一種基于CdZnSe三元量子點(diǎn)的光譜型電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于CdZnSe三元量子點(diǎn)的光譜型電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法。主要包括(1)雙穩(wěn)定劑包被的CdZnSe量子點(diǎn)的制備，(2)CdZnSe量子點(diǎn)標(biāo)記二抗(Ab2∣CdZnSe NCs)制備，(3)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物的ECL免疫傳感器的制備和(4)免疫傳感器的ECL光譜檢測四個(gè)步驟。本發(fā)明方法檢測的靈敏度較高，甲胎蛋白抗原檢測限達(dá)到10.0fg/mL。本發(fā)明構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器是基于抗原和抗體之間的特異性識別和結(jié)合構(gòu)建的，其他蛋白的干擾小，選擇性好。
【專利說明】一種基于CdZnSe三元量子點(diǎn)的光譜型電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種光譜型的電致化學(xué)發(fā)光(electrogeneratedchemi luminescence, ECL)免疫檢測方法，尤其涉及一種以CdZnSe三元量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型ECL免疫檢測方法，屬于ECL免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]電致化學(xué)發(fā)光是一種已在生化分析和臨床診斷領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用的分析技術(shù)。例如，羅氏公司所開發(fā)的基于釕聯(lián)吡啶/正三丙胺體系的ECL試劑盒已經(jīng)可以用于腫瘤標(biāo)志物、激素等80余種項(xiàng)目的臨床診斷。研究顯示，量子點(diǎn)(NCs或QDs)，如CdTeXdSe等，能夠產(chǎn)生ECL輻射，為構(gòu)建新型ECL生化分析策略提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。例如，Liang等人采用近紅外CdTe量子點(diǎn)開發(fā)了一種近紅外的ECL免疫檢測方法，并通過夾心免疫反應(yīng)制得ECL免疫傳感器檢測甲胎蛋白(參見:Anal.Chem.2012，84，10645-10649) Iiu等人以雙穩(wěn)定劑包被CdSe量子點(diǎn)修飾玻碳電極為載體構(gòu)建一種新型單色量子點(diǎn)ECL傳感策略，并實(shí)現(xiàn)對多巴胺的靈敏檢測(參見:Anal.Chem.2014,86,2784-2788)。
[0003]由于ECL基礎(chǔ)和應(yīng)用研究通常采用檢測輻射總強(qiáng)度的理念提高信噪比、提升ECL分析的靈敏度，傳統(tǒng)ECL研究極少涉及相關(guān)的光譜信息，基于ECL光譜信息的生化傳感研究基本處于空白狀態(tài)。
[0004]同時(shí)，盡管三元量子點(diǎn)擁有比二元量子點(diǎn)更為優(yōu)異的光學(xué)特性，基于三元量子點(diǎn)的ECL基礎(chǔ)研究尚基本處于空白狀態(tài)，與之相關(guān)的ECL生化分析及應(yīng)用研究上處于待開發(fā)狀
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明采用雙穩(wěn)定劑包被策略制備了水溶性的CdZnSe三元量子點(diǎn)，并以該量子點(diǎn)為標(biāo)記物提供了一種光譜型ECL檢測方法。本發(fā)明所構(gòu)建的光譜型ECL檢測方法具有靈敏度高和選擇性好的特點(diǎn)。
[0006]術(shù)語說明:
[0007]抗原(Ag):本發(fā)明所述的抗原指:甲胎蛋白抗原，癌胚抗原，糖類抗原125，糖類抗原15-3，糖類抗原72-4，糖類抗原19-9，前列腺特異性抗原，游離前列腺特異抗原，愛滋病抗原，乙肝表面抗原，乙肝e抗原，甲狀腺球蛋白，肌鈣蛋白T抗原，肌紅蛋白抗原等常規(guī)的抗原。
[0008]—抗(Abi):本發(fā)明所述的一抗指:對上述抗原對應(yīng)產(chǎn)生的抗體，本發(fā)明對于上述抗原對應(yīng)的單克隆抗體效果更好。
[0009]二抗(Ab2):本發(fā)明所述的二抗指:對上述抗原和一抗對應(yīng)產(chǎn)生的二抗。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0011 ] 一種基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫檢測方法，包括步驟如下:
[0012](I)雙穩(wěn)定劑包被的CdZnSe量子點(diǎn)的制備
[0013]向氯化鎘(CdCl2)溶液加入醋酸鋅(Zn(CH3COO)2)和六偏磷酸鈉(HMP)，攪拌5min后加入巰基丙酸(MPA);用NaOH將溶液pH調(diào)至8.0，緩慢加入亞砸酸鈉(Na2SeO3)溶液;將上述溶液加熱回流1min后，加入水合肼(N2H4.H2O)，100°C下加熱回流，得到雙穩(wěn)定劑包被CdZnSe量子點(diǎn)溶液，取不同回流時(shí)間的溶液，4°C避光放置；
[0014](2)0(121136量子點(diǎn)標(biāo)記二抗的制備(4132|0(121136 NCs)
[0015]向雙穩(wěn)定劑包被的CdZnSe量子點(diǎn)溶液中加入含等體積1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液，于室溫下反應(yīng)活化30min，離心(12000r/min，6min)后將沉淀重新分散到I3BS緩沖溶液中，加入Ab2，室溫下震蕩搖勻3h后，加入小牛血清蛋白(BSA)封閉未反應(yīng)的活性位點(diǎn)；封閉30min后離心，將沉淀重新分散到PBS緩沖溶液中，得量子點(diǎn)標(biāo)記的二抗(Ab21 CdZnSe NCs);
[0016](3)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物構(gòu)建光譜型ECL免疫傳感器
[0017]a、將玻碳電極(GCE)用0.3μπι的拋光粉(Ct-Al2O3)拋光至鏡面，用超純水洗去電極表面多余的拋光粉，并用氮?dú)獯蹈?；將玻碳電極置入含對氨基苯甲酸(ABA)的緩沖液中，在
0.4-1.2V電位區(qū)間內(nèi)、以10mV/S掃速循環(huán)伏安掃描兩圈，得到表面帶有羧基的修飾電極(GCEIABA)，用無水乙醇、超純水依次清洗所得修飾電極；
[0018]b、分別取等量EDC、NHS滴涂于步驟(a)所述修飾電極上，活化電極表面的羧基，370C反應(yīng)30min后沖洗電極表面三次;將Ab1滴加在GCE IABA表面，37 °C反應(yīng)2h，將Ab1以共價(jià)偶聯(lián)的方式固定在電極表面，得GCEI ABA-Abi;
[0019]c、將GCE I ABA-Ab1清洗后，向電極表面滴加BSA溶液，37 °C反應(yīng)Ih以封閉未反應(yīng)的活性位點(diǎn)；
[0020]d、將步驟(c)得到的電極清洗后，取Ag滴加在電極表面，37 0C反應(yīng)90min，通過抗原抗體特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)Ag在電極表面的固定，得GCE I ABA-AbKAg;然后將GCE I ABA-AbKAg在Ab21 CdZnSe NCs溶液中37°C孵育90min，將量子點(diǎn)固定在電極表面，形成免疫復(fù)合物修飾電極，得GCE I ABA-AbKAgMb21 CdZnSe NCs( S卩:三元量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型ECL免疫傳感器)；實(shí)驗(yàn)前將GCEI ABA-Abi<Ag>Ab21 CdZnSe NCs沖洗三次；
[0021](4)光譜型ECL免疫檢測
[0022]以步驟(3)制得的三元量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型ECL免疫傳感器為工作電極，鉑電極為對電極、Ag/AgCl電極為參比電極，在含0.01-0.lmol/L過硫酸銨的I3BS緩沖溶液中，對光譜型ECL免疫傳感器進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光光譜測試。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(I)中所述的雙穩(wěn)定劑包被的CdZnSe量子點(diǎn)的制備方法如下:
[0024]室溫下，將0.20mol/L CdCl2溶液加入到10mL圓底三頸燒瓶中，加超純水稀釋至50mL ；依次向三口燒瓶中加入Zn(CH3COO)2和HMP，攪拌5min后加入MPA ；用NaOH將溶液pH調(diào)至8.0，緩慢加入Na2SeO3溶液，待上述溶液在100°C下加熱回流1min后，加入N2H4.H2O;取不同回流時(shí)間的溶液，4 0C避光放置;其中Cd2+: Zn: Se: HMP: MPA: N2H4.H2O的摩爾比為1:1: (0.05-
0.2):(0.3-0.7):(2-3):400。
