同時檢測糕點類食品中九種Amadori化合物濃度的方法
【專利摘要】同時檢測糕點類食品中九種Amadori化合物濃度的方法，本發(fā)明是制備甘氨酸與葡萄糖Amadori化合物、丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物、α?氨基丁酸與葡萄糖Amadori化合物、脯氨酸與葡萄糖Amadori化合物、天冬氨酸與葡萄糖Amadori化合物、異亮氨酸與葡萄糖Amadori化合物、谷氨酸與葡萄糖Amadori化合物、苯丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物、色氨酸與葡萄糖Amadori化合物九種Amadori化合物混合母液及樣品溶液，準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用液相色譜?串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜分析儀，分析檢測得到糕點類食品樣品溶液中九種Amadori化合物濃度。本發(fā)明方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，非常適合復(fù)雜基質(zhì)糕點類食品中九種Amadori化合物的分析。
【專利說明】
同時檢測糕點類食品中九種Amador i化合物濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于糕點類食品中化學(xué)成分分析測定技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種采用液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測糕點類食品中九種Amadori化合物濃度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Amadori化合物是還原糖葡萄糖為代表）和氨基化合物氨基酸為主）發(fā)生 Maillard(非酶促棟色化)反應(yīng)生成的一類關(guān)鍵中問產(chǎn)物1-氨基-1-脫氧-2-酬糖，是N-取代 葡萄糖經(jīng)Amadori重排而來。Amadori重排產(chǎn)物在不同溫度和pH值條件下能進一步發(fā)生一系 列復(fù)雜的反應(yīng)，生成多種具有芳香氣味的小分子化合物和具有棟黑顏色的高分子化合物一 類黑素，從而影響糕點食品的香味和顏色。Amadori是重要的一類前香物質(zhì)，其種類和含量 與食品的風(fēng)味和色澤有密切關(guān)系。還是一種優(yōu)良的抗氧化劑，能夠除活性氧自由基，因此， 定性定量分析糕點類食品中的Amadori化合物對評價其內(nèi)在質(zhì)量及提高香味具有重要的指 導(dǎo)意義。
[0003] Amadori化合物極性強、種類多、結(jié)構(gòu)類似，定性定量分析食品中運類化合物的難 度較大。目前，國內(nèi)外對于Amadori化合物的分析主要采用氣相色譜法(GC)、高效液相色譜 法化PLC)、液相色譜-質(zhì)譜法化C/MS)、液相色譜-串聯(lián)Ξ重四級桿質(zhì)譜化C-MS/MS)等，其中， LC/MS法和LC-MS/MS法是目前最有效的定性分析方法。對于糕點類食品，其成分復(fù)雜，若雜 質(zhì)殘留太多則影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，檢測糕點類食品中Amadori化合物需要進行大 量且難度較大的前處理工作，目前尚未有測定糕點類食品中Amadori化合物的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明基于液相色譜-串聯(lián)Ξ重四級桿質(zhì)譜儀化C-MS/MS)除具有普通高效液相色 譜儀的分離功能，又具有質(zhì)譜離子高選擇性的優(yōu)勢，能夠在定性定量時發(fā)揮更為精準(zhǔn)功能 的前提下，提供采用LC-MS/MS同時測定糕點類食品中9種Amadori化合物濃度，且準(zhǔn)確可靠、 靈敏度高的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0006] 同時檢測糕點類食品中九種Amadori化合物濃度的方法，方法步驟如下：
[0007] (1)制備九種Amadori化合物混合母液:分別稱取甘氨酸與葡萄糖Amadori化合物、 丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物、α-氨基下酸與葡萄糖Amadori化合物、脯氨酸與葡萄糖 Amadori化合物、天冬氨酸與葡萄糖Amadori化合物、異亮氨酸與葡萄糖Amadori化合物、谷 氨酸與葡萄糖Amadori化合物、苯丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物、色氨酸與葡萄糖Amadori 化合物標(biāo)準(zhǔn)品lOmg于lOmL容量瓶中，各采用質(zhì)量濃度70%的甲醇水溶解并定溶，然后各分 別移取5mL上述九種溶液于lOOmL容量瓶中，采用質(zhì)量濃度70%的甲醇水定溶得到九種 Amadori化合物混合母液；
