一種腸易激綜合癥標(biāo)志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種腸易激綜合癥標(biāo)志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法。本試劑盒包括PVC底板、樣品墊、熒光結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；所述樣品墊、熒光結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按水平方向依次固定于PVC底板上。所述熒光結(jié)合墊上有包被的Vinculin抗原?納米熒光微球復(fù)合物、雞IgY?納米熒光微球復(fù)合物；所述的硝酸纖維素膜上有Vinculin抗原構(gòu)成的檢測線和兔抗雞IgY抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。本發(fā)明利用雙抗原夾心反應(yīng)原理結(jié)合納米熒光微球來檢測Vinculin抗體，診斷腸易激綜合癥，相比一般的臨床癥狀積分診斷方法，結(jié)果更可靠科學(xué)，為腸易激綜合癥的診斷提供普查甚至初期預(yù)防提供了更明確的指標(biāo)與方法，具有廣闊的推廣前景；且運用納米熒光微球技術(shù)檢測背景值低、檢測時間短、特異性和靈敏度較高、檢測結(jié)果可量化計算，可提供更科學(xué)的病情評價?！緦＠f明】一種腸易激綜合癥標(biāo)志物Vinculiη抗體檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及一種腸易激綜合癥以Vinculin抗體為識別物的干式免疫熒光試劑盒及診斷方法，本發(fā)明屬于醫(yī)療產(chǎn)品領(lǐng)域?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]腸易激綜合癥(Irritablebowelsyndrome，IBS)是一種常見的慢性胃腸道疾病，以腹痛、腹部不適和排便習(xí)慣改變?yōu)橹饕卣?，常持續(xù)存在或反復(fù)發(fā)作，經(jīng)檢查可以排除引起這些癥狀的器質(zhì)性疾病，目前認(rèn)為本病是一種功能性腸道疾病。在西方國家IBS發(fā)病率為10%-15%，而在中國由于地域，人種不同，各地發(fā)病率有所不同，北京地區(qū)的發(fā)病率為0.82%，廣州地區(qū)則為5.6%ο根據(jù)大便的性狀將IBS分為便秘型IBS(IBS-C)，腹瀉型IBS(IBS-D)和混合型(IBS-M)，各型之間可以相互轉(zhuǎn)換，以IBS-C和IBS-M型之間轉(zhuǎn)換為多見。[0003]IBS的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，情緒因素、飲食、藥物或激素均可引起胃腸道張力改變，促發(fā)或加重IBS。情緒焦慮、抑郁等精神因素和心理因素常引起IBS癥狀的發(fā)作和反復(fù)。近年來對IBS的發(fā)病機(jī)制作了進(jìn)一步地探討，改變了多年來把IBS—直當(dāng)成單純腸動力紊亂的看法，認(rèn)識到本病具有內(nèi)臟感覺異常，結(jié)腸對刺激的敏感性增高，從而產(chǎn)生腹痛以及腹瀉等排便異常的特點，而感覺異常所引起的動力紊亂是受中樞神經(jīng)調(diào)控的。因此，證明中樞神經(jīng)的狀態(tài)也能夠影響IBS病人的癥狀。進(jìn)而有研究表明，給予小劑量選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑作用于神經(jīng)中樞，可以減輕IBS病人的癥狀，及Ringel,Drossman等用150作PET腦掃描，發(fā)現(xiàn)直腸擴(kuò)張后IBS病人腦血流的圖譜與健康人不同；袁耀宗等用功能性磁共振影像學(xué)檢查也觀察到IBS病人與健康人之間存在著腦圖的差異。這些都表明神經(jīng)系統(tǒng)對腸功能具有影響。應(yīng)激和腸道感染都是重要的發(fā)病誘因。Neal等報告對544例細(xì)菌性胃腸炎患者追隨半年的觀察，有25%的患者發(fā)生腸功能紊亂。