[0025]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(I)中所述的雙穩(wěn)定劑包被的三元量子點(diǎn)為回流6h的CdZnSe量子點(diǎn)。
[0026]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(2)中所述的BSA的體積分?jǐn)?shù)為2%。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(3)的d中，所述的Ag為甲胎蛋白(AFP)抗原。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(I)、(2)、(3)中所述的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液、Tris?HCl緩沖溶液或B?R緩沖溶液中的一種;所述的磷酸鹽緩沖溶液為K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液。
[0029]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的步驟(3)中沖洗電極所用沖洗液為PBST(0.01mol/LPBS緩沖液中含0.02%吐溫20，pH 7.4)溶液。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(4)中對一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗原構(gòu)建的光譜型ECL免疫傳感器進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光光譜測試，繪制工作曲線，然后根據(jù)工作曲線測試待測樣品溶液的抗原濃度；
[0031 ]進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟如下:
[0032]1、以步驟(3)制得的三元量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型ECL免疫傳感器為工作電極，鉑電極為對電極、Ag/AgCl電極為參比電極，在含0.01-0.1mo I /L過硫酸銨的I3BS緩沖溶液中，對一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗原溶液進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光光譜測試，繪制工作曲線；
[0033]i1、將待測樣品溶液按照步驟i中的方法進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光光譜測試，根據(jù)所得電致化學(xué)發(fā)光光譜的信號對應(yīng)工作曲線，得到待測樣品溶液中的抗原濃度。
[0034]本發(fā)明的原理:
[0035]本發(fā)明采用雙穩(wěn)定劑-巰基丙酸和六偏磷酸鈉包被的三元量子點(diǎn)為標(biāo)記物，單色性良好。量子點(diǎn)與生物分子反應(yīng)后，其ECL光譜與其熒光光譜峰位置不變，且對其ECL發(fā)光強(qiáng)度影響較小。
[0036]本發(fā)明采用的雙穩(wěn)定劑包被的三元量子點(diǎn)表面帶有羧基，采用1-乙基-3，3_二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化量子點(diǎn)表面的羧基后，與二抗的氨基反應(yīng)，將量子點(diǎn)標(biāo)記到二抗上，采用小牛血清蛋白(BSA)對量子點(diǎn)表面未反應(yīng)的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉。
[0037]本發(fā)明通過電聚合的方法使玻碳電極(GCE)與對氨基苯甲酸(ABA)形成碳氮鍵將ABA修飾在GCE上，得到表面具有羧基修飾的GCE，與一抗中氨基反應(yīng)得到表面有一抗修飾的玻碳電極，通過抗原抗體的特異性結(jié)合將抗原和量子點(diǎn)修飾的二抗修飾到電極表面。
[0038]本發(fā)明中電致化學(xué)發(fā)光光譜測試可參考使用CN201610224510.6公開的設(shè)備進(jìn)行。
[0039]本發(fā)明的有益效果:
[0040]1、本發(fā)明方法的選擇性高。本發(fā)明構(gòu)建的光譜型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器是基于抗原和抗體之間的特異性識別和結(jié)合構(gòu)建的，因此待測液中的干擾蛋白并不能與抗原第一抗體和第二抗體結(jié)合，對本發(fā)明檢測體系無干擾。
[0041]2、本發(fā)明方法操作簡單，重復(fù)性好。對臨床早期診斷癌癥具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。
