一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種可替寧檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法，具體涉及一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法，包括：抗可替寧特異性抗體、用于檢測(cè)抗可替寧特異性抗體?可替寧復(fù)合物的指示試劑；上述抗可替寧特異性抗體由可替寧免疫原免疫動(dòng)物得到。本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明的可替寧免疫原特異性強(qiáng)、免疫原性高，制備出的抗可替寧特異性抗體特異性強(qiáng)、效價(jià)高，并且與常見(jiàn)的62種藥物無(wú)任何交叉反應(yīng)；含有上述抗可替寧特異性抗體的均相酶免疫檢測(cè)試劑可以方便、快速、準(zhǔn)確地確定樣品中的可替寧含量，并且可以在全自動(dòng)生化分析儀上同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，實(shí)現(xiàn)可替寧的高通量快速化測(cè)定，準(zhǔn)確度高，特異性強(qiáng)，精確度和檢測(cè)效率有了較大的提高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種可替寧檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法，具體涉及一種可替寧均相 酶免疫檢測(cè)試劑及其制備和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 可替寧(Cotinine)結(jié)構(gòu)式如式（m)所示： 式(m)
隨著時(shí)代的發(fā)展，吸煙引起的危害已成為當(dāng)今世界最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。各國(guó) 政府對(duì)吸煙及二手煙的暴露所引起的社會(huì)健康問(wèn)題給予了極大關(guān)注和巨大的經(jīng)濟(jì)投入。國(guó) 內(nèi)外已有眾多研究報(bào)道了煙草中各種成分對(duì)于人體的危害，煙草在燃燒過(guò)程中釋放出4000 多種化學(xué)成分，能引發(fā)多種疾病，嚴(yán)重危害人體健康。2005年，中國(guó)作為履約國(guó)簽署《煙草控 制框架公約》，使控?zé)熅哂蟹梢罁?jù);2012年，中國(guó)政府發(fā)布《中國(guó)煙草控制規(guī)劃(2012-2015 年)》，提出創(chuàng)造無(wú)煙環(huán)境，實(shí)施公共場(chǎng)所全面禁煙。
[0003] 煙堿，俗稱(chēng)尼古丁 (nicotine)，是一種存在于茄科植物煙草中的主要生物堿，在煙 草中平均含量達(dá)4%，約占煙草中生物堿總量的90%以上，煙堿是導(dǎo)致吸煙成癮或煙草依賴(lài) 的主要因素。煙草中的煙堿約有40%直接轉(zhuǎn)移到卷煙主流煙氣和側(cè)流煙氣中，進(jìn)入人體內(nèi) 的尼古丁經(jīng)口腔、喉部、氣管以及肺泡吸收進(jìn)入血液循環(huán)，其中約80%在肝臟中的細(xì)胞色素 氧化酶P450-2A6 (CYP450-2A6)的作用下首先被代謝為可替寧（cotinine)，再經(jīng)肝臟進(jìn)一 步代謝，形成多種代謝產(chǎn)物，之后通過(guò)尿液、唾液、汗液等途徑排出體外。尼古丁主要代謝產(chǎn) 物有可替寧及其糖苷、3-羥基可替寧及其糖苷、尼古丁糖苷、降煙堿、降可替寧、尼古丁氮氧 化物、可替寧氮氧化物，這些代謝產(chǎn)物約占人體吸收尼古丁總量的90%以上，其中可替寧占 所有代謝物的70%_80%。研究證明：煙堿及其代謝物對(duì)人體的生理作用主要包括對(duì)中樞神 經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等的影響。主動(dòng)吸煙時(shí)，煙堿大量吸收會(huì)加快心率，升高 血壓，并降低食欲，大劑量的尼古丁會(huì)引起惡心嘔吐，嚴(yán)重時(shí)會(huì)誘發(fā)癌癥，導(dǎo)致死亡;被動(dòng)吸 煙時(shí)，低含量生物堿雖沒(méi)有大劑量煙堿毒性大，但也會(huì)對(duì)身體健康產(chǎn)生不利影響，如導(dǎo)致呼 吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病等多種疾病。
[0004] 尼古丁及其主要代謝物可替寧能隨血液分布到人體各個(gè)部位，血液、尿液、乳汁、 唾液、精液和頭發(fā)等生物樣品中都可檢測(cè)到這些物質(zhì)。但是，尼古丁在體內(nèi)的半衰期僅為2 ~3h，僅能反映過(guò)去幾個(gè)小時(shí)的攝入情況，而可替寧的半衰期長(zhǎng)達(dá)70~100h，可以反映過(guò)去 3~4d的攝入情況，并且由于尼古丁是可替寧的唯一來(lái)源，且受飲食因素的影響較小，因此 可替寧已成為目前公認(rèn)的評(píng)估受檢者煙氣暴露程度、吸煙量以及吸煙對(duì)人體健康影響程度 最有效的生物標(biāo)志物。
