使用Luterial的形態(tài)特征用于診斷疾病的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用存在于血液中的Luterial的形態(tài)特征用于疾病診斷的方法。根據(jù)本發(fā)明，Luterial的形態(tài)特征如數(shù)目、大小或形狀，及其根據(jù)疾病(特別是癌癥)種類和進(jìn)展的運(yùn)動(dòng)(納米追蹤速度)變化可通過(guò)觀察和測(cè)量血液中Luterial的特性有效確定。
【專利說(shuō)明】
使用Luter i a I的形態(tài)特征用于診斷疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及使用存在于從患者獲得的體液包括血液中的Luterial的形態(tài)特征用 于疾病診斷的方法。 技術(shù)背景
[0002] 過(guò)去將血液中的微材料如細(xì)胞外小泡等（下文統(tǒng)稱為EV)識(shí)別為不具有特定功能 的材料。然而，積累的證據(jù)表明EV具有多種生物功能。例如，已報(bào)道源自血小板的EV經(jīng)由蛋 白（例如CD154、RANTES、PF-4)在小泡表面的選擇性表達(dá)刺激特定細(xì)胞（Thromb.化emost. (1999)82:794;J.Biol. Chem.( 1999)274:7545)，且已顯示來(lái)自血小板衍生的EV的生物活性 脂質(zhì)（例如HTET、花生四締酸)對(duì)其祀細(xì)胞具有一定作用(J.Biol.化em. (2001)276:19672; Cardiovasc.Res. (2001 )49(5) :88)?？傊?，存在于生物樣品中的EV的具體特性(例如大小、 表面抗原、來(lái)源細(xì)胞的確定或有效載荷(payload))可為疾病的診斷、預(yù)后或治療提供信息， 且因此已經(jīng)充分認(rèn)識(shí)到對(duì)于鑒定能夠應(yīng)用于檢測(cè)和治療疾病的生物指數(shù)的需求。
[0003] 同時(shí)，癌癥是無(wú)法治愈的疾病，目前其在大多工業(yè)化國(guó)家均為死亡的第一原因。癌 癥治愈率仍很低，且由于癌癥的死亡數(shù)目持續(xù)增加和由此家庭負(fù)擔(dān)和國(guó)家醫(yī)療費(fèi)用負(fù)擔(dān)也 已顯著增加。癌癥是其中細(xì)胞無(wú)限增殖且影響正常細(xì)胞功能的疾病。其代表性實(shí)例包括肺 癌、胃癌(GC)、乳腺癌(BRC)和結(jié)直腸癌(CRC)。然而，癌癥基本上可在任何組織中生成。
[0004] 過(guò)去，基于由癌細(xì)胞生長(zhǎng)引起的生物組織的外部變化診斷癌癥，但最近，已嘗試使 用存在于生物組織或細(xì)胞如血液中的痕量的生物分子、二醇鏈、DNA等診斷和檢測(cè)癌癥。然 而，最常使用的用于診斷癌癥的方法是經(jīng)由通過(guò)活檢獲得的組織樣品的使用或影像的使 用。其中，生物活檢具有在患者中引起劇烈疼痛、需要很高的花費(fèi)且診斷癌癥需要很長(zhǎng)時(shí)間 的缺點(diǎn)。此外，在患者實(shí)際上患有癌癥的情況中，在活檢過(guò)程中存在誘導(dǎo)癌癥轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)， 且在組織樣品通過(guò)活檢可能未獲得的情況中，不可能在疑似組織樣品通過(guò)手術(shù)操作取出之 前診斷疾病。在使用影像的情況中，基于X-射線圖像、使用具有附著了祀向疾病的材料的造 影劑獲得的核磁共振(NMR)圖像等診斷癌癥。然而，該類診斷的缺點(diǎn)是取決于臨床醫(yī)師或醫(yī) 生閱讀影像的熟練度存在錯(cuò)誤診斷的可能性，且其精確度顯著依賴于獲得影像的設(shè)備的精 確性。此外，即使在最精確設(shè)備的情況中，檢測(cè)具有數(shù)mm或更小尺寸的腫瘤很難，使得難于 在早期檢測(cè)腫瘤。此外，在該過(guò)程中由于患者或具有風(fēng)險(xiǎn)的人暴露于可能生成基因突變的 高能電磁波，可誘導(dǎo)另一疾病。另一缺點(diǎn)是診斷患者的影像數(shù)目可容忍由于該暴露風(fēng)險(xiǎn)受 到限制。
[0005] 由于用于診斷癌癥的活檢伴隨長(zhǎng)時(shí)間、花費(fèi)、不適、疼痛等，對(duì)能夠顯著減少進(jìn)行 不必要活檢的患者的數(shù)目并在早期精確診斷癌癥的方法有很大需求。
[0006] 在運(yùn)方面，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可通過(guò)觀察Luterial(其為存在于患者體液的一 類納米顆粒)的形態(tài)特征診斷和預(yù)測(cè)疾病，由此完成本發(fā)明。
