一種燙骨碎補配方顆粒特征圖譜及其建立方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種燙骨碎補配方顆粒特征圖譜及其建立方法。該特征圖譜以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動相A，以0.1 v/v％磷酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為290nm；柱溫為20℃；流速為每分鐘1.0ml。理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應(yīng)不低于50000。供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)6個特征峰，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5％之內(nèi)。規(guī)定值為：0.299（峰1）、0.446（峰2）、0.557（峰3）、0.579（峰4）、0.911（峰5）、1.00（峰6）。本方法根據(jù)配方顆粒的特點，加強專屬性鑒別和多成分、整體質(zhì)量控制，特建立了該品種的特征圖譜，進行全面質(zhì)量控制。
【專利說明】
一種燙骨碎補配方顆粒特征圖譜及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種燙骨碎補配方顆粒特征圖譜及其建立 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨碎補，為水龍骨科植物槲蕨的干燥根莖，療傷止痛，補腎強骨，外用消風(fēng)祛斑，該 藥材及其飲片的質(zhì)量標準收載于《中國藥典》2015年版一部。然而，關(guān)于燙骨碎補配方顆粒 卻缺乏相應(yīng)的質(zhì)量標準。
[0003] 目前，公開關(guān)于燙骨碎補配方顆粒的測定方法的有《燙骨碎補配方顆粒的提取工 藝優(yōu)選及其含量測定》，其采用HPLC測定柚皮苷含量，流動相甲醇-乙酸-水(35:4:65 )，檢測 波長283nm。結(jié)果:最佳提取工藝為浸泡0.5h，加10，8倍量水提取2次，每次0.5h;柚皮苷質(zhì)量 分數(shù)0.77 %，出膏率12.6 %。柚皮苷在0.063-1.575yg與峰面積呈良好線性關(guān)系，平均加樣 回收率100.70%，RSD 1.2%;暫定本品配方顆粒每lg含柚皮苷彡5.Omg。結(jié)論:該提取工藝 和含量測定方法穩(wěn)定可行，有效成分提取效率高，為燙骨碎補配方顆粒的生產(chǎn)和質(zhì)量控制 提供參考。但是，該文獻是燙骨碎補配方顆粒的提取工藝及含量測定，其含量測定部分僅僅 測定柚皮苷的含量，沒有對其他成分進行控制，僅僅對其中的某一個成分進行含量測定，專 屬性不強。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明正是針對以上技術(shù)問題，提供一種燙骨碎補配方顆粒特征圖譜及其建立 方法，該方法根據(jù)配方顆粒的特點，加強專屬性鑒別和多成分、整體質(zhì)量控制，建立了該品 種的特征圖譜，進行全面質(zhì)量控制。
[0005] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0006] -種燙骨碎補配方顆粒特征圖譜的建立方法，包括以下步驟：
[0007] 參照物溶液的制備取5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、柚皮苷對照品適量，加甲醇制成每 lml分別含20yg、80yg、60yg的溶液，即得參照物溶液；
[0008] 供試品溶液的制備取燙骨碎補配方顆粒適量，研細，取0.2g，精密稱定，置具塞錐 形瓶中，加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，加熱回流40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減 失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得供試品溶液；
[0009] 測定分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各lOiil，注入液相色譜儀，按照高效 液相色譜法測定，記錄色譜圖，即得燙骨碎補配方顆粒特征圖譜；
[0010] 其中色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動相A，以0. lv/ v%磷酸溶液為流動相B，按規(guī)定進行梯度洗脫，檢測波長為290nm;柱溫為20°C ;流速為每分 鐘1?0ml。
[0011] 所述的按規(guī)定進行梯度洗脫的條件為：
[0012] O-lOmin，流動相A的體積百分比為2%-15%，流動相B的體積百分比為98%-89% ; 10-15min，流動相A的體積百分比為15%，流動相B的體積百分比為85% ; 15-27min，流動相A 的體積百分比為15%-27%，流動相B的體積百分比為85%-73% ;27-35min，流動相A的體積 百分比為27%-40%，流動相B的體積百分比為73%-60% ; 35-50min，流動相A的體積百分比 為40 %-50 %，流動相B的體積百分比為60 %-50 %。