[0005] 目前，文獻(xiàn)報(bào)道的可替寧測(cè)定方法主要有:酶聯(lián)免疫法、薄層色譜、巴比妥酸法、毛 細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光法、氣相色譜法、氣液色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、放射免疫分析法等。但是這些傳統(tǒng)檢測(cè)方法 大都具有儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣，需要使用大量有毒有害的有機(jī)溶劑， 易對(duì)環(huán)境造成污染，且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有較高的技術(shù)要求等諸多缺陷，因此不利于推廣使用。目 前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)實(shí)用性強(qiáng)、性價(jià)比高的可替寧等煙堿代謝物快速檢測(cè)方法和產(chǎn)品。因此，研 究開(kāi)發(fā)快速、靈敏、高通量、自動(dòng)化的可替寧檢測(cè)分析方法及產(chǎn)品，已受到了生物醫(yī)學(xué)、煙草 科技、醫(yī)療健康及環(huán)境衛(wèi)生等多個(gè)領(lǐng)域的廣泛重視。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種既安全又可快速、高效、靈 敏、準(zhǔn)確檢測(cè)出待測(cè)樣本中可替寧含量的可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑及其制備方法，以及 可以與各種類(lèi)型的自動(dòng)生化分析儀聯(lián)用、對(duì)檢測(cè)人員要求不高的可替寧均相酶免疫檢測(cè)方 法。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的為提供一種有助于制備快速準(zhǔn)確測(cè)定可替寧含量的可替寧 均相酶免疫檢測(cè)試劑的可替寧衍生物。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是： 一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑，包括:抗可替寧特異性抗體、用于檢測(cè)抗可替寧特異 性抗體-可替寧復(fù)合物的指示試劑;上述抗可替寧特異性抗體由可替寧免疫原免疫動(dòng)物得 到，可替寧免疫原的結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：
式(I) 式中，載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)；上述指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、 熒光試劑或化學(xué)發(fā)光試劑。
[0009] 上述指示試劑選自酶試劑，包括:酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物;上述酶標(biāo)偶聯(lián)物包括葡 萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物;上述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸； 所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與可替寧衍生 物反應(yīng)形成。
[0010] 上述可替寧衍生物的結(jié)構(gòu)式如式（n)所示： 式（n)
可替寧衍生物的合成方法，其特征在于，合成路線為：
一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 可替寧衍生物的合成與純化，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定； (2) 可替寧免疫原的合成:使可替寧衍生物與具有免疫原性的蛋白質(zhì)載體連接； (3) 用可替寧免疫原免疫動(dòng)物，制備并純化抗可替寧特異性抗體； (4) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物的制備:制備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液，激 活可替寧衍生物，使葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與可替寧衍生物連接，純化連接產(chǎn)物； (5) 可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備： 試劑A的制備：由抗可替寧特異性抗體和均相酶底物混合而成； 試劑B的制備：由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物與Tris緩沖液混合而成。
[0011]前述的一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，所述的步驟(2)中，蛋白質(zhì)載 體為BSA，具體合成步驟如下： a.稱(chēng)取1.0~5.0 g磷酸二氫鉀、2.0~8.0 g磷酸氫二鈉、5.0~15.0 g氯化鈉、0.5~ 1.5 g氯化鎂，共同溶解于1.0~3.0 L去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.0~8.0,制成緩沖溶液A; b. 稱(chēng)取2.0~5.0 mg BSA，室溫下溶解于2.0~5.0 mL上述緩沖溶液A中，制成BSA溶液； c. 稱(chēng)取2.0~5.0 mg可替寧衍生物，溶解于200.0~500.0 yl上述緩沖溶液A中，制成可 替寧衍生物溶液； d. 當(dāng)上述可替寧衍生物溶液剛變澄清時(shí)，將其逐滴加入上述BSA溶液中，然后將此混合 溶液在2-8 °C下攪拌0.5~3.0小時(shí)； e. 將反應(yīng)后的上述混合溶液用上述緩沖溶液A進(jìn)行透析，透析后所得溶液即為可替寧 免疫原溶液，在可替寧免疫原溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 05%~0.3%的NaN3，于-20 °C下儲(chǔ)存。