[000引 （2)準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取0.02mL、0.1 OmL、0.20mL、0.5OmL、1. OmL九種 Amadori化合物混合母液于lOmL容量瓶中，采用質(zhì)量濃度0.5%的甲酸水溶液定容，得到標(biāo) 準(zhǔn)工作溶液系列;標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列中，九種Amadori化合物的濃度分別為ο. 10yg/mL、0.50 μ邑/mL、1.ΟΟμ邑/mL、2.50μ邑/mL、1.ΟΟμ邑/mL;
[0009] (3)制備樣品溶液:進行糕點類食品中Amadori化合物的溶解、萃取與凈化，具體步 驟是稱取1. Og糕點類食品于50mL離屯、管中，加入lOmL甲醇，超聲提取lOmin，lOOOOr/min離 屯、5min，上清液倒入另一離屯、管中，加入lOmL正己燒，滿旋Imin，lOOOOr/min離屯、2min，棄去 上層正己燒層，再加入lOmL正己燒，滿旋Imin，lOOOOr/min離屯、2min，同樣棄去上層正己燒 層，下層甲醇在35 °C條件下氮氣吹干，加入2mL質(zhì)量濃度0.5 %的甲酸水溶液溶解后，經(jīng)0.22 皿過濾膜后得到樣品溶液；
[0010] (4)進行液相色譜-串聯(lián)Ξ重四級桿質(zhì)譜分析:采用液相色譜-串聯(lián)Ξ重四級桿質(zhì) 譜分析儀，分析檢測的液相色譜、質(zhì)譜條件如下：
[00川 色譜柱為WatersAcquity B邸 C18(1.7皿，2.1mmX100mm)，柱溫：25°C;流動相A為 0.5 %甲酸的水溶液，流動相B為甲醇溶液;梯度洗脫，條件為0~lOmin: 95 % A~0 % A，10.1 ~14111111:0%4，14.1~18111111:95%4;流速:0.211117111111，進樣體積化1^;
[0012] 離子源:采用電噴霧電離源，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測MRM， 電噴霧電壓500V，干燥氣溫度325°C，干燥氣流量化/min,銷氣溫度380°C，銷氣流量10L/ min,毛細管電壓4000V;
[0013] (5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及計算結(jié)果:分別吸取步驟(2)制備的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進 行LC-MS/MS分析，在步驟(4)確定的儀器參數(shù)下，W九種Amadori化合物定量離子峰面積對 其所對應(yīng)的質(zhì)量濃度進行線性回歸，得到各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;再分別吸取步驟 (3)制備的樣品溶液進行LC-MS/MS分析，在步驟(4)確定的儀器參數(shù)下，得到九種Amadori化 合物定量離子峰面積，代入回歸方程，計算得到樣品溶液中九種Amadori化合物濃度。
[0014] 本發(fā)明所述糕點類食品是指是W面粉或米粉、糖、油脂、蛋、乳品為主要原料，配W 各種輔料、館料和調(diào)味料，初制成型，再經(jīng)蒸、烤、炸、炒任一方式加工制成的食品。所述干燥 氣和銷氣為純度>99.99%的氮氣。
[0015] 本發(fā)明方法具有W下優(yōu)點：
[0016] (1)本發(fā)明建立了一種液相色譜-Ξ重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀同時檢測糕點類食品中 九種Amadori化合物的方法，能夠準(zhǔn)確地對糕點類食品中九種Amadori化合物進行定性、定 量；
[0017] (2)本發(fā)明使用甲醇作為萃取溶液，同時起到了沉淀蛋白質(zhì)的作用，使用正己燒去 除脂肪類物質(zhì)干擾，能夠有效的去除糕點類食品復(fù)雜基質(zhì)對檢測信號的干擾；
[001引（3)本發(fā)明使用肥Η C18色譜柱與0.5 %甲酸水溶液+甲醇流動相的選擇，對九種 Amadori化合物的分離達到了優(yōu)異的分離效果，可在6min內(nèi)實現(xiàn)九種Amadori化合物的定性 分析及定量測定；
[0019] (4)本發(fā)明檢出限在0.134邑/邑~0.704邑/邑之間，日內(nèi)精密度350(11 = 6)在2.44%~ 5.79%，日間精密度RSD(n = 3)在3.02%~5.97%，穩(wěn)定性好，回收率在80.3%~112.4%之 間，準(zhǔn)確性高;液相色譜-串聯(lián)Ξ重四級桿質(zhì)譜儀操作簡單快捷、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好。
[0020] 本發(fā)明方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，非常適合復(fù)雜基質(zhì)糕點類食品中九種Amadori化 合物的分析。
【附圖說明】
[0021] 圖1為九種Amadori化合物的總離子流(TIC)圖；
[0022] 圖2為甘氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Gly)定量離子的MRM圖；
[0023] 圖3為丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Ala)定量離子的MRM圖；
[0024] 圖4為α-氨基下酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Amb)定量離子的MRM圖；