[0013]燙骨碎補配方顆粒特征圖譜，該特征圖譜中呈現(xiàn)6個特征峰，其中3個峰應(yīng)分別與 相應(yīng)的參照物峰保留時間相同，與柚皮苷參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計算特征峰與峰6的相 對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的± 5 %之內(nèi)。規(guī)定值為:峰1，0.299、峰2，0.446、 峰3,0.557、峰4,0.579、峰5,0.911、峰6，1.00。
[0014]本發(fā)明的積極效果體現(xiàn)在：
[0015] ( -）、根據(jù)配方顆粒的特點，加強專屬性鑒別和多成分、整體質(zhì)量控制，建立了該 品種的特征圖譜，進行全面質(zhì)量控制，
[0016] (二）、燙骨碎補配方顆粒為中藥飲片的延伸形式，失去了飲片所特有的性狀及顯 微特性，本發(fā)明提供燙骨碎補配方顆粒整體化學(xué)成分的鑒別，專屬性強。
【附圖說明】
[0017] 圖1為實施方式中的對照特征圖譜;其中，峰1為5-羥甲基糠醛，峰2為原兒茶酸，峰 6(S)為柚皮苷。
[0018] 圖2為實施例1中波長的選擇特征圖譜。
[0019 ]圖3為實施例1中柱溫的選擇特征圖譜。
[0020] 圖4為燙骨碎補配方顆粒流動相考察特征圖譜。
[0021] 圖5為燙骨碎補配方顆粒色譜峰指認特征圖譜。
[0022] 圖6為燙骨碎補配方顆粒色譜柱的考察特征圖譜。
[0023]圖7為實施例中7批燙骨碎補配方顆粒特征圖譜。
【具體實施方式】
[0024]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合【具體實施方式】對 本發(fā)明作進一步的詳細描述，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實施 例。
[0025]照高效液相色譜法(《中國藥典》2015年版一部附錄VI D)測定，其中峰6即峰S。
[0026] 燙骨碎補配方顆粒特征圖譜的建立方法：
[0027] 參照物溶液的制備取5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、柚皮苷對照品適量，加甲醇制成 每lml分別含20yg、80yg、60yg的溶液，即得參照物溶液。
[0028] 供試品溶液的制備取本品適量，研細，取約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密 加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，加熱回流40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重 量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。
[0029] 測定法分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各lOiil，注入液相色譜儀，測定， 記錄色譜圖，即得燙骨碎補配方顆粒特征圖譜；
[0030] 其中色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠（菲羅門Luna C18(2)100A4.6X 250mm，5Mi)為填充劑；以甲醇為流動相A，以O(shè).lv/v%磷酸溶液為流動相B，按規(guī)定進行梯度 洗脫，檢測波長為290nm;柱溫為20°C;流速為每分鐘1.0ml，理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應(yīng)不 低于50000。
[0031]其中按規(guī)定進行梯度洗脫的條件為：
[0032] 0-10min，流動相A的體積百分比為2%-15%，流動相B的體積百分比為98%-89% ; 10-15min，流動相A的體積百分比為15%，流動相B的體積百分比為85% ; 15-27min，流動相A 的體積百分比為15%-27%，流動相B的體積百分比為85%-73% ;27-35min，流動相A的體積 百分比為27%-40%，流動相B的體積百分比為73%-60% ; 35-50min，流動相A的體積百分比 為40 %-50 %，流動相B的體積百分比為60 %-50 %。
[0033]供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)6個特征峰，其中3個峰應(yīng)分別與相應(yīng)的參照物峰保留時 間相同，與柚皮苷參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計算特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留 時間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。規(guī)定值為:0.299(峰1)、0.446(峰2)、0.557(峰3)、0.579(峰 4)、0.911 (峰5)、1.00(峰6，也為峰S)，具體對照特征圖譜見圖1，該燙骨碎補配方顆粒的液 相特征圖譜的建立，可作為燙骨碎補配方顆粒的整體質(zhì)量控制方法。
