一種用于自身免疫病檢測(cè)的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于自身免疫病檢測(cè)的試劑盒。SLE是一種彌漫性、全身性的自身免疫性疾病,主要發(fā)病機(jī)理是自身抗體和免疫復(fù)合物的形成,疾病發(fā)展過程中常累及多個(gè)器官和系統(tǒng)?，F(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法具有一定的局限性，不適宜廉價(jià)的大面積推廣。本發(fā)明提供的試劑盒能夠通過檢測(cè)血液來鑒定時(shí)候患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡，從而能夠快速高效的檢測(cè)SLE。該試劑盒制備簡(jiǎn)單。
【專利說明】
一種用于自身免疫病檢測(cè)的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于自身免疫病檢測(cè)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)是固有免疫細(xì)胞的經(jīng)典模式識(shí)別受體， 其識(shí)別病原相關(guān)分子模式，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答，并決定后繼的適應(yīng)性免疫應(yīng)答方向和反應(yīng) 強(qiáng)度，因而受到機(jī)體免疫系統(tǒng)的嚴(yán)格調(diào)控。TLR信號(hào)的免疫調(diào)控包括負(fù)調(diào)控和正調(diào)控，而髓 樣細(xì)胞表達(dá)觸發(fā)受體（Triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM)家族是 一類新發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族的成員、TLR信號(hào)免疫調(diào)控分子，可通過放大或抑制TLR信 號(hào)從而調(diào)控免疫應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)度，避免過度炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。目前TREM家 族包含了TREM-1、TREM-2、TREM-3、TREM樣轉(zhuǎn)錄因子1 (TREM 1 ike transcript 1，TLT-1)和 TLT-2多個(gè)受體成員，其中TREM-1能加強(qiáng)炎癥反應(yīng)、正向調(diào)控自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展； 與此相反，TREM-2在自身免疫中主要發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的分化成熟;而對(duì)于 TLT-1，目前更多的認(rèn)為它是一類激活型受體，參與血小板活化、聚集的過程;相似的，TLT-2 可促使白細(xì)胞活化，對(duì)T細(xì)胞有刺激作用。TREM-1是2000年報(bào)道的TREM家族激活型受體，并 且隨著對(duì)其作用機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)其在部分自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作 用，現(xiàn)就TREM-1分子及其在自身免疫性疾病中的研究進(jìn)展作一綜述。
[0003] 目前研究發(fā)現(xiàn)TREM基因定位于人6號(hào)染色體。Bouchon等首先發(fā)現(xiàn)TREM-1表達(dá)于外 周血中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞表面，是由234個(gè)氨基酸組成的跨膜糖蛋 白，其中包括了由單獨(dú)免疫球蛋白V型結(jié)構(gòu)域組成的胞外區(qū)、含賴氨酸殘基的跨膜區(qū)及缺乏 固有信號(hào)域的胞內(nèi)區(qū)。近年來越來越多的研究顯示TREM-1也可表達(dá)在自然殺傷細(xì)胞、樹突 狀細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞、肝臟內(nèi)皮細(xì)胞等。
[0004] TREM-1主要是以膜表面分子和可溶性分子（Soluble TREM-l，sTREM-l)兩種表達(dá) 形式存在。膜表面的TREM-1分子根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與配體結(jié)合后，激活一系列的信號(hào)通路，調(diào) 控炎癥反應(yīng)及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。目前對(duì)于sTREM-1的來源有兩種假設(shè):一是TREM-1剪切變異的 缺乏跨膜區(qū)的分泌亞型，二是膜表面TREM-1蛋白水解機(jī)制下的結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)證明在細(xì)菌 脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)刺激下的人單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)中，金屬蛋 白酶抑制劑可增加細(xì)胞表面TREM-1的穩(wěn)定性、減少sTREM-1的釋放[5]。盡管TREM-1的天然 配體尚未完全確定，但有研究推測(cè)其表達(dá)在人血小板表面及實(shí)驗(yàn)性腹膜炎、內(nèi)毒素血癥小 鼠模型中的粒細(xì)胞表面，但要得到確切的答案，仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)有大量的證據(jù)表明TREM-1與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE)是有極大的相關(guān)性的。SLE是一種彌漫性、全身性的自身免疫性疾病， 主要發(fā)病機(jī)理是自身抗體和免疫復(fù)合物的形成，疾病發(fā)展過程中常累及多個(gè)器官和系統(tǒng)。 