[0025] 圖5為脯氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Pro)定量離子的MRM圖；
[00%]圖6為天冬氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Asn)定量離子的MRM圖；
[0027]圖7為異亮氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Ile)定量離子的MRM圖；
[00%]圖8為谷氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Glu)定量離子的MRM圖；
[0029] 圖9為苯丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Phe)定量離子的MRM圖；
[0030] 圖10為色氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-T巧)定量離子的MRM圖；
[0031] 圖11為某餅干的總離子流(TIC)圖；
[0032] 圖12為某餅干異亮氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Ile)定量離子的Mia?;
[0033] 圖13為某餅干苯丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Phe)定量離子的MRM圖；
[0034] 圖14為某餅干色氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-T巧)定量離子的MRM圖。
【具體實施方式】
[0035] 下面通過實施例對本發(fā)明進行進一步說明。
[0036] -種采用液相色譜-串聯(lián)Ξ重四級桿質(zhì)譜法同時檢測糕點類食品中九種Amadori 化合物濃度的方法，先準(zhǔn)備如下測定儀器和材料：
[0037] 液相色譜-串聯(lián)Ξ重四級桿質(zhì)譜儀(Agilent 1290-6460,美國）；分析天平(梅特勒 AB204-S，瑞±);容量瓶，lOmL、ΙΟΟιΛ;離屯、管，50ιΛ;去離子水(達到GB/T 6682中一級水的 要求）；甲酸(分析純，西晚化工股份有限公司）；甲醇(色譜純，Dikma公司）；正己燒(色譜純， Dikma公司）；Stra1:a-X-AW固相萃取柱(Phenomenex S陽小柱，60mg/3mL);高純氮氣（純度> 99.999 %，昆明梅塞爾氣體產(chǎn)品有限公司）。
[0038] 檢測方法步驟如下：
[0039] (1)制備九種Amadori化合物混合母液:分別稱取甘氨酸與葡萄糖Amadori化合物 (Fru-Gly)、丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Ala)、α-氨基下酸與葡萄糖Amadori化合 物(Fru-Amb)、脯氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Pro)、天冬氨酸與葡萄糖Amadori化合 物(Fru-Asn)、異亮氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Ile)、谷氨酸與葡萄糖Amadori化合 物(Fru-Glu)、苯丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Phe)、色氨酸與葡萄糖Amadori化合 物(Fru-T巧)標(biāo)準(zhǔn)品lOmg于lOmL容量瓶中，各采用質(zhì)量濃度70%的甲醇水溶解并定溶，然后 各分別移取5mL上述九種溶液于lOOmL容量瓶中，采用質(zhì)量濃度70 %的甲醇水定溶得到九種 Amadori化合物混合母液；
[0040] (2)準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取0.02mL、0.1 OmL、0.20mL、0.50mL、1. OmL九種 Amadori化合物混合母液于lOmL容量瓶中，采用質(zhì)量濃度0.5%的甲酸水溶液定容，得到標(biāo) 準(zhǔn)工作溶液系列;標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列中，九種Amadori化合物的濃度分別為0.10yg/mL、0.50 μ邑/mL、1.ΟΟμ邑/mL、2.50μ邑/mL、1.ΟΟμ邑/mL;
[0041] (3)制備樣品溶液:進行糕點類食品中Amadori化合物的溶解、萃取與凈化，具體步 驟是稱取1. Og糕點類食品于50mL離屯、管中，加入lOmL甲醇，超聲提取lOmin，lOOOOr/min離 屯、5min，上清液倒入另一離屯、管中，加入lOmL正己燒，滿旋Imin，lOOOOr/min離屯、2min，棄去 上層正己燒層，再加入lOmL正己燒，滿旋Imin，lOOOOr/min離屯、2min，同樣棄去上層正己燒 層，下層甲醇在35 °C條件下氮氣吹干，加入2mL質(zhì)量濃度0.5 %的甲酸水溶液溶解后，經(jīng)0.22 μπι過濾膜后得到樣品溶液;所述糕點類食品可W是W面粉或米粉、糖、油脂、蛋、乳品等為主 要原料，配W各種輔料、館料和調(diào)味料，初制成型，再經(jīng)蒸、烤、炸、炒任一方式加工制成的食 品；