[0034] 實施例1:
[0035] 1、材料、試劑與儀器
[0036] 1.1實驗儀器
[0037] Agilent 1200series 高效液相色譜儀；
[0038] 色譜柱:菲羅門luna 5u C18(2)4.6*250mm(方法學(xué)考察）
[0039] 1.2試劑及試藥
[0040] 甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。
[00411 柚皮苷（中國藥品生物制品檢定所110722-201312,含量為94.7%)，5_羥甲基糠醛 (中國藥品生物制品檢定所111626-201509,含量為97.8%)，原兒茶酸（中檢所110809-200604)，
[0042]燙骨碎補配方顆粒(批號：新綠色 1501087、1403058、1408098、1404042、1509078、 1404172^1409058)
[0043] 2、供試品溶液的制備
[0044] 照實施方式中供試品溶液的制備方法將以上批號的燙骨碎補配方顆粒制備成供 本實施例檢測的供試品溶液。
[0045] 3、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗
[0046] 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(菲羅門Luna C18(2)100A 4.6X250mm，5_); 以甲醇為流動相A，以O(shè).lv/v%磷酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫;檢測波 長為290nm;柱溫為20 °C;流速為每分鐘1.0ml。理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應(yīng)不低于50000。流 動性梯度洗脫表見表1。
[0047] 表1流動性梯度洗脫表
[0048]

[0050] 3.1波長選擇：比較了檢測波長 283nm、263nm、254nm、290nm、300nm、330nm、220nnTf 的色譜峰，而在290nm下的色譜峰分數(shù)較多且各峰之間的分離度較好，信息量大，基線平穩(wěn)， 故檢測波長確定為290nm，見圖2 〇
[0051 ] 3.2柱溫考察：比較了20°C，25°C，30°C的色譜圖，結(jié)果顯示20°C的色譜峰峰形最為 對稱，分離度最好，故柱溫確定為20°C，見圖3。
[0052] 3.3流動相選擇:本實驗考察了3種不同流動相的分離效果，分別為：1:甲醇-水-醋 酸梯度洗脫(藥典方法）；II:乙腈-0.1 % v/V磷酸梯度洗脫；m:甲醇-0. lv/v%磷酸梯度洗 脫。結(jié)果表明：
[0053] 流動相III分離條件下色譜峰多，且理論板數(shù)、分離度、對稱性均更好，故將流動相 III作為燙骨碎補配方顆粒特征圖譜測定方法的流動相。結(jié)果如圖4。
[0054] 4、色譜峰的指認
[0055] 采用柚皮苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸等對照品進行定位，結(jié)果表明：峰1為5-羥甲 基糠醛，峰2為原兒茶酸，峰6為柚皮苷。見圖5。
[0056] 5、方法學(xué)考察
[0057] 5.1進樣精密度試驗
[0058] 取燙骨碎補配方顆粒(批號：1501087)供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10yl，以峰1 (5-羥甲基糠醛）、峰2(原兒茶酸）、峰3、峰4、峰5作為指標峰，計算同峰6(S)(柚皮苷)的相對 保留時間及相對峰面積，結(jié)果相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于2.0%，表明該方法 進樣精密度良好。見表2和表3。
[0059] 表2進樣精密度考察-特征峰相對保留時間比值
[0060]

[0062] 表3進樣精密度考察一特征峰相對峰面積比值[0063]
[0064] 5.2重復(fù)性考察
[0065]精密稱取燙骨碎補配方顆粒（批號為1501087)6份，按照擬定方法進行制備及測 定，結(jié)果各指標特征峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于2.0%，表明該方法重復(fù) 性好。見表4和表5。
[0066] 表4重復(fù)性考察-特征峰相對保留時間比值
[0068] 表5重復(fù)性考察-特征峰相對峰面積比值
[0069]
[0070] 5.3溶液穩(wěn)定性考察
[0071 ]取同一供試品溶液，分別于0，2，5，8，，15，24h測定，對其中的特征峰進行分析，其 相對應(yīng)的色譜峰相對保留時間均小于2.0%，特征峰的相對峰面積的RSD均小于2.0%，結(jié)果 表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。見表6和表7.