SLE的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣，感染是疾病觸發(fā)的原因之一，同時(shí)也是發(fā)病過 程中加重病情的常見因素。有研究將SLE發(fā)熱患者分為疾病活動(dòng)組和合并感染組，通過檢測(cè) 患者血清中sTREM-1水平發(fā)現(xiàn)合并感染患者明顯高于疾病活動(dòng)患者。而最新的一個(gè)研究報(bào) 道指出，sTREM-1在SLE患者血清中表達(dá)上調(diào)。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)TREM-1蛋白的量一般通過抗體結(jié)合之后通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)進(jìn)行 定量檢測(cè)，但是該檢測(cè)方法需要自備相應(yīng)的抗體，由于抗體的制備要求比較高，并且制備復(fù) 雜，在檢測(cè)中存在著巨大的局限。
[0007] SELEX技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的一種新的組合化學(xué)技術(shù)。利用該技術(shù)可 以從隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫(kù)中篩選到特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適配體。其基本思路是 體外化學(xué)合成一個(gè)單鏈寡核苷酸庫(kù)，與靶物質(zhì)混合，形成靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物，洗脫未結(jié)合 的核酸，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，并以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)入下輪 的篩選。通過重復(fù)的篩選與擴(kuò)增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的 核酸分子被洗去，而與革G物質(zhì)有強(qiáng)未和力的核酸分子從非常大的隨機(jī)庫(kù)中分尚出來，且純 度隨SELEX過程的進(jìn)行而增高，最后占據(jù)庫(kù)的大多數(shù)（>90%左右）。自Tuerk和Ellington等 首先運(yùn)用此技術(shù)篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機(jī)染料分子的特異核酸適配體 后，經(jīng)過十幾年的發(fā)展，SELEX技術(shù)已經(jīng)成為一種重要的研宄手段和工具。因此，采用selex 技術(shù)，篩選特定的結(jié)合TREM-1的適配體具有較為重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種TREM-1的核酸適配體序列。
[0010] 本發(fā)明中，所述的TREM-1的核酸適配體(序列1-24)能夠特異結(jié)合TREM-1。
[0011] 本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供所述核酸適配體序列的用途。本發(fā)明中根據(jù)對(duì)該序 列應(yīng)用，可進(jìn)一步用于制備特異性結(jié)合TREM-1的試劑盒。
[0012] 從體外合成的隨機(jī)寡聚DNA文庫(kù)，（5 '-CGTTAAGACGAGTTGGCCAG-N36-AATGACCAGTGAAGCTTGAC-3'），其中N36為36個(gè)隨機(jī)寡核苷酸;從中篩選出與TREM-1特異結(jié)合 的核酸適配體；將篩選出的序列用引物PI : CGTTAAGACGAGTTGGCCAG;引物P2 : GTCAAGCTTCACTGGTCATT，進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行TA克隆入pMD19-T載體(購(gòu)自上海博光生物公司）， 轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)菌(購(gòu)自北京天根生物公司）；挑去白色菌落進(jìn)行PCR確定陽性克隆后，抽提質(zhì)粒 并測(cè)序反應(yīng)，上測(cè)序儀測(cè)序。
[0013]本發(fā)明采用核酸適配體的體外篩選（SELEX)技術(shù)，以TREM-1為正篩靶標(biāo)篩選與 TREM-1特異結(jié)合的核酸適配體，制得具有特異結(jié)合TREM-1的序列，本發(fā)明中命名為適配體 TREM-1-1~24。序列如下：


[0039] 本發(fā)明的適配子可以用于構(gòu)建試劑盒，該試劑盒可以用于特異性的分離和定量檢 測(cè)TREM-1〇
[0040] 本發(fā)明的有益效果:獲得了一種能夠特異檢測(cè)TREM-1的試劑盒，該試劑盒成本低 廉，可以大面積推廣使用。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 實(shí)施例1:蛋白的獲得
[0042] 人 TREM-1:DAP12 穩(wěn)定細(xì)胞系的產(chǎn)生 BWZ.36/hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ 細(xì)胞系（本 文亦稱為〃 BWZ/hTREM-I報(bào)道細(xì)胞〃)來源于BW5147T細(xì)胞(小鼠Ofes胸腺淋巴瘤細(xì)胞系，ATCC TIB-47，LGC Standards，Middelsex，UK)，并含有受4拷貝NFAT啟動(dòng)子元件調(diào)節(jié)的LacZ報(bào)道 構(gòu)建體（參見Karttunen，J?和Shastri，N. (1991 )Proc .Natl .Acad. Sci .USA 88,3972-3976 及Fiering，S. ，Northrop，J.P. ，Nolan，G.P. ，Matilla，P. ，Crabtree，G.R?和 Herzenberg，L? A?( 1990)Genes Dev.4,1823-1834)。