在北京地區(qū)對IBS的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，痢疾史陽性導(dǎo)致發(fā)生本病的危險性上升2倍，其調(diào)查表明到有痢疾或腸炎史的IBS患者，其末端回腸、乙狀結(jié)腸與直腸交界處腸黏膜中炎性介質(zhì)IL-1ftnRNA的表達(dá)增高。IL-1ftnRNA可抑制腸道水、鈉的吸收而產(chǎn)生腹瀉，還與遲發(fā)性疼痛和過敏有關(guān)，它在感染后IBS腸黏膜組織中含量的增高，表明炎癥及其隨后引起的免疫反應(yīng)可能參與了IBS的發(fā)病機(jī)制。[0004]因此可證明神經(jīng)因素和免疫因素在腸道中之間存在神經(jīng)免疫機(jī)制。在腸黏膜內(nèi)有著多種能夠釋放調(diào)節(jié)介質(zhì)的免疫細(xì)胞，如分泌白細(xì)胞介素的單核細(xì)胞，分泌組胺、5-HT的肥大細(xì)胞和嗜鉻細(xì)胞等。其中，肥大細(xì)胞被認(rèn)為很可能是在神經(jīng)和免疫機(jī)制之間擔(dān)當(dāng)溝通作用的重要免疫細(xì)胞。因為它們在腸道的炎癥反應(yīng)中能夠分泌多種抗炎介質(zhì)，又能釋放神經(jīng)介質(zhì)，而且許多肥大細(xì)胞是和神經(jīng)纖維緊鄰的，刺激神經(jīng)即可使肥大細(xì)胞活化。有實驗對對56例符合羅馬Π標(biāo)準(zhǔn)的IBS病人的腸黏膜活檢組織進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)IBS患者末端回腸黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞的數(shù)目(均值:10.98±2.96)比非IBS對照組的病人(6.05±0.51)明顯增多(P〈0.01)。在癥狀發(fā)作期間，其直腸黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞的活化比例(85%)較非IBS對照組(15%)明顯為尚。[0005]空腸彎曲桿菌C.jejuni是一種革蘭氏陰性菌，與小腸結(jié)腸炎有關(guān)，局部急性炎癥反應(yīng)，參與腸組織的損傷和腹瀉。其毒素CjCDT可以調(diào)節(jié)宿主腸道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞釋放IL-8，而CDT的抗體具有中和并刺激IL-8的釋放能力。CDT感染人結(jié)腸上皮細(xì)胞致使NF-κB的激活和Toll樣受體(TLR)信號并且轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活大量的促炎細(xì)胞因子的基因，包括IL-li3、IL-6、IL_8和TNF-α。其中多數(shù)炎癥因子誘導(dǎo)急性炎癥過程中會促使細(xì)胞外基質(zhì)成分的過度沉積，并使vinculin蛋白質(zhì)的表達(dá)和mRNA相適應(yīng)，S卩vinculin基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性均有增強(qiáng)。加之CDT毒素性的作用使細(xì)胞脹破甚至凋亡，過度炎癥的狀況下機(jī)體易引發(fā)該蛋白的自身免疫產(chǎn)生vinculin抗體，因此vinculin抗體可作為腸易激綜合癥的一種檢測指標(biāo)由于目前IBS缺乏特異性的體格檢查和生化異常的標(biāo)志，患者臨床表現(xiàn)多樣性(癥狀的部位、發(fā)作類型以及嚴(yán)重性)，甚至同一患者不同時間也有差異。在過去30年中，為規(guī)范IBS的診斷，增強(qiáng)診斷的特異性，已提出幾種癥狀學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，常用的診斷標(biāo)準(zhǔn)是Manning標(biāo)準(zhǔn)和國際功能性胃腸病工作組制訂的羅馬標(biāo)準(zhǔn)。但都是根據(jù)臨床癥狀積分，并通過必要的檢查排除器質(zhì)性病變后診斷的。在該領(lǐng)域急需一種生化標(biāo)志物來區(qū)分腸易激綜合癥與其他一些炎癥性腸病等。