[0042]3、本發(fā)明方法檢測的靈敏度較高，甲胎蛋白抗原檢測限可達(dá)10.0fg/mL。
【附圖說明】
[0043]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1步驟(I)所制得不同回流時(shí)間的巰基丙酸和六偏磷酸鈉包被的CdZnSe量子點(diǎn)的紫外-可見吸收光譜圖(a-g: 2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h)。
[0044]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1步驟(I)所制得巰基丙酸和六偏磷酸鈉包被的CdZnSe量子點(diǎn)的熒光光譜圖(&1:211，311，411，511，611，711，811)。
[0045]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1步驟(I)所制得巰基丙酸和六偏磷酸鈉包被的回流時(shí)間為6h的CdZnSe量子點(diǎn)的熒光光譜圖(a)、紫外-可見吸收光譜圖(b)及ECL光譜圖(c)。
[0046]圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制得的甲胎蛋白抗原濃度為100.0pg/mL時(shí)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的ECL光譜圖。
[0047]圖5為本發(fā)明實(shí)施例2制得的甲胎蛋白抗原濃度為50.0pg/mL時(shí)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的ECL光譜圖。
[0048]圖6為本發(fā)明實(shí)施例3制得的甲胎蛋白抗原濃度為10.0pg/mL時(shí)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的ECL光譜圖。
[0049]圖7為本發(fā)明實(shí)施例4制得的甲胎蛋白抗原濃度為5.0pg/mL時(shí)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的ECL光譜圖。
[0050]圖8為本發(fā)明實(shí)施例5制得的甲胎蛋白抗原濃度為1.0pg/mL時(shí)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的ECL光譜圖。
[0051 ]圖9為本發(fā)明實(shí)施例6制得的甲胎蛋白抗原濃度為0.50pg/mL時(shí)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的ECL光譜圖。
[0052]圖10為本發(fā)明實(shí)施例7制得的甲胎蛋白抗原濃度為0.10pg/mL時(shí)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的ECL光譜圖。
[0053]圖11為本發(fā)明實(shí)施例8制得的甲胎蛋白抗原濃度為0.010pg/mL時(shí)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的ECL光譜圖。
[0054]圖12為試驗(yàn)例I中根據(jù)不同濃度AFP抗原(0.10pg/mL?100.0pg/mL)對免疫傳感器的ECL光譜信號響應(yīng)繪制的工作曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0055]實(shí)施例中數(shù)據(jù)收集方式:紫外-可見吸收光譜由北京普析通用儀器有限公司生產(chǎn)的TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)采集，熒光光譜由天津港東科技發(fā)展股份有限公司生產(chǎn)的F-320熒光分光光度計(jì)采集。
[0056]電化學(xué)發(fā)光光譜是通過將VersaSTAT 3型電化學(xué)分析儀與Acton SP-2300型CCD光柵光譜儀聯(lián)用的方式采集，所施加的電勢窗口為O?-1.6V，掃描速度為50mV/s，初掃向負(fù)。可參見:中國專利文件CN201610224510.6公開的設(shè)備。
[0057]實(shí)施例中所采用的甲胎蛋白單克隆抗體、抗原及二抗均購自北京科躍中楷生物科技有限公司。
[0058]實(shí)施例中所用的緩沖溶液為P H = 7.4，0.0I m ο I / L的磷酸鹽緩沖溶液(K 2 H P O 4 _KH2PO4緩沖溶液)ο
[0059]實(shí)施例1、