使用Superfect轉(zhuǎn)染試劑（目錄號(hào) 301305，Qiagen Nordic，Denmark)，將使用TREM-1 cDNA(Gene Bank Ref.ID:NM_018643.2， Sino Biological Inc.，Beijing, China)作為模板和寡聚 5' TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG和5 ' TAGTAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAG GGTAC作為引物克 隆至pIREShyg載體GenBank登錄號(hào)U89672(目錄號(hào)6061-1，Clontech Laboratories，CA， USA)的TREM/DAP12/pMX-IRES載體（自 Smal位點(diǎn)至BamHI位點(diǎn)編碼786bp TREM-1)轉(zhuǎn)染到 PLAT-E包裝細(xì)胞系（由W.Yokoyama,Washington University提供；或者，目錄號(hào)RV-101，RV-101，Cell Biolabs Inc,Bio-Mediator KY，Vantaa，F(xiàn)inland)。如下使用含有TREM/DAP12/ pMX-IRES病毒顆粒的PLAT-E上清液來感染BWZ.36細(xì)胞:將2xl0 5個(gè)BWZ.36細(xì)胞在6孔板中培 養(yǎng)，更換培養(yǎng)基為1.5ml含有病毒顆粒+8mg/ml聚凝胺(polybrene)的上清液。6-8小時(shí)后，將 1.5ml正常培養(yǎng)基加到板中，使細(xì)胞再溫育24小時(shí)。將穩(wěn)定表達(dá)TREM-I的BWZ.36細(xì)胞系用抗 TREM-I單克隆抗體(克隆21C7)染色，并通過細(xì)胞分選來分離。將分離得到的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)， 收獲得到TREM-1蛋白，富集蛋白使得蛋白濃度為100mg/mL，4度貯存。
[0043]實(shí)施例2核酸適配體篩選
[0044] 從體外合成的隨機(jī)寡聚DNA文庫(kù)，（5 '-CGTTAAGACGAGTTGGCCAG-N36-AATGACCAGTGAAGCTTGAC-3 '），其中N36為36個(gè)隨機(jī)寡核苷酸；
[0045] 引物PI: CGTTAAGACGAGTTGGCCAG;引物P2 :GTCAAGCTTCACTGGTCATT。
[0046] (l)TREM-l蛋白 lmg溶于200yl PBS后加入96孔ELISA板中，4°C過夜。
[0047] (2)蛋白包被孔用PBS洗滌6次后，加入200yl 3%BSA(購(gòu)自上海生工），孵育2小時(shí)。 同時(shí)，空白96孔ELISA板中加入200yl 3%BSA 37°C孵育2小時(shí)。
[0048] (3)將隨機(jī) ssDNA 文庫(kù)（首輪用量為 800pmol)溶于 200yl 1*SHCMK，95°C 變性 5min。 立即置于冰上l〇min，使其迅速降至室溫，避免ssDNA復(fù)性成雙鏈。
[0049] (4)將ssDNA加入PBS洗滌6次的空白ELISA孔中，37°C孵育2小時(shí)。
[0050] (5)上清轉(zhuǎn)入PBS洗滌6次的蛋白包被孔中，37 °C孵育2小時(shí)后PBS洗滌6次。
[00511 (6)結(jié)合了 ssDNA的酶標(biāo)孔用200微升洗脫緩沖液重懸，95°C加熱5min，取上清，經(jīng) 過乙醇沉淀DNA，溶于Mi 11 ipore水中，作為下一輪篩選的模板。
[0052] (7)取5yl PCR產(chǎn)物上樣于5wt%瓊脂糖(購(gòu)自上海生工），觀察條帶位置是否正確。 從首輪之后，投入的ssDNA次級(jí)庫(kù)的量逐漸減少，如此反復(fù)進(jìn)行12個(gè)循環(huán)。
[0053]第12輪篩選產(chǎn)物的擴(kuò)增和純化:將第12輪篩選得到的ssDNA序列，用引物P1，引物 P2進(jìn)行擴(kuò)增。100yl PCR擴(kuò)增后體系加入600pl結(jié)合液BB(20mmol/L Hepes(pH7.35)， 100mmol/L NaCl，5.5mmol/L KCl，1.5mmol/L CaCl2，lmmol/L MgCl2，l%BSA)，充分混勻。將 上一步所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置lmin，12000rpm離心 60s，倒掉收集管中的廢液。加入700pmol漂洗WB(結(jié)合液BB+0 ? 05%Tween20)，12000rpm離心 30s，棄掉廢液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm離心30s，棄掉廢液。將吸附柱EC放回空收 集管中，12000rpm離心2min。取出吸附柱EC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部 位加20pmo 1 65 °C水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12，OOOrpm離心lmin。將得到的 溶液重新加入吸附柱中，再次離心lmin。
[0054] PCR純化產(chǎn)物的克隆：取lyl擴(kuò)增產(chǎn)物，與載體PGM-T在T4DNA連接酶的作用下連接， 再將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，取適當(dāng)體積均勻涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)的LA平 板，倒置培養(yǎng)皿，于37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)進(jìn)行"藍(lán)-白斑篩選"。測(cè)序：用接種環(huán)挑取篩選平板 上的單個(gè)白色菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜。取菌液lml于離心管中，封膜后 送上海生工測(cè)序。
