，根據(jù)各有機成分在色譜柱中的保留時間差異分開苯甲酸和其他有機組分，優(yōu)化液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的條件，將苯甲酸氧化生成C02進行碳同位素比值分析。本發(fā)明首次實現(xiàn)了可以不經(jīng)過完全離線提純苯甲酸、不存在衍生和裂解反應(yīng)引發(fā)的同位素分餾風(fēng)險以及自動進樣、自動分離并測定牛奶中苯甲酸S13C，有利于苯甲酸穩(wěn)定同位素技術(shù)在牛奶質(zhì)量安全控制研究與應(yīng)用?！揪唧w實施方式】：[0032]下面將通過借助以下實施例來更詳細地說明本發(fā)明。以下實施例僅是說明性的，應(yīng)該明白，本發(fā)明并不受下述實施例的限制。[0033]實施例一：[0034]1材料方法[0035]1.1儀器[0036]液相色譜儀（LC)，在線轉(zhuǎn)化裝置（IsoLink)，穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀（DeltaVAdvantage)，上述儀器均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電子分析天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司）；過濾器。[0037]1.2試劑[0038]苯甲酸工作標準物質(zhì)（S13CPDB=-27.37%。）；屈臣氏蒸餾水;濃硫酸;過二硫酸鈉;正磷酸。[0039]1.3前處理條件[0040]以苯甲酸工作標準物質(zhì)和蒸餾水為研究對象，配制〇.3g/L的苯甲酸水溶液，置于2mL進樣小瓶中。[0041]1.4在線反應(yīng)裝置的工作條件[0042]配制80g/L的磷酸水溶液，配制40g/L的過二硫酸鈉水溶液，設(shè)定在線反應(yīng)裝置工作溫度為65°C，磷酸水溶液和過二硫酸鈉水溶液的流速均為60yL/min。[0043]1.5液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的條件[0044]色譜條件:HyperREZXPCarbonhydrateH+液相色譜柱（300mm*7.7mm*8iim);流動相為pH=2的硫酸溶液;進樣體積20yL。[0045]調(diào)整液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的參數(shù):設(shè)定流動相流速為0.3mL/min;設(shè)定色譜柱溫度為65°C;同時監(jiān)測m/z=32、33和34的離子流信號強度，確保m/z=32的離子流信號強度為l〇〇〇〇mV。[0046]1.6測定結(jié)果[0047]苯甲酸水溶液經(jīng)自動進樣器自動采樣、進樣后，在色譜柱中進行反復(fù)吸附、解析后形成完整色譜峰，經(jīng)在線轉(zhuǎn)化裝置中轉(zhuǎn)化成C02,用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測定S13C，連續(xù)10次在線測定的結(jié)果如表1所示。[0048]表1苯甲酸水溶液的重復(fù)測定結(jié)果[0050]由上表可知，本發(fā)明提供的方法實現(xiàn)了苯甲酸溶液的自動進樣，苯甲酸的保留時間為2600s，而續(xù)10次在線測定的標準偏差僅為0.18%。，滿足國際上對有機物碳同位測定的重復(fù)性要求。[0051]實施例二[0052]2材料方法[0053]2.1儀器[0054]液相色譜儀（IX)，在線轉(zhuǎn)化裝置（IsoLink)，穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀（DeltaVAdvantage)，上述儀器均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電子分析天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司）；過濾器;高速離心機;超聲振蕩儀;氮吹儀。[0055]2.2試劑[0056]市售牛奶;屈臣氏蒸餾水;濃硫酸;過二硫酸鈉;正磷酸。[0057]2.3樣品除雜[0058]以市售牛奶為研究對象，按照國標GB21703中處理牛奶樣品的方法進行預(yù)處理，除去蛋白質(zhì)脂肪及大部分乳糖，使用氮吹儀除去上述過程中引入的有機試劑，得到樣品混合物。[0059]用蒸餾水溶解樣品混合物，保存于2mL進樣小瓶中。[0060]2.4在線反應(yīng)裝置的工作條件[0061]配制80g/L的磷酸水溶液，配制40g/L的過二硫酸鈉水溶液，設(shè)定在線反應(yīng)裝置工作溫度為65°C，磷酸水溶液和過二硫酸鈉水溶液的流速均為60yL/min。