[0007] 公開(kāi)內(nèi)容
[000引本發(fā)明的目的是提供一種使用存在于患者體液中的Luterial的形態(tài)特征用于診 斷疾病的方法。
[0009] -方面，本發(fā)明提供為診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)疾病提供信息的方法，其經(jīng)由：
[0010] 通過(guò)顯微術(shù)測(cè)量選自如下的至少一種標(biāo)準(zhǔn)：存在于患者體液中的Luterial的數(shù) 目、大小(直徑和面積）、形狀、膜(例如筋膜、涂層、薄膜等)形成和納米追蹤速度;并
[0011] b)將從步驟a)測(cè)量或確認(rèn)的結(jié)果與正常人Luterial、正常Luterial或紅細(xì)胞的那 些進(jìn)行比較。
[0012] 本發(fā)明還提供為診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后提供信息的方法，其經(jīng)由：
[0013] a)使用電子顯微術(shù)鑒定存在于患者體液中的Luterial的形狀；
[0014] b)根據(jù)單形狀（single shape)、融合形狀(fused shape)、多重融合形狀(multi- 化sed shape)和其中膜破裂的融合形狀的類別中的形狀對(duì)Luterial進(jìn)行分類;和
[0015] C)基于來(lái)自步驟b)的分類確定疾病的階段。
[0016] 另一方面，本發(fā)明提供用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法，其經(jīng)由：
[0017] a)通過(guò)顯微術(shù)測(cè)量來(lái)自如下的至少一種標(biāo)準(zhǔn)：患者的體液中存在的Luterial的數(shù) 目、大小(直徑或面積）、形狀、膜(例如筋膜(fascia)、涂層boat)、薄膜(film)等)形成和納 米追蹤（nano-tracking)速度；并
[0018] b)將從步驟a)測(cè)量或確認(rèn)的結(jié)果與正常人的Luterial、正常Luterial或紅細(xì)胞的 那些進(jìn)行比較。
[0019] 本發(fā)明還提供用于診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)疾病的方法，其經(jīng)由：
[0020] a)使用電子顯微術(shù)鑒定存在于患者體液中的Luterial的形狀；
[0021] b)根據(jù)單形狀、融合形狀、多重融合形狀和其中膜破裂的融合形狀的類別中的形 狀對(duì)Luterial進(jìn)行分類;和
[0022] C)基于來(lái)自步驟b)的分類確定疾病的階段。
[0023] 本發(fā)明其他特征和實(shí)施方案由如下詳細(xì)說(shuō)明和所附的權(quán)利要求將變得顯而易見(jiàn)。
[0024] 附圖簡(jiǎn)述
[00巧]圖1示意性地說(shuō)明Luterial的生命周期。
[0026] 圖2A是源自末期非小細(xì)胞肺癌患者血液的Luterial的照片，使用共聚焦激光掃描 顯微鏡拍攝，圖2B是源自末期非小細(xì)胞肺癌患者血液的Luterial的用羅丹明123巧光染色 后獲得的共聚焦激光掃描顯微鏡照片，且圖2C是源自末期非小細(xì)胞肺癌患者血液的 Luterial的照片，使用電子顯微鏡拍攝。
[0027] 圖3展示源自血液的Luterial的照片，使用電子顯微鏡拍攝并通過(guò)直徑排列（從 100至lOOOnm或更多）。
[002引圖4A是正常人血液中的Luterial的照片(步驟1)，使用暗視野顯微鏡拍攝；圖4B是 正常人血液的Luterial的照片（步驟2)，使用暗視野顯微鏡拍攝；圖4C是正常人血液的 Luterial的照片(步驟3)，使用暗視野顯微鏡拍攝；圖4D是具有染色體甲基化異常的患者血 液的Luterial的照片(步驟4)，使用暗視野顯微鏡拍攝；圖4E是具有基因突變的患者血液的 Luterial的照片（步驟5)，使用暗視野顯微鏡拍攝；圖4F是具有基因突變的患者血液的 Luterial的照片(步驟6)，使用暗視野顯微鏡拍攝；圖4G是具有腫瘤相關(guān)基因突變的患者血 液的Luterial的照片(步驟7)，使用暗視野顯微鏡拍攝；圖4H是具有腫瘤相關(guān)基因復(fù)合突變 的患者血液的Luterial的照片(步驟8)，使用暗視野顯微鏡拍攝;且圖41是源自末期癌癥患 者血液的Luterial的照片(步驟9)，使用暗視野顯微鏡拍攝。