[0042] (4)進行液相色譜-串聯(lián)Ξ重四級桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析:采用液相色譜-串聯(lián)Ξ 重四級桿質(zhì)譜分析儀，分析檢測的液相色譜、質(zhì)譜條件如下：
[0043] 色譜柱為WatersAcquity 邸Η C18(1.7皿，2.1mmX100mm)，柱溫25°C;流動相A為 質(zhì)量濃度0.5 %的甲酸水溶液，流動相B為甲醇溶液;梯度洗脫，條件為0~lOmin: 95 % A~ 0%4，10.1~14111111:0%4，14.1~18111111:95%4;流速:0.211117111111，進樣體積化1^;可在6111111內(nèi) 實現(xiàn)九種Amadori化合物的定性分析及定量測定；
[0044] 串聯(lián)質(zhì)譜條件是正離子模式電離，離子源采用電噴霧電離源化SI)，掃描方式為正 離子掃描，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，電噴霧電壓500V，干燥氣溫度325°C，干燥氣 流量化/min，銷氣溫度380°C，銷氣流量lOL/min，毛細管電壓，4000V。所述干燥氣和銷氣均 為純度>99.99 %的氮氣。
[0045] 九種Amadori化合物的準(zhǔn)分子離子峰（[M+H]+離子峰）、錐孔電壓、定量離子、定性 離子、碰撞能量(CE)參見表1，九種Amadori化合物標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖和各定量離子MRM圖見 圖1至圖10。
[0046] 表1各化合物的[M+扣+離子峰、錐孔電壓、定量離子、定性離子、碰撞能量
[0047]
[0048] (5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及計算結(jié)果:分別吸取步驟(2)制備的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進 行LC-MS/MS分析，在步驟(4)確定的儀器參數(shù)下，W九種Amadori化合物定量離子峰面積對 其所對應(yīng)的質(zhì)量濃度進行線性回歸，得到各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;再分別吸取步驟 (3)制備的樣品溶液進行LC-MS/MS分析，在步驟(4)確定的儀器參數(shù)下，得到九種Amadori化 合物定量離子峰面積，代入回歸方程，計算得到樣品溶液中九種Amadori化合物濃度。
[0049] 對本發(fā)明方法做如下方法學(xué)驗證：用3倍和10倍噪音值分別計算該方法的檢測限 和定量限。所得的相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。
[0050]表2九種Amadori化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限、定量限
[0化1 ]
[0化3] 選擇某一餅干樣品，經(jīng)前處理后檢測結(jié)果為確定含有Fru-Ile、Fru-化e和化U-化P Ξ種物質(zhì)，然后分別添加高、中、低Ξ個含量水平(0.5化g/g，1.50yg/g，5.0化g/g)的九種 Amadori化合物混合標(biāo)準(zhǔn)母液進行加標(biāo)回收實驗，計算回收率;同時進行該方法的日內(nèi)精密 度和日間精密度測定，用測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示，見表3。
[0054]表3九種Amadori化合物的日內(nèi)精密度、日間精密度、回收率
[0化5]
[0056]樣品測定:某一餅干樣品，從待測樣品的總離子流圖（圖11)和MRM圖（圖12、圖13和 圖14)中可W看到樣品在2.949min、3.561min和4.276min處有一色譜峰與化u-Ile、Fru-陸e 和Fru-化p的保留時間相近，樣品在M/Z = 276.1處的特征分子離子峰，與Fru-11 e的特征分 子離子峰相同；樣品在1/^2 = 310.1處的特征分子離子峰，與化11斗}16的特征分子離子峰相 同；樣品在M/Z = 349.2處的特征分子離子峰，與Fru-化P的特征分子離子峰相同；可確定樣 品中含Rru-I le Jru-Phe 和Rru-T 巧。
[0057] 將樣品中F;ru-Ile、F;ru-Phe和F;ru-T;rp的峰面積代入線性回歸方程中，即可得到樣 品中 Fru-Ile、Fru-I%e 和 Fru-T 巧的濃度為 1.12 化 g/mL、0.81 祉 g/m 巧 P2.462yg/mL，再乘 W 定容體積2mL，除W稱重量，得到：該餅干含有化U-I le 2.230yg/g，化u-Phe 1.620yg/g， 化u-T巧4.876yg/g。
【主權(quán)項】