[0060]一種基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫檢測方法，包括步驟如下:
[0061 ] (I)CdZnSe量子點(diǎn)的制備
[0062]室溫下，將0.80mL 0.20mol/L CdCl2溶液加入到10mL圓底三口燒瓶中，加超純水稀釋至50mL。依次向三口燒瓶中加入27.7mg Zn(CH3COO)2和72.5mg HMP，攪拌5min后加入34.6yL MPA。用6mol/L NaOH將溶液pH調(diào)至8.0，緩慢加入1.60mL 20.0mM Na2SeO3溶液，待上述溶液在100°C下加熱回流1min后，加入3.67mL N2H4.H20。取不同回流時(shí)間的溶液，4°C避光放置。其中Cd2+:Zn: Se:HMP:MPA:N2H4.H2O的摩爾比為1: 1:0.2:0.50:2.5:400。巰基丙酸和六偏磷酸鈉包被的CdZnSe量子點(diǎn)的紫外-可見吸收光譜圖如圖1所示，熒光光譜圖如圖2所示。
[0063](2)0(121136量子點(diǎn)標(biāo)記4??二抗的制備(4132|0(121136 NCs)
[0064]向10yL ΙΟ.ΟμΜ CdZnSe量子點(diǎn)中加入50yL含等體積EDC( 100mg/mL)、NHS(10mg/mL)的0.1OM pH=6.0的PBS緩沖溶液于室溫下反應(yīng)，活化30min后離心(12000r/min，6min)，將沉淀重新分散于10yL 1mM pH 7.4PBS緩沖液中。將1.5mL 100yg/mL Ab2加入到上述溶液中，室溫下震蕩搖勻3h后，加入20yL體積分?jǐn)?shù)2 %的BSA溶液封閉未反應(yīng)的活性位點(diǎn)。封閉30min后，將溶液離心后重新分散于10yL 1mM pH 7.4PBS緩沖液中。
[0065](3)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物構(gòu)建ECL光譜型免疫傳感器
[0066]以6hCdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物構(gòu)建免疫傳感器的過程如下:
[0067]a、將GCE用0.3μπι的Ct-Al2O3拋光粉拋光至鏡面，用超純水洗去電極表面多余的拋光粉，并用氮?dú)獯蹈?。將GCE置入5mL含0.0lmol/LABA的PBS(10mM，pH 7.4，1mM KCl為支持電解質(zhì))緩沖液中。在0.4-1.2V的電位區(qū)間內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，以10mV/S的掃速將ABA在GCE上電聚合2圈。先用無水乙醇再用超純水清洗修飾后的電極，去除未反應(yīng)的ABA，此時(shí)形成表面帶有羧基的修飾電極(GCEIABA)。
[0068]b、分別取1yL EDC(100mg/mL)、NHS(100mg/mL)滴涂于步驟(a)所述修飾電極上，活化電極表面的羧基，37°C反應(yīng)30min后用PBST(0.01mol/L PBS緩沖液中含0.02%吐溫20，pH 7.4)溶液沖洗電極表面三次。將20yL 10yg/mL Ab1-加在上述電極表面，37°C反應(yīng)2h，將Ab1以共價(jià)偶聯(lián)的方式固定在電極表面(GCE I ABA-Ab1)。
[0069]c、用PBST溶液沖洗步驟(b)的電極后，向電極表面滴加20yL I % (v/v)BSA溶液，37°C反應(yīng)Ih以封閉未反應(yīng)的活性位點(diǎn)。
[0070]d、用PBST溶液清洗上述步驟中(C)電極表面三次，取不同濃度Ag滴加在電極表面，37 0C反應(yīng)90min，通過抗原抗體特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)Ag在GCE表面的固定(GCE I ABA-AbKAg)。然后將上述電極在Ab21 CdZnSe NCs溶液中37°C孵育90min，將量子點(diǎn)固定在電極表面，形成免疫復(fù)合物修飾電極(GCE I ABA-Abi<Ag>Ab21 CdZnSe NCs)。實(shí)驗(yàn)前用PBST溶液清洗修飾電極三次。
[0071](4)光譜型ECL免疫檢測
[0072]以步驟(3)制得的三元量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型ECL免疫傳感器為工作電極，鉑電極為對電極、Ag/AgCl電極為參比電極，在含0.01-0.1mol/L過硫酸銨的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液中，對100.0pg/mL AFP抗原溶液進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光光譜測試。