[00巧]圖5是團(tuán)狀Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝。
[0030] 圖6是棒狀Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝。
[0031] 圖7A-7E是源自肺癌患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝（圖7A:早期； 圖7B-7E:2或3期）。
[0032] 圖8A-8E是源自乳腺癌患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝（圖8A/8B: 早期；圖8C/8D:中期；圖8E:淋己、腹膜和屯、包轉(zhuǎn)移）。
[00削圖9A-9D是源自膜腺癌患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝（圖9A:早 期；圖9B-9D:中期）.
[0034] 圖10是源自具有骨/肺轉(zhuǎn)移的膽總管癌患者的Luterial的照片，使用共聚焦激光 掃描顯微鏡拍攝。
[0035] 圖11是源自胸膜間皮瘤患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝。
[0036] 圖12是源自狀腺癌患者（中期）的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝。
[0037] 圖13A和13B是源自卵巢癌患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝（圖 13A/13B:中期）。
[0038] 圖14是源自膽道癌患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝。
[0039] 圖15是源自前列腺癌患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝。
[0040] 圖16A和16B是源自急性成淋己細(xì)胞白血病患者的Luterial的照片，使用暗視野顯 微鏡拍攝(圖16A:中期；圖16B:進(jìn)展至棒-團(tuán)復(fù)合的形狀）。
[0041] 圖17A-17C展示了源自肝癌患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝（圖 17A:早期，圖17B/17C:中期，且圖17D是源自具有肺轉(zhuǎn)移的肝癌患者的Luterial的照片，使 用共聚焦激光掃描顯微鏡拍攝）。
[0042] 圖18展示了源自具有肝的血管肉瘤的患者的Luterial的照片，使用共聚焦激光掃 描顯微鏡拍攝。
[0043] 圖19A-19C展示了源自結(jié)腸癌患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝。
[0044] 圖20是源自子宮癌患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝。
[0045] 圖21是源自早期胃癌患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝。
[0046] 圖22A和2?展示了源自早期腎癌患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍攝 (圖22A:團(tuán)-棒進(jìn)展?fàn)?；圖22B:團(tuán)狀）。
[0047] 圖23A-23C是源自急性髓性白血病患者的Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡拍 攝（圖23A:團(tuán)-棒進(jìn)展?fàn)睿粓D23B/23C:中期）。
[004引圖24是源自急性髓性白血病患者的Luterial的照片（團(tuán)-棒進(jìn)展?fàn)睿?，使用暗視?顯微鏡拍攝。
[0049] 圖25A展示了源自具有肝轉(zhuǎn)移的胃癌患者的Luterial;圖25B展示了源自具有腹膜 轉(zhuǎn)移的胃癌患者的Luterial;且圖25C展示了具有腹膜和肝臟轉(zhuǎn)移的胃癌患者的Luterial。
[0050] 圖26展示了源自具有骨轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移的腎癌患者的Luterial;圖27展示了源自具 有骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者的Luterial;圖28展示了源自具有淋己轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌 (NS化C)患者的Luterial;圖29是源自具有骨轉(zhuǎn)移的腎癌患者的Luterial的照片，使用暗視 野顯微鏡拍攝;且圖30是源自急性成淋己細(xì)胞白血病患者的Luterial的照片，使用暗視野 顯微鏡拍攝。