1. 同時檢測糕點類食品中九種Amadori化合物濃度的方法，其特征在于，方法步驟如 下： (1) 制備九種Amadori化合物混合母液:分別稱取甘氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Gly)、丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Ala)、α-氨基丁酸與葡萄糖Amadori化合物 (Fru-Amb)、脯氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Pro)、天冬氨酸與葡萄糖Amadori化合物 (Fru-Asn)、異亮氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Ile)、谷氨酸與葡萄糖Amadori化合物 (Fru-Glu)、苯丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物(Fru-Phe)、色氨酸與葡萄糖Amadori化合物 (Fru-Trp)標(biāo)準(zhǔn)品10mg于10mL容量瓶中，各采用質(zhì)量濃度70 %的甲醇水溶解并定溶，然后各 分別移取5mL上述九種溶液于100mL容量瓶中，采用質(zhì)量濃度70%的甲醇水定溶得到九種 Amadori化合物混合母液； (2) 準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別移取0.02mL、0.10mL、0.20mL、0.50mL、1. OmL九種Amadori 化合物混合母液于lOmL容量瓶中，采用質(zhì)量濃度0.5 %的甲酸水溶液定容，得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液系列；標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列中，九種Amadori化合物的濃度分別為0.10yg/mL、0.50yg/mL、 1·OOyg/mL、2·50yg/mL、1·00yg/mL; (3) 制備樣品溶液:進行糕點類食品中Amadori化合物的溶解、萃取與凈化，具體步驟是 稱取l.Og糕點類食品于50mL離心管中，加入10mL甲醇，超聲提取10min，10000r/min離心 5min，上清液倒入另一離心管中，加入10mL正己燒，禍旋lmin，10000r/min離心2min，棄去上 層正己燒層，再加入10mL正己燒，禍旋lmin，10000r/min離心2min，同樣棄去上層正己燒層， 下層甲醇在35°C條件下氮氣吹干，加入2mL質(zhì)量濃度0.5%的甲酸水溶液溶解后，經(jīng)0.22μπι 過濾膜后得到樣品溶液； (4) 進行液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜分析:采用液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜分 析儀，分析檢測的液相色譜、質(zhì)譜條件如下： 色譜柱為WatersAcquity ΒΕΗ (]18(1.7以111，2.11]1111\10〇1]1111)，柱溫：25°〇;流動相八為 0.5 %甲酸的水溶液，流動相B為甲醇溶液;梯度洗脫，條件為0~lOmin: 95 % A~0 % A，10.1 ~14min:0%A，14.1~18min:95%A;流速:0· 2mL/min，進樣體積 2yL; 離子源:采用電噴霧電離源，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測MRM，電噴 霧電壓500V，干燥氣溫度325°C，干燥氣流量6L/min，鞘氣溫度380°C，鞘氣流量10L/min，毛 細管電壓4000V; (5) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及計算結(jié)果：分別吸取步驟（2)制備的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行 LC-MS/MS分析，在步驟(4)確定的儀器參數(shù)下，以九種Amadori化合物定量離子峰面積對其 所對應(yīng)的質(zhì)量濃度進行線性回歸，得到各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;再分別吸取步驟(3) 制備的樣品溶液進行LC-MS/MS分析，在步驟(4)確定的儀器參數(shù)下，得到九種Amadori化合 物定量離子峰面積，代入回歸方程，計算得到樣品溶液中九種Amadori化合物濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測糕點類食品中九種Amadori化合物濃度的方法，其特 征在于，所述糕點類食品是指是以面粉或米粉、糖、油脂、蛋、乳品為主要原料，配以各種輔 料、餡料和調(diào)味料，初制成型，再經(jīng)蒸、烤、炸、炒任一方式加工制成的食品。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測糕點類食品中九種Amadori化合物濃度的方法，其特 征在于，所述干燥氣和鞘氣為純度多99.99 %的氮氣。
【文檔編號】G01N30/02GK106066367SQ201610349074
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年5月24日 公開號201610349074.5, CN 106066367 A, CN 106066367A, CN 201610349074, CN-A-106066367, CN106066367 A, CN106066367A, CN201610349074, CN201610349074.5
【發(fā)明人】董勝強, 楊式華, 侯英, 張朗, 朱葉梅, 孔蘭芬, 楊蕾, 李偉, 王玉, 劉靜, 楊燕, 許志成, 周文忠, 王浩存
【申請人】云南同創(chuàng)檢測技術(shù)股份有限公司