[0062]2.5液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的條件[0063]色譜條件:HyperREZXPCarbonhydrateH+液相色譜柱（300mm*7.7mm*8iim);流動相為pH=2的硫酸溶液;進樣體積20yL。[0064]調(diào)整液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的參數(shù):設(shè)定流動相流速為0.3mL/min;設(shè)定色譜柱溫度為65°C;同時監(jiān)測m/z=32、33和34的離子流信號強度，確保m/z=32的離子流信號強度為l〇〇〇〇mV。[0065]2.6測定結(jié)果[0066]牛奶樣品經(jīng)除雜后用水溶解，通過自動進樣器自動采樣、進樣后，在色譜柱中進行反復(fù)吸附、解析后形成完整色譜峰，經(jīng)在線轉(zhuǎn)化裝置中轉(zhuǎn)化成C02,用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測定S13C，連續(xù)10次在線測定的結(jié)果如表2所示。[0067]表2牛奶中苯甲酸重復(fù)測定結(jié)果[0069]由質(zhì)譜圖（圖略）可知，牛奶樣品即使經(jīng)除雜步驟，剩余物中也是各有機物的混合物，而不僅僅是苯甲酸，在這種情況下，意圖通過離線的前處理方式獲得純的苯甲酸用于同位素組成分析是很困難的。使用本方法，雖然樣品瓶中是苯甲酸與其他有機物的混合物，但自動進樣自動采集樣品并進樣，提高了工作效率，并且利用液相色譜柱的分離作用實現(xiàn)了苯甲酸與其他有機物質(zhì)的有效分離。由表2可知，盡管測定結(jié)果的最大偏差為0.75%。，但10次測定的標準偏差僅為0.21%。，這說明盡管樣品中成分比較復(fù)雜，但是該發(fā)明的方法能夠排除其他有機成分對樣品的苯甲酸衍生物S13C測定的干擾，該精密度也滿足碳同位素組成分析的重復(fù)性要求。[0070]實施例三[0071]3材料方法[0072]3.1儀器[0073]液相色譜儀（IX)，在線轉(zhuǎn)化裝置（IsoLink)，穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀（DeltaVAdvantage)，上述儀器均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電子分析天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司）；過濾器;高速離心機;超聲振蕩儀;氮吹儀。[0074]3.2試劑[0075]苯甲酸工作標準物質(zhì)(S13CPDB=-27.37%Q);市售牛奶(與實施例二相同）；屈臣氏蒸餾水;濃硫酸;過二硫酸鈉;正磷酸。[0076]3.3樣品準備[0077]根據(jù)市售牛奶的苯甲酸含量，按照其苯甲酸含量25%、50%、75%的比例加入苯甲酸工作標準物質(zhì)，[0078]3.4樣品除雜[0079]以市售牛奶為研究對象，按照國標GB21703中處理牛奶樣品的方法進行預(yù)處理，除去蛋白質(zhì)脂肪及大部分乳糖，使用氮吹儀除去上述過程中引入的有機試劑，得到樣品混合物。[0080]用蒸餾水溶解樣品混合物，保存于2mL進樣小瓶中。[0081]3.5在線反應(yīng)裝置的工作條件[0082]配制80g/L的磷酸水溶液，配制40g/L的過二硫酸鈉水溶液，設(shè)定在線反應(yīng)裝置工作溫度為65°C，磷酸水溶液和過二硫酸鈉水溶液的流速均為60yL/min。[0083]3.6液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的條件[0084]色譜條件:HyperREZXPCarbonhydrateH+液相色譜柱（300mm*7.7mm*8iim);流動相為pH=2的硫酸溶液;進樣體積20yL。[0085]調(diào)整液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的參數(shù):設(shè)定流動相流速為0.3mL/min;設(shè)定色譜柱溫度為65°C;同時監(jiān)測m/z=32、33和34的離子流信號強度，確保m/z=32的離'流信號強度為l〇〇〇〇mV。[0086]3.7測定結(jié)果[0087]由實施例二可知，該牛奶樣品中苯甲酸S13C的平均測定結(jié)果為-14.92%。，因此可以根據(jù)加標量以及苯甲酸標準物質(zhì)的S13c值預(yù)測牛奶加標后的苯甲酸S13〇j_(見表3)。