[0006]熒光微球納米顆粒在標(biāo)志物檢測領(lǐng)域具有巨大潛能。它具有以下特點:1、靈敏度高:不受外界的背景干擾;2、穩(wěn)定性高:避免了樣本腐蝕或自身衰變引發(fā)的淬滅現(xiàn)象;3、靈活性高:可以組合多樣化光譜;4、安全性高:對于檢測者、檢測樣品和環(huán)境都沒有危害;5、方便簡易:可對樣品直接進(jìn)行檢測，無需特殊處理;6、以上特點決定其在生物標(biāo)記物方面應(yīng)用前景較廣闊，尤其是在床旁檢測領(lǐng)域。通過熒光微球納米顆粒標(biāo)記人Vinculin抗原，建立一種腸易激綜合癥標(biāo)志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法在臨床檢測領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。【
發(fā)明內(nèi)容】[0007]腸易激綜合癥(Irritablebowelsyndrome，IBS)是一種常見的慢性胃腸道疾病，以腹痛、腹部不適和排便習(xí)慣改變?yōu)橹饕卣?，常持續(xù)存在或反復(fù)發(fā)作，經(jīng)檢查可以排除引起這些癥狀的器質(zhì)性疾病，目前認(rèn)為本病是一種功能性腸道疾病。在西方國家IBS發(fā)病率為10%-15%，而在中國由于地域，人種不同，各地發(fā)病率有所不同，北京地區(qū)的發(fā)病率為0.82%，廣州地區(qū)則為5.6%ο根據(jù)大便的性狀將IBS分為便秘型IBS(IBS-C)，腹瀉型IBS(IBS-D)和混合型(IBS-M)，各型之間可以相互轉(zhuǎn)換，以IBS-C和IBS-M型之間轉(zhuǎn)換為多見。[0008]IBS的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，情緒因素、飲食、藥物或激素均可引起胃腸道張力改變，促發(fā)或加重IBS。情緒焦慮、抑郁等精神因素和心理因素常引起IBS癥狀的發(fā)作和反復(fù)。近年來對IBS的發(fā)病機(jī)制作了進(jìn)一步地探討，改變了多年來把IBS—直當(dāng)成單純腸動力紊亂的看法，認(rèn)識到本病具有內(nèi)臟感覺異常，結(jié)腸對刺激的敏感性增高，從而產(chǎn)生腹痛以及腹瀉等排便異常的特點，而感覺異常所引起的動力紊亂是受中樞神經(jīng)調(diào)控的。因此，證明中樞神經(jīng)的狀態(tài)也能夠影響IBS病人的癥狀。進(jìn)而有研究表明，給予小劑量選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑作用于神經(jīng)中樞，可以減輕IBS病人的癥狀，及Ringel,Drossman等用150作PET腦掃描，發(fā)現(xiàn)直腸擴(kuò)張后IBS病人腦血流的圖譜與健康人不同；袁耀宗等用功能性磁共振影像學(xué)檢查也觀察到IBS病人與健康人之間存在著腦圖的差異。這些都表明神經(jīng)系統(tǒng)對腸功能具有影響。應(yīng)激和腸道感染都是重要的發(fā)病誘因。Neal等報告對544例細(xì)菌性胃腸炎患者追隨半年的觀察，有25%的患者發(fā)生腸功能紊亂。在北京地區(qū)對IBS的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，痢疾史陽性導(dǎo)致發(fā)生本病的危險性上升2倍，其調(diào)查表明到有痢疾或腸炎史的IBS患者，其末端回腸、乙狀結(jié)腸與直腸交界處腸黏膜中炎性介質(zhì)IL-1ftnRNA的表達(dá)增高。IL-1ftnRNA可抑制腸道水、鈉的吸收而產(chǎn)生腹瀉，還與遲發(fā)性疼痛和過敏有關(guān)，它在感染后IBS腸黏膜組織中含量的增高，表明炎癥及其隨后引起的免疫反應(yīng)可能參與了IBS的發(fā)病機(jī)制。[0009]因此可證明神經(jīng)因素和免疫因素在腸道中之間存在神經(jīng)免疫機(jī)制。在腸黏膜內(nèi)有著多種能夠釋放調(diào)節(jié)介質(zhì)的免疫細(xì)胞，如分泌白細(xì)胞介素的單核細(xì)胞，分泌組胺、5-HT的肥大細(xì)胞和嗜鉻細(xì)胞等。