[0012] 前述的一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，所述的步驟(4)具體過(guò)程為： a. 稱(chēng)取1.0~5.0 g磷酸二氫鉀、1.0~5.0 g磷酸氫二鈉、5.0~15.0 g氯化鈉、0.5~ 1.5 g氯化鎂，共同溶解于1.0~3.0 L去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.0~8.0,制成緩沖溶液B; b. 稱(chēng)取5.0~20.0 mg葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，室溫下溶解于2.5~15.0 mL上述緩沖溶 液B中，調(diào)節(jié)pH至8.5，制成葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液； c. 稱(chēng)取2.0~5.0 mg可替寧衍生物，溶解于100.0~500.0 yl干燥的二甲基甲酰胺 (DMH中，震蕩溶解，制成可替寧衍生物溶液； d. 當(dāng)上述可替寧衍生物溶液剛變澄清時(shí)，將其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶 液中，30秒內(nèi)完成滴加，然后將此混合溶液在2-8 °C下攪拌0.5~3.0小時(shí)； e. 將反應(yīng)后的上述混合溶液通過(guò)G-25凝膠層析柱進(jìn)行純化，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物，在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物溶液中加入質(zhì)量 分?jǐn)?shù)0.3%~0.8%的BSA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%~0.3%的NaN 3，于2-8 °C下儲(chǔ)存。
[0013] 前述的一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，步驟(5)的具體過(guò)程如下： 試劑A的制備:將2.0~8.0 g氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.0~3.0 g葡萄 糖-6-磷酸(G-6-P)用0.5~3.0 L濃度為55 mM、pH=8.0的Tris緩沖液溶解制成均相酶底物； 將制備的抗可替寧特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗體與均相酶底物的體積比為1: 100~1:10000; 試劑B的制備:將制備的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物加到濃度為120 mM、pH= 8.2的Tris緩沖液中，上述偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:100~1:10000。
[0014] 利用可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將待測(cè)樣本與抗可替寧特異性抗體接觸； 2) 根據(jù)待測(cè)樣本中可替寧與抗可替寧特異性抗體的結(jié)合情況，利用指示試劑判斷樣本 中可替寧的含量； 所述待測(cè)樣本為血清、血漿、唾液、尿液、精液或乳汁； 所述的指示試劑選自酶試劑，包括:酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物;上述酶標(biāo)偶聯(lián)物包括葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物;上述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸;所述葡萄糖-6-磷 酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與可替寧衍生物反應(yīng)形成。
[0015] 本發(fā)明的有益之處在于:本發(fā)明的可替寧免疫原特異性強(qiáng)、免疫原性高，制備出的 抗可替寧特異性抗體特異性強(qiáng)、效價(jià)高，并且與常見(jiàn)的62種藥物無(wú)任何交叉反應(yīng);含有上述 抗可替寧特異性抗體的均相酶免疫檢測(cè)試劑可以方便、快速、準(zhǔn)確地確定樣品中的可替寧 含量，并且可以在全自動(dòng)生化分析儀上同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，實(shí)現(xiàn)可替寧的高通量快速化測(cè) 定，準(zhǔn)確度高，特異性強(qiáng)，精確度和檢測(cè)效率相比之前都有了較大的提高，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了檢測(cè) 過(guò)程的全自動(dòng)化，對(duì)檢測(cè)人員的要求不高，易于實(shí)現(xiàn)和推廣使用。
[0016]