[0072]表6穩(wěn)定性考察一特征峰相對保留時間
[0074] 表7穩(wěn)定性考察一特征峰相對峰面積比值
[0075]
[0076] 5.4耐用性考察
[0077] 5.4.1色譜柱耐用性采用不同品牌和長度的C18色譜柱按照擬定的方法對本品進 行特征圖譜檢測，結(jié)果部分特征峰的相對保留時間超出規(guī)定范圍，結(jié)果表明本方法對不同 品牌及長度色譜柱的耐用性較差，因此應(yīng)固定色譜柱進行測定。最終標準正文中固定菲羅 門luna 5u C18(2)4.6*250mm這一品牌色譜柱進行檢測，見圖6。
[0078] 6、特征峰的確定及對照圖譜的建立
[0079] 采用擬定的方法對本品7批樣品進行特征圖譜的測定，根據(jù)相對保留時間穩(wěn)定及 各企業(yè)各批次樣品均能檢出且峰相對較高的原則，共選擇了 5個重復(fù)性較好的峰作為特征 峰。最終規(guī)定:供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)5個特征峰，其中2個峰應(yīng)分別與相應(yīng)的參照物峰保 留時間相同，與柚皮苷參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計算特征峰與S峰的相對保留時間，其相對 保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。規(guī)定值為:0.446(峰1)、0.557(峰2)、0.579(峰3)、0.911 (峰 4)、1.00(峰 6)。見表 8.
[0080] 表8 7批燙骨碎補配方顆粒相對保留時間
[0081]
[0082] 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版)對7批樣品進行合成，建立了燙 骨碎補配方顆粒特征圖譜的對照圖譜，見圖7。
[0083] 對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。 對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的 一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明 將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一 致的最寬的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種燙骨碎補配方顆粒特征圖譜的建立方法，其特征在于包括以下步驟： 參照物溶液的制備取5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、柚皮苷對照品適量，加甲醇制成每lml 分別含20yg、80yg、60yg的溶液，即得參照物溶液； 供試品溶液的制備取燙骨碎補配方顆粒適量，研細，取〇. 2g，精密稱定，置具塞錐形瓶 中，加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，加熱回流40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的 重量，搖勻，濾過，取濾液，即得供試品溶液； 測定分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各1〇μ1，注入液相色譜儀，按照高效液相 色譜法測定，記錄色譜圖，即得燙骨碎補配方顆粒特征圖譜； 其中色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動相A，以0.1 v/v% 磷酸溶液為流動相Β，按規(guī)定進行梯度洗脫，檢測波長為290nm;柱溫為20°C ;流速為每分鐘 1.0ml〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述燙骨碎補配方顆粒特征圖譜的建立方法，其特征在于所述的按 規(guī)定進行梯度洗脫的條件為： 0-10min，流動相A的體積百分比為2%-15%，流動相B的體積百分比為98%-89%; 10-15min，流動相A的體積百分比為15%，流動相B的體積百分比為85%; 15-27min，流動相A的體積百分比為15%-27%，流動相B的體積百分比為85%-73%; 27-35min，流動相A的體積百分比為27%-40%，流動相B的體積百分比為73%-60%; 35-50min，流動相A的體積百分比為40%-50%，流動相B的體積百分比為60%-50%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述燙骨碎補配方顆粒特征圖譜的建立方法建立的特征圖譜，其特 征在于： 特征圖譜中呈現(xiàn)6個特征峰，其中3個峰應(yīng)分別與相應(yīng)的參照物峰保留時間相同，與柚 皮苷參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計算特征峰與峰6的相對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī) 定值的 ±5%之內(nèi)，規(guī)定值為：峰1，0.299、峰2,0.446、峰3,0.557、峰4,0.579、峰5,0.911、 峰6,1.00。
【文檔編號】G01N30/02GK106053658SQ201610514569
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】周厚成, 胡昌江, 周維, 李文兵, 馮健
【申請人】四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司