其中，肥大細(xì)胞被認(rèn)為很可能是在神經(jīng)和免疫機(jī)制之間擔(dān)當(dāng)溝通作用的重要免疫細(xì)胞。因為它們在腸道的炎癥反應(yīng)中能夠分泌多種抗炎介質(zhì)，又能釋放神經(jīng)介質(zhì)，而且許多肥大細(xì)胞是和神經(jīng)纖維緊鄰的，刺激神經(jīng)即可使肥大細(xì)胞活化。有實驗對對56例符合羅馬Π標(biāo)準(zhǔn)的IBS病人的腸黏膜活檢組織進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)IBS患者末端回腸黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞的數(shù)目(均值:10.98±2.96)比非IBS對照組的病人(6.05±0.51)明顯增多(P〈0.01)。在癥狀發(fā)作期間，其直腸黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞的活化比例(85%)較非IBS對照組(15%)明顯為尚。[00?0]空腸彎曲桿菌C.jejuni是一種革蘭氏陰性菌，與小腸結(jié)腸炎有關(guān)，局部急性炎癥反應(yīng)，參與腸組織的損傷和腹瀉。其毒素CjCDT可以調(diào)節(jié)宿主腸道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞釋放IL-8，而CDT的抗體具有中和并刺激IL-8的釋放能力。CDT感染人結(jié)腸上皮細(xì)胞致使NF-κB的激活和Toll樣受體(TLR)信號并且轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活大量的促炎細(xì)胞因子的基因，包括IL-li3、IL-6、IL_8和TNF-α。其中多數(shù)炎癥因子誘導(dǎo)急性炎癥過程中會促使細(xì)胞外基質(zhì)成分的過度沉積，并使vinculin蛋白質(zhì)的表達(dá)和mRNA相適應(yīng)，S卩vinculin基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性均有增強(qiáng)。加之CDT毒素性的作用使細(xì)胞脹破甚至凋亡，過度炎癥的狀況下機(jī)體易引發(fā)該蛋白的自身免疫產(chǎn)生vinculin抗體，因此vinculin抗體可作為腸易激綜合癥的一種檢測指標(biāo)由于目前IBS缺乏特異性的體格檢查和生化異常的標(biāo)志，患者臨床表現(xiàn)多樣性(癥狀的部位、發(fā)作類型以及嚴(yán)重性)，甚至同一患者不同時間也有差異。在過去30年中，為規(guī)范IBS的診斷，增強(qiáng)診斷的特異性，已提出幾種癥狀學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，常用的診斷標(biāo)準(zhǔn)是Manning標(biāo)準(zhǔn)和國際功能性胃腸病工作組制訂的羅馬標(biāo)準(zhǔn)。但都是根據(jù)臨床癥狀積分，并通過必要的檢查排除器質(zhì)性病變后診斷的。在該領(lǐng)域急需一種生化標(biāo)志物來區(qū)分腸易激綜合癥與其他一些炎癥性腸病等。[0011]熒光微球納米顆粒在標(biāo)志物檢測領(lǐng)域具有巨大潛能。它具有以下特點:1、靈敏度高:不受外界的背景干擾;2、穩(wěn)定性高:避免了樣本腐蝕或自身衰變引發(fā)的淬滅現(xiàn)象;3、靈活性高:可以組合多樣化光譜;4、安全性高:對于檢測者、檢測樣品和環(huán)境都沒有危害;5、方便簡易:可對樣品直接進(jìn)行檢測，無需特殊處理;6、以上特點決定其在生物標(biāo)記物方面應(yīng)用前景較廣闊，尤其是在床旁檢測領(lǐng)域。通過熒光微球納米顆粒標(biāo)記人Vinculin抗原，建立一種腸易激綜合癥標(biāo)志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法在臨床檢測領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值?！