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是可替寧均相酶免疫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖2是可替寧均相酶免疫相關(guān)性分析圖。
[0018]
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 可替寧免疫原，其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示： 式(I)
式中，載體具有免疫原性，優(yōu)選的，載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)。雖然其他足夠大的 具備免疫原性的物質(zhì)也可以作為載體，但通常情況下選用蛋白質(zhì)作為載體。最常用的免疫 原性載體包括血清蛋白，血藍(lán)蛋白（KLH)和甲狀腺球蛋白。本發(fā)明中的載體優(yōu)選為血清蛋 白。
[0020] -種抗可替寧特異性抗體，由式(I)所示的可替寧免疫原免疫動(dòng)物得到。
[0021] 本發(fā)明中所指的"抗體"不僅僅指完整的抗體分子，也包括保留完整抗體特異性結(jié) 合能力的抗體片斷或者衍生物。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，優(yōu) 選為多克隆抗體。
[0022] 獲得多克隆抗體的方法是使用式(I)所示的可替寧免疫原，在加或者不加佐劑后， 在動(dòng)物的一個(gè)或者多個(gè)部位進(jìn)行免疫，宿主動(dòng)物包括:兔，山羊，小鼠，綿羊，豚鼠或馬。持續(xù) 免疫一直進(jìn)行，直至抗體效價(jià)達(dá)到最高。動(dòng)物定時(shí)采血得到適量的特異抗血清，抗血清可以 純化。
[0023] 單克隆抗體可通過(guò)體細(xì)胞雜交技術(shù)來(lái)制作。
[0024] -種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑，包括:上述抗可替寧特異性抗體、用于檢測(cè)抗可 替寧特異性抗體-可替寧復(fù)合物的指示試劑。指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、熒 光試劑和化學(xué)發(fā)光試劑。優(yōu)選的，指示試劑為酶試劑，包括:酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物。其中， 酶標(biāo)偶聯(lián)物包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物，其可通過(guò)化學(xué)合成方法得到。
[0025]上述可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的使用方法，包括以下步驟： 1) 將待測(cè)樣本與上述抗可替寧特異性抗體接觸； 2) 根據(jù)待測(cè)樣本中可替寧與上述抗可替寧特異性抗體的結(jié)合情況，利用指示試劑判斷 樣本中可替寧的含量。
[0026]待測(cè)樣本為各種生理樣本，例如血清、血漿、尿液、唾液、精液、乳汁等。優(yōu)選的，待 測(cè)樣本為血清或血漿。
[0027]下面結(jié)合具體的實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0028]實(shí)施例一:可替寧衍生物的合成及其結(jié)構(gòu)確認(rèn) 以下實(shí)施例中使用的可替寧衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)如式（n)所示： 式（n)
該可替寧衍生物的合成路線如下：
具體的合成步驟如下： 稱(chēng)取1.4 g(6.35 mmol)化合物1，溶解于20 mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入0.73 g(6.35 mmol)的N-羥基琥珀酰亞胺與1.46 g(7.62 mmol)的1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基-碳亞二胺(EDCI )，制成反應(yīng)混合溶液，然后將此反應(yīng)混合溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。反應(yīng)完成 后，將混合溶液的溶劑去除，殘余的固體物質(zhì)重新溶解于50 mL的丙烯酸乙酯(EA)中，然后 用純化水和鹵水洗滌，洗滌之后的有機(jī)相通過(guò)Na2S04進(jìn)行干燥處理，最后進(jìn)行濃縮以得到 1.1 g亮黃色固體狀的可替寧衍生物(Trans-4 Cotinine Derivative)。
[0029] 對(duì)上述亮黃色固體狀的可替寧衍生物(Trans-4 Cotinine Derivative)進(jìn)行結(jié)構(gòu) 鑒定：利用Bruker Avance III plus 400 MHz 和VARIAN MERCURY plus 300M對(duì)上述亮黃 色固體化合物進(jìn)行核磁共振光譜掃描，采用TMS作為內(nèi)標(biāo)。結(jié)果如下：1H-匪R (400 MHz, DMS0_d6): 8 2.67-2.741 (m, 4H), 1.33-1.43 (m, 2H), 2.82-2.90 (m, 4H), 2.98-3.04 (m, 1H), 3.31-3.39 (m, 1H), 4.88 (d, 1H), 7.39-7.46 (m, 1H), 7.66-7.73 (m，1H)，8.61-8.69 (m，2H)。表征為式（n)所示的可替寧衍生物。