[0055]測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有24個(gè)核酸適配體序列與TREM-1具有非常強(qiáng)的親和性，該24個(gè) 序列分別是:SEQ ID N0:1-24所示。
[0056]實(shí)施例3特異性高親和力的TREM-1結(jié)合適配子的性能測(cè)定 [0057] 將適配子分別取1.5iig，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，純化回收去磷酸 化的RNA;通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[y-32P]ATP于去磷酸化的適配體分子末端。lOnmol放 射性標(biāo)記的適配子分別與不同濃度（l-200nM)的TREM-1蛋白37°C孵育30min，各組反應(yīng)液經(jīng) 硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定濾膜上殘留的放射量，同一樣品 平行做兩次測(cè)定。計(jì)算各個(gè)適配子與TREM-1蛋白的解離常數(shù)。結(jié)果如下：

[0060]從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的24個(gè)適配子具有非常強(qiáng)的結(jié)合特性，現(xiàn)有技術(shù)中 也沒有所述結(jié)合特性的適配子能夠結(jié)合TREM-1蛋白。
[00611實(shí)施例4降解活性分析
[0062] 分別采用人血白蛋白，TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1和TLT-2分別與24條適配子 進(jìn)行特異性檢測(cè)，經(jīng)過結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合，而只與TREM-1蛋 白結(jié)合保持較高的特異性。
[0063] 將所述的適配子，取0.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置四周。通過RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)三周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。
[0064]實(shí)施例5臨床試驗(yàn)分析
[0065]取50組臨床血清樣本，分別為：SLE發(fā)熱疾病活動(dòng)組20例，SLE發(fā)熱合并感染組20 例，10例為正常人。
[0066] 將24個(gè)適配子分別與標(biāo)準(zhǔn)品TREM-1蛋白通過免疫磁珠分離的方式構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品檢 測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將50組臨床血清樣本分別去10yl加入到無菌離心管中，加入PBS溶液震 蕩溶解。分別將偶聯(lián)有磁珠的24組適配子與50組的血清溶液混合孵育20分鐘（一種適配子 對(duì)應(yīng)檢測(cè)50組血清樣本），而后磁分離，即可獲得相應(yīng)的分離的TREM-1蛋白，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線 濃度檢測(cè)獲得相應(yīng)的蛋白濃度結(jié)果，通過檢測(cè)，針對(duì)同一個(gè)血清，各適配子檢測(cè)出的濃度幾 乎沒有差距;而各組之間的濃度存在明顯的差異，以正常人的蛋白濃度的平均值作為對(duì)照， 結(jié)果如下：
[0068]從以上結(jié)果可以看出，SLE發(fā)熱合并感染組的TREM-1蛋白濃度顯著的增加，與正常 人之間可以顯著的區(qū)分開來。說明本發(fā)明的適配子可以用于檢測(cè)分析。
[0069] 實(shí)施例6TREM-1分子阻斷性檢測(cè)
[0070] 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的方法，鑒定適配子時(shí)候阻斷TREM-1:包括(a)培養(yǎng)表達(dá)TREM-1、信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和報(bào)道構(gòu)建體的第一細(xì)胞；（b)在將第一細(xì)胞與激活性化合物（例如TREM-1配 體)或激活的嗜中性粒細(xì)胞一起溫育時(shí)測(cè)量所述細(xì)胞的活性；（c)使第一細(xì)胞和激活性化合 物(例如TREM-1配體)或激活的嗜中性粒細(xì)胞的共培養(yǎng)物與TREM-I適配子接觸；和(d)測(cè)得 第一細(xì)胞的活性小于(b)中測(cè)量的活性。根據(jù)所述的方法，
【申請(qǐng)人】通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，24中適配 子均可以阻斷TREM-1的活性。
[0071]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)自身免疫病的試劑盒，其特征在于：其包含能特異性結(jié)合TREM-1蛋白 的核酸適體。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述核酸適體為SEQ ID No. 1-24任一條序 列所示，或者在該序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行的一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的替換，并保留其活性。3. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)自身免疫病損傷的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的試劑盒用于制備檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK106053831SQ201610393707
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月5日
【發(fā)明人】潘時(shí)輝
【申請(qǐng)人】潘時(shí)輝