靖綀D說明】:圖1干式免疫熒光檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為樣品墊;2為熒光結(jié)合墊;3為硝酸纖維素膜；4為吸水墊；5為PVC底板；6為樣本中目標(biāo)抗原；7為熒光微球標(biāo)記的Vinculin抗原;8為焚光微球標(biāo)記的雞IGY；9為檢測線:Vinculin抗原；10為質(zhì)控線:兔抗雞IgY0【主權(quán)項】1.一種腸易激綜合癥標(biāo)志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于，本試劑盒包括PVC底板、熒光結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、樣品墊和吸水墊。2.所述熒光結(jié)合墊上包被有Vinculin抗原-納米熒光微球復(fù)合物、雞IgY-納米熒光微球復(fù)合物;硝酸纖維素膜上有VincuIin抗原構(gòu)成的檢測線和兔抗雞IgY抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。3.如權(quán)利要求1所述的一種腸易激綜合癥標(biāo)志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于，所述的納米熒光微球為醛基化紅熒光微球，納米顆粒粒徑為100?200nm，激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為612土5nm，表面醛基基團(tuán)含量為0.I?0.5mmol/g。4.如權(quán)利要求1所述的一種腸易激綜合癥標(biāo)志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于，通過醛基熒光微球與Vinculin抗原蛋白末端的氨基殘基在弱堿性環(huán)境下醛胺縮合制備得到Vinculin抗原-納米熒光微球復(fù)合物用于特異性結(jié)合受試者血清、血漿或全血中的Vinculin抗體。5.如權(quán)利要求1所述的一種腸易激綜合癥標(biāo)志物VincuIiη抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于焚光微球納米顆粒與Vinculin抗原蛋白或雞IgY按照一定比例(ul:ug)分別混合，25-37°C反應(yīng)I?4小時，分別制備得到Vinculin抗原-納米熒光微球復(fù)合物及雞IgY-納米熒光微球復(fù)合物。6.如權(quán)利要求1所述的一種腸易激綜合癥標(biāo)志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于熒光結(jié)合墊的制備:將熒光結(jié)合墊切成9mmX300mm細(xì)條，將Vinculin抗原-納米熒光微球復(fù)合物及雞IgY-納米熒光微球復(fù)合物按照一定比例混合均勻鋪在熒光結(jié)合墊上，25?37°C烤干或-20?-60°C凍干得到制備好的熒光結(jié)合墊。7.如權(quán)利要求1所述的一種腸易激綜合癥標(biāo)志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于，將硝酸纖維素膜貼于PVC底板上。8.將兔抗雞IgY用PBS稀釋到濃度為0.l-2mg/ml，作為C線包被液；將Vinculin蛋白用PBS稀釋到濃度為0.l-2mg/ml，作為T線。9.通過噴膜儀，將T線包被液和C線包被液在硝酸纖維素膜上均勻劃線得到檢測線和質(zhì)控線，25-37°C烤干，依次組裝熒光結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊并斬切切條后即可得到檢測試紙條。10.如權(quán)利要求1所述的一種腸易激綜合癥標(biāo)志物Vinculin抗體檢測試劑盒及其制備方法，其特癥在于檢測樣品為血清、血漿或全血?！疚臋n編號】G01N33/68GK106053827SQ201610325264【公開日】2016年10月26日【申請日】2016年5月17日【發(fā)明人】羅朝領(lǐng),陳瀟,董敏【申請人】上海凱璟生物科技有限公司