[0030] 實(shí)施例二:BSA-可替寧免疫原的合成 BSA-可替寧免疫原由牛血清白蛋白（BSA)與式（II)所示的可替寧衍生物連接而成，該 免疫原的具體合成步驟如下： a. 稱(chēng)取2.72 g磷酸二氫鉀、4.26 g磷酸氫二鈉、8.5 g氯化鈉、0.95g氯化鎂，共同溶解 于1L去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，制成緩沖溶液A; b. 稱(chēng)取3 mg BSA，室溫下溶解于3 mL上述緩沖溶液A中，制成BSA溶液； c. 稱(chēng)取3 mg可替寧衍生物，溶解于300 iil上述緩沖溶液A中，制成可替寧衍生物溶液； d. 當(dāng)上述可替寧衍生物溶液剛變澄清時(shí)，將其逐滴加入上述BSA溶液中，然后將此混合 溶液在2-8°C下攪拌1小時(shí)； e.將反應(yīng)后的上述混合溶液用上述緩沖溶液A進(jìn)行透析，透析后所得溶液即為可替寧 免疫原溶液，在可替寧免疫原溶液中加入〇. 1%的NaN3，于-20°C下儲(chǔ)存。0.1%的NaN3是指加入 量占最終所得的免疫原溶液的質(zhì)量百分比，具體的加入量根據(jù)透析后所得的免疫原溶液的 具體質(zhì)量而定。
[0031] 實(shí)施例三:抗可替寧特異性抗體的制備 將上述制得的BSA-可替寧免疫原采用常規(guī)方法接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔，加強(qiáng)免疫后取抗血 清，具體步驟如下： 用PBS將上述合成的BSA-可替寧免疫原稀釋至1.0 mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0 ml抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔進(jìn)行注射。
[0032] 2~3周后，再用1.0 ml相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對(duì)上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔注 射一次，之后每隔四周注射一次，共計(jì)注射4次。
[0033]對(duì)上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔取血，分離純化得到效價(jià)為1:30000~1:50000的抗可替寧特異 性抗體。
[0034]實(shí)施例四：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物的制備 a. 稱(chēng)取1.09 g磷酸二氫鉀、1.70 g磷酸氫二鈉、8.5 g氯化鈉、0.95g氯化鎂，共同溶解 于1L去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，制成緩沖溶液B; b. 稱(chēng)取10 mg葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，室溫下溶解于7.5 mL上述緩沖溶液B中，調(diào)節(jié)pH至 8.5，制成葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液； c. 稱(chēng)取3 mg可替寧衍生物，溶解于200 iil干燥的二甲基甲酰胺(DMF)中，震蕩溶解，制 成可替寧衍生物溶液； d. 當(dāng)上述可替寧衍生物溶液剛變澄清時(shí)，將其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶 液中，30秒內(nèi)完成滴加，然后將此混合溶液在2-8 °C下攪拌2小時(shí)； e. 將反應(yīng)后的上述混合溶液通過(guò)G-25凝膠層析柱進(jìn)行純化，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物，在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物溶液中加入0.5% 的BSA和0.1%的NaN 3，于2-8°C下儲(chǔ)存。0.5%的BSA和0.1%的NaN3是指加入量占最終所得的偶 聯(lián)物溶液的質(zhì)量百分比，具體的加入量根據(jù)透析后所得的偶聯(lián)物溶液的具體質(zhì)量而定。
[0035] 實(shí)施例五:可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備 可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑，包括:上述抗可替寧特異性抗體，用于檢測(cè)抗可替寧特異 性抗體_可替寧復(fù)合物的指示試劑。指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、熒光試劑和 化學(xué)發(fā)光試劑。優(yōu)選的，指示試劑為酶試劑，包括:酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物。其中，酶標(biāo)偶聯(lián) 物包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物，其通過(guò)上述化學(xué)合成方法得到。