[0073]實(shí)施例2、
[0074]一種基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫分析策略，步驟同實(shí)施例1，不同的是:甲胎蛋白抗原濃度為50.0pg/mLo
[0075]實(shí)施例3、
[0076]一種基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫分析策略，步驟同實(shí)施例1，不同的是:甲胎蛋白抗原濃度為10.0pg/mLo
[0077]實(shí)施例4、
[0078]一種基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫分析策略，步驟同實(shí)施例1，不同的是:甲胎蛋白抗原濃度為5.0pg/mL ο
[0079]實(shí)施例5、
[0080]一種基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫分析策略，步驟同實(shí)施例1，不同的是:甲胎蛋白抗原濃度為1.0pg/mL。
[0081 ] 實(shí)施例6、
[0082]一種基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫分析策略，步驟同實(shí)施例1，不同的是:甲胎蛋白抗原濃度為0.50pg/mLo
[0083]實(shí)施例7、
[0084]一種基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫分析策略，步驟同實(shí)施例1，不同的是:甲胎蛋白抗原濃度為0.1 Opg/mL。
[0085]實(shí)施例8、
[0086]一種基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫分析策略，步驟同實(shí)施例1，不同的是:甲胎蛋白抗原濃度為0.010pg/mLo
[0087]實(shí)施例9-21、
[0088]如實(shí)施例1所述，不同的是:將甲胎蛋白抗原分別用癌胚抗原、糖類抗原125、糖類抗原15-3、糖類抗原72-4、糖類抗原19-9、前列腺特異性抗原、游離前列腺特異抗原、愛滋病抗原、乙肝表面抗原、乙肝e抗原、甲狀腺球蛋白抗原、肌鈣蛋白T抗原、肌紅蛋白抗原替代。
[0089]試驗(yàn)例1、
[0090]根據(jù)實(shí)施例2-7不同濃度AFP抗原的免疫傳感器的ECL光譜信號，繪制工作曲線，如圖12所示?？筛鶕?jù)工作曲線測試待測樣品溶液的抗原濃度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫檢測方法，包括步驟如下: (1)雙穩(wěn)定劑包被的CdZnSe量子點(diǎn)的制備 向CdCl2溶液加入Zn (CH3COO) 2和HMP，攪拌5min后加入MPA;用NaOH將溶液pH調(diào)至8.0，緩慢加入Na2SeO3溶液;將上述溶液在100°C下加熱回流1min后，加入N2H4.H2O,取不同回流時(shí)間的溶液，得雙穩(wěn)定劑包被CdZnSe量子點(diǎn)溶液； (2)Ab21CdZnSe NCs的制備 向雙穩(wěn)定劑包被的CdZnSe量子點(diǎn)溶液中加入含等體積EDC和NHS的I3BS緩沖溶液，于室溫下反應(yīng)活化30min，然后離心得沉淀;將沉淀重新分散到PBS緩沖溶液中，加入Ab2，室溫下震蕩搖勻3h后，加入BSA封閉未反應(yīng)的活性位點(diǎn)；封閉30min后，離心得沉淀，將沉淀重新分散到PBS緩沖溶液中，得Ab21 CdZnSe NCs; (3)以CdZnSe量子點(diǎn)為標(biāo)記物構(gòu)建光譜型ECL免疫傳感器 a、將GCE用0.3μπι的拋光粉拋光至鏡面，用超純水洗去電極表面多余的拋光粉，并用氮?dú)獯蹈?將玻碳電極置入含ABA的緩沖液中，在0.4-1.2V電位區(qū)間內(nèi)、以I OmV/s掃速循環(huán)伏安掃描兩圈，得到GCEIABA，用無水乙醇、超純水依次清洗所得修飾電極； b、分別取等量EDC、NHS滴涂于步驟(a)所述修飾電極上，活化電極表面的羧基，37°C反應(yīng)30min后沖洗電極表面三次;將Ab1滴加在GCEIABA表面，37 °C反應(yīng)2h，將Ab1以共價(jià)偶聯(lián)的方式固定在電極表面，得GCEI ABA-Abi; C、將GCEI ABA-Ab1清洗后，向電極表面滴加BSA溶液，37°C反應(yīng)Ih以封閉未反應(yīng)的活性位占.V ， d、將步驟(c)得到的電極清洗后，取Ag滴加在電極表面，37 °C反應(yīng)90min，通過抗原抗體特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)Ag在電極表面的固定，得GCE I ABA-AbKAg;然后將GCE I ABA-AbKAg在Ab21CdZnSe NCs溶液中37°C孵育90min，將量子點(diǎn)固定在電極表面，形成免疫復(fù)合物修飾電極，得GCEI ABA-Abi<Ag>Ab21 CdZnSe NCs ； (4)光譜型ECL免疫檢測 以步驟(3)制得的三元量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型ECL免疫傳感器為工作電極，鉑電極為對電極、Ag/AgCl電極為參比電極，在含0.01-0.1mo 1/L過硫酸銨的I3BS緩沖溶液中，對制得的光譜型ECL免疫傳感器進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光光譜測試。