牛奶加標樣品經(jīng)除雜后用水溶解，通過自動進樣器自動采樣、進樣后，在色譜柱中進行反復(fù)吸附、解析后形成完整色譜峰，經(jīng)在線轉(zhuǎn)化裝置中轉(zhuǎn)化成C02，用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測定，結(jié)果如表3所示。[0088]表3牛奶加標樣品中苯甲酸S13C值測定結(jié)果[0090]由表3可知，加標樣品中苯甲酸S13C的測定值與預(yù)測值存在差異，這是由于儀器的測定誤差決定的，當然，樣品除雜過程中也可能會導(dǎo)致苯甲酸S13C發(fā)生變化，但是，對表3數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明加標樣品苯甲酸S13C的測定結(jié)果與加標量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達0.99%，這說明本方法能夠準確測定混合物中苯甲酸S13C值。[0091]最后應(yīng)當說明的是，以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。【主權(quán)項】1.一種應(yīng)用液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜在線測定牛奶中苯甲酸δ13(：值的方法，包括以下步驟：1)對所測定的牛奶進行除雜，以除去其中的纖維素、脂肪和蛋白質(zhì)，以及牛奶中大部分的糖類；2)除去除雜過程中引入的有機溶劑；3)用水稀釋除雜后得到制備液;和4)將制備液進樣至液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀以測定牛奶中苯甲酸的δ13(：值。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中牛奶中苯甲酸與其他有機物經(jīng)液相色譜分離后，在反應(yīng)爐中轉(zhuǎn)化為C02后進行穩(wěn)定同位素比值分析，得到苯甲酸的δ13〇?Μ直。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中液相色譜所使用的流動相為硫酸和超純水配制的pH為0~6的溶液，優(yōu)選pH為2。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中液相色譜所使用的色譜柱為氫離子交換色譜柱，優(yōu)選為HyperREZXPCarbonhydrateH+液相色譜柱。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中稀釋后的苯甲酸含量為0.1~1.2g/L，優(yōu)選為〇.3g/L。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的進樣是自動進樣。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于調(diào)整液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜的參數(shù):設(shè)定流動相流速為0.25~0.6mL/min，優(yōu)選為0.3mL/min;設(shè)定色譜柱溫度為20~75°C，優(yōu)選為65°C;同時監(jiān)測m/z=32、33和34的離子流信號強度，確保m/z=32的離子流信號強度為8000mV~18000mV，優(yōu)選為1OOOOmV。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中用δ13(：值已知的物質(zhì)校正儀器的系統(tǒng)偏差A(yù)13C，即，采用與牛奶測定時相同的儀器參數(shù)測定參考物質(zhì)或工作標準物質(zhì)，得出測定值313(^，與其已知的記為S13Co的δ13(：值相比較得出儀器的系統(tǒng)偏差Δ13C:Δ9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述牛奶是市售牛奶。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述除雜處理是按照國標GB21703進行的?！疚臋n編號】G01N30/02GK106053637SQ201610353980【公開日】2016年10月26日【申請日】2016年5月25日【發(fā)明人】鐘其頂,王道兵【申請人】中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院