[0036] 可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑在使用之前，為了避免指示試劑中的酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶 的底物發(fā)生反應(yīng)，酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物是分開(kāi)放置的，不混合，所以將酶的底物與上述抗 可替寧特異性抗體混合在一起。也就是說(shuō)，可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑包括兩種分開(kāi)設(shè)置 的試劑，具體如下： 1.試劑A的制備:將4.036g( 11.25 mM)氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.71 lg (11.25 mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)置于燒杯D中，用1L 55 mM、pH=8.0的Tris緩沖液溶解制 成均相酶底物;將上述制備的抗可替寧特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗體與均相酶 底物的體積比可以為1:100~1:10000,在本實(shí)施例中具體的比例為1:500。
[0037] 2.試劑B的制備:將上述制備的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物加到120mM、 pH=8.2的Tris緩沖液中，上述偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比可以為1:100~1:10000,在本 實(shí)施例中具體的比例為1:1250。
[0038] 上述可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的使用方法，包括以下步驟： 1) 將待測(cè)樣本與上述抗可替寧特異性抗體接觸； 2) 根據(jù)待測(cè)樣本中可替寧與上述抗可替寧特異性抗體的結(jié)合情況，利用指示試劑判斷 待測(cè)樣本中可替寧的含量。
[0039] 具體的，檢測(cè)時(shí)，將待測(cè)樣本加到試劑A中，待測(cè)樣本中的可替寧與試劑A中的抗可 替寧特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合，生成抗可替寧特異性抗體-可替寧復(fù)合物;再加入試劑B， 此時(shí)試劑B中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物與試劑A中的酶的底物混合、接觸，發(fā) 生酶促反應(yīng)，構(gòu)成檢測(cè)抗可替寧特異性抗體-可替寧復(fù)合物的指示試劑，指示試劑根據(jù)待測(cè) 樣本中可替寧與上述抗可替寧特異性抗體的結(jié)合情況判斷待測(cè)樣本中可替寧的含量。
[0040] 由于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物與待測(cè)樣本中的可替寧競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗 可替寧特異性抗體，所以，待測(cè)樣本中可替寧的量越多，均相酶溶液中游離的葡萄糖-6-磷 酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物的量越多，酶促反應(yīng)越快，導(dǎo)致OD340上升。
[0041 ]上述待測(cè)樣本為生理樣本，例如血清、血漿、尿液、唾液、精液、乳汁等。
[0042] 作為一種優(yōu)選的方案，上述待測(cè)樣本為血清或血漿。
[0043] 實(shí)施例六:可替寧均相酶免疫檢驗(yàn) 1、獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)置貝克曼AU480全自動(dòng)生化分析儀反應(yīng)參數(shù)(見(jiàn)表1)，操作過(guò)程 為:先加試劑A，再加入標(biāo)準(zhǔn)品，最后加入試劑B。加入試劑B后，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的0D34Q吸光 值，算出不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)的反應(yīng)速率，實(shí)際操作過(guò)程中需不斷調(diào)整試劑A和試劑B的體積 比例，同時(shí)調(diào)整測(cè)光點(diǎn)，最后得出較理想的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示。
[0044]表1貝克曼AU480全自動(dòng)生化分析儀反應(yīng)參數(shù)
通過(guò)本發(fā)明的均相酶免疫檢測(cè)試劑得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，重復(fù)測(cè)定低、中、高濃度質(zhì)控樣本 10次，上述質(zhì)控樣本為：將可替寧標(biāo)準(zhǔn)品溶解于人血清中，至濃度分別為l.〇〇、30.00、 150.00 ng/ml。檢測(cè)數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表2。
[0045]表2樣品測(cè)定及精密度和回收率評(píng)估
檢測(cè)結(jié)果:本發(fā)明的均相酶免疫檢測(cè)試劑測(cè)定的準(zhǔn)確度高，回收率在95%- 105%范圍之 內(nèi)，精密度高，CV均低于5%。
[0046]實(shí)施例七:藥物干擾試驗(yàn) 選取62種常見(jiàn)藥物，調(diào)整濃度至100.0 ng/ml，進(jìn)行干擾試驗(yàn)測(cè)定。常見(jiàn)的62種藥物以 及測(cè)定結(jié)果具體參見(jiàn)表3。