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫檢測方法，其特征在于，步驟(I)中所述的雙穩(wěn)定劑包被的CdZnSe量子點(diǎn)的制備方法如下: 室溫下，將0.20mol/L CdCl2溶液加入到10mL圓底三頸燒瓶中，加超純水稀釋至50mL;依次向三口燒瓶中加入Zn (CH3COO) 2和HMP，攪拌5min后加入MPA ；用NaOH將溶液pH調(diào)至8.0，緩慢加入Na2SeO3溶液，待上述溶液在100°C下加熱回流1min后，加入N2H4.H2O;取不同回流時(shí)間的溶液，40C避光放置；其中Cd2+: Zn: Se: HMP:MPA: N2H4.H2O的摩爾比為1:1: (0.05-0.2):(0.3-0.7):(2-3):400。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫檢測方法，其特征在于，步驟(I)中所述的雙穩(wěn)定劑包被的三元量子點(diǎn)為回流6h的CdZnSe量子點(diǎn)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫檢測方法，其特征在于，步驟(2)中所述的BSA的體積分?jǐn)?shù)為2%。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫檢測方法，其特征在于，步驟⑶的d中，所述的Ag為甲胎蛋白抗原。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫檢測方法，其特征在于，步驟(I)、(2)、(3)中所述的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液、Tris?HCl緩沖溶液或B?R緩沖溶液中的一種;所述的磷酸鹽緩沖溶液為Κ2ΗΡ04_ΚΗ2Ρ04緩沖溶液。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫檢測方法，其特征在于，步驟(3)中沖洗電極所用沖洗液為PBST溶液，PBST溶液的指標(biāo)如下: 0.01mol/LPBS緩沖液中含0.02%吐溫20，pH 7.4。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫檢測方法，其特征在于，步驟(4)中對一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗原溶液進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光光譜測試，繪制工作曲線，然后根據(jù)工作曲線測試待測樣品溶液的抗原濃度。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CdZnSe量子點(diǎn)的ECL光譜型免疫檢測方法，其特征在于，步驟(4)中電致化學(xué)發(fā)光光譜測試的步驟如下: I1、以步驟(3)制得的三元量子點(diǎn)為標(biāo)記物的光譜型ECL免疫傳感器為工作電極，鉑電極為對電極、Ag/AgCl電極為參比電極，在含0.01-0.1mo I /L過硫酸銨的PBS緩沖溶液中，對一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗原構(gòu)建的光譜型ECL免疫傳感器進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光光譜測試，繪制工作曲線； i1、將待測樣品溶液按照步驟i中的方法進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光光譜測試，根據(jù)所得電致化學(xué)發(fā)光光譜的信號對應(yīng)工作曲線，得到待測樣品溶液中的抗原濃度。
【文檔編號】G01N21/76GK106053823SQ201610236247
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】鄒桂征, 張新
【申請人】山東大學(xué)