[0047]表3常見(jiàn)干擾藥物及測(cè)定結(jié)果
測(cè)定結(jié)果:上述62種常見(jiàn)藥物等價(jià)于可替寧的濃度均小于0.1 ng/ml?？梢?jiàn)，本發(fā)明的 抗體是抗可替寧的特異性抗體。
[0048] 實(shí)施例八:相關(guān)性分析 對(duì)100例臨床標(biāo)本分別使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定方法和本發(fā)明的均相 酶免疫試劑進(jìn)行相關(guān)性分析，測(cè)定的數(shù)據(jù)參見(jiàn)表4。
[0049] 表4臨床樣本測(cè)定值
對(duì)上述數(shù)據(jù)作圖，參見(jiàn)圖2,得到的線性方程為:y = 0.9987x + 0.482，相關(guān)系數(shù)妒= 0.9997，表明本發(fā)明的檢測(cè)試劑測(cè)定可替寧臨床標(biāo)本的準(zhǔn)確度高。
[0050]由于本發(fā)明的檢測(cè)過(guò)程是由儀器全自動(dòng)化完成，所以對(duì)檢測(cè)人員的要求不高，易 于實(shí)現(xiàn)和推廣使用。
[0051]需要說(shuō)明的是，以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專(zhuān)利范圍， 凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所做的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在 其他相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑，包括:抗可替寧特異性抗體、用于檢測(cè)抗可替寧特 異性抗體-可替寧復(fù)合物的指示試劑;上述抗可替寧特異性抗體由可替寧免疫原免疫動(dòng)物 得到，可替寧免疫原的結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：式(I) 式中，載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)；上述指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、 熒光試劑或化學(xué)發(fā)光試劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑，其特征在于，上述指示試劑 選自酶試劑，包括:酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物;上述酶標(biāo)偶聯(lián)物包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半 抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物;上述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸;所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo) 偶聯(lián)物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與可替寧衍生物反應(yīng)形成。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑，其特征在于，上述可替寧衍生物 的結(jié)構(gòu)式如式（n)所示： 式（n)。4. 可替寧衍生物，結(jié)構(gòu)式如式（n)所示： 式（n)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的可替寧衍生物，其特征在于，合成路線為：6. -種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 權(quán)利要求3、4或5所述的可替寧衍生物的合成與純化，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定； (2) 可替寧免疫原的合成:使可替寧衍生物與具有免疫原性的蛋白質(zhì)載體連接； (3) 用可替寧免疫原免疫動(dòng)物，制備并純化抗可替寧特異性抗體； (4) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物的制備:制備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液，激 活可替寧衍生物，使葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與可替寧衍生物連接，純化連接產(chǎn)物； (5) 可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備： 試劑A的制備：由抗可替寧特異性抗體和均相酶底物混合而成； 試劑B的制備：由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物與Tris緩沖液混合而成。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于，所 述的步驟(2)中，蛋白質(zhì)載體為BSA，具體合成步驟如下： a.稱(chēng)取1.0~5.0 g磷酸二氫鉀、2.0~8.0 g磷酸氫二鈉、5.0~15.0 g氯化鈉、0.5~ 1.5 g氯化鎂，共同溶解于1.0~3.0 L去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.0~8.0,制成緩沖溶液A; b. 稱(chēng)取2.0~5.0 mg BSA，室溫下溶解于2.0~5.0 mL上述緩沖溶液A中，制成BSA溶液； c. 稱(chēng)取2.0~5.0 mg可替寧衍生物，溶解于200.0~500.0 yl上述緩沖溶液A中，制成可 替寧衍生物溶液； d. 當(dāng)上述可替寧衍生物溶液剛變澄清時(shí)，將其逐滴加入上述BSA溶液中，然后將此混合 溶液在2-8 °C下攪拌0.5~3.0小時(shí)； e.將反應(yīng)后的上述混合溶液用上述緩沖溶液A進(jìn)行透析，透析后所得溶液即為可替寧 免疫原溶液，在可替寧免疫原溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 05%~0.3%的NaN3，于-20 °C下儲(chǔ)存。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于，所 述的步驟(4)具體過(guò)程為： a. 稱(chēng)取1.0~5.0 g磷酸二氫鉀、1.0~5.0 g磷酸氫二鈉、5.0~15.0 g氯化鈉、0.5~ 1.5 g氯化鎂，共同溶解于1.0~3.0 L去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.0~8.0,制成緩沖溶液B; b. 稱(chēng)取5.0~20.0 mg葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，室溫下溶解于2.5~15.0 mL上述緩沖溶 液B中，調(diào)節(jié)pH至8.5，制成葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液； c. 稱(chēng)取2.0~5.0 mg可替寧衍生物，溶解于100.0~500.0 yl干燥的二甲基甲酰胺 (DMH中，震蕩溶解，制成可替寧衍生物溶液； d. 當(dāng)上述可替寧衍生物溶液剛變澄清時(shí)，將其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶 液中，30秒內(nèi)完成滴加，然后將此混合溶液在2-8 °C下攪拌0.5~3.0小時(shí)； e. 將反應(yīng)后的上述混合溶液通過(guò)G-25凝膠層析柱進(jìn)行純化，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物，在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物溶液中加入質(zhì)量 分?jǐn)?shù)0.3%~0.8%的BSA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%~0.3%的NaN 3，于2-8 °C下儲(chǔ)存。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于，步 驟(5)的具體過(guò)程如下： 試劑A的制備:將2.0~8.0 g的氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0~3.0 g的葡萄 糖-6-磷酸用0.5~3.0 L濃度為55 mM、pH=8.0的Tris緩沖液溶解制成均相酶底物;將制備 的抗可替寧特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗體與均相酶底物的體積比為1:100~1: 10000； 試劑B的制備:將制備的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物加到濃度為120 mM、pH= 8.2的Tris緩沖液中，上述偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:100~1:10000。10. 利用權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的可替寧均相酶免疫檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法，其特 征在于，包括以下步驟： (1) 將待測(cè)樣本與抗可替寧特異性抗體接觸； (2) 根據(jù)待測(cè)樣本中可替寧與抗可替寧特異性抗體的結(jié)合情況，利用指示試劑判斷樣 本中可替寧的含量； 所述待測(cè)樣本為血清、血漿、唾液、尿液、精液或乳汁； 所述的指示試劑選自酶試劑，包括:酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物;上述酶標(biāo)偶聯(lián)物包括葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物;上述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸;所述葡萄糖-6-磷 酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與可替寧衍生物反應(yīng)形成。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK106053788SQ201610574864
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月21日
【發(fā)明人】虞留明, 周桓, 汪興周
【申請(qǐng)人】蘇州博源醫(yī)療科技有限公司