[0051 ] 圖31是通過(guò)使用納米追蹤器(nano tracker)測(cè)量Luterial的運(yùn)動(dòng)速度（納米追蹤 速度)獲得的照片。
[0052] 圖32A-32C是展示具有其中膜破裂的融合形狀的Luterial形狀的照片，按順序使 用電子顯微鏡拍攝。
[0053] 實(shí)施方案的詳述
[0054] 除非本文另外表明，在本說(shuō)明書(shū)中的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。一般而言，本說(shuō)明書(shū)中使用的命名法為本領(lǐng)域已知和 通常使用的。
[0055] 如本文使用，術(shù)語(yǔ)"Luterial"指存在于所有動(dòng)物中的一種納米顆粒(活生物體）， 其具有病毒尺寸至約500nm范圍的尺寸(在正常裂變階段過(guò)程中：50-500nm/在異常融合階 段過(guò)程中：800皿或更大），且該術(shù)語(yǔ)由本發(fā)明的發(fā)明人命名。Luterial包含DNA和RNA兩者， 且其與外來(lái)體或微泡的區(qū)別在于Luterial具有粘附特性和運(yùn)動(dòng)性。
[0056] 在包括人的動(dòng)物中，納米顆粒存在于血液、唾液、淋己、精液、陰道粘液、母乳(特別 是初乳）、廝帶血、腦細(xì)胞、脊髓、骨髓中，并稱作"Luterial"。此外，存在于植物中的稱作 "Luterion"，且推測(cè)動(dòng)物血液等中發(fā)現(xiàn)的Luterial的來(lái)源為源自植物的Luterion(圖1)。 [0057]鑒于Luterial可通過(guò)詹納斯綠B(Janus Green B)、羅丹明l23、Mito1:racke;r(線粒 體巧光探針），日丫晚澄(Acridine Orange)和DAPI (其為用于線粒體的已知的巧光染色標(biāo)記 物）陽(yáng)性染色，Luterial看起來(lái)具有與線粒體相似的雙膜結(jié)構(gòu)及較少完全形式(completed form)的內(nèi)崎（inner cristae)，且在與線粒體相同的激光波長(zhǎng)范圍中觀察到Luterial，因 此將Luterial稱作"假線粒體"、"線粒體類似物"或"原線粒體"。
[005引在包括人的動(dòng)物中，Luterial存在于血液、唾液、淋己、精液、陰道粘液、母乳(特別 是初乳）、廝帶血、腦細(xì)胞、脊髓和骨髓中。此外，在具有角的動(dòng)物情況中，Luterial存在于角 中。
[0059] 還預(yù)期Luterial與細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)整W及信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化和細(xì)胞調(diào)亡 相關(guān)，且在其中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Luterial與癌癥的診斷密切相關(guān)。
[0060] 預(yù)期正常的Luterial發(fā)揮阻斷癌細(xì)胞生長(zhǎng)并允許細(xì)胞恢復(fù)至健康免疫系統(tǒng)的作 用，且該作用經(jīng)由RNA干擾(RNAi)(基因可通過(guò)其標(biāo)準(zhǔn)化)實(shí)施。由此，在RNA中的信息系統(tǒng)偏 離正常軌道而指導(dǎo)誘導(dǎo)疾病的蛋白產(chǎn)生的疾病狀態(tài)中，源自健康人或動(dòng)物的Luterial有意 干擾該過(guò)程W抑制疾病如癌癥的進(jìn)展。此外，由于當(dāng)Luterial生長(zhǎng)至200~500nm大小時(shí)它 還參與能量代謝，在Luterial不行使其正常功能情況中，誘導(dǎo)穩(wěn)態(tài)化omeostasis)和ATP產(chǎn) 生方面的嚴(yán)重病癥，由此導(dǎo)致呼吸和能量代謝方面的疾病。
[0061 ] 不行使其正常功能異常的Luterial體現(xiàn)與正常Luterial不同的生態(tài)和特性，從而 異常的Luterial具有多種大小和形狀。更具體地，一旦形成雙抱子，正常的Luterial停止生 長(zhǎng)，但癌癥患者或具有慢性疾病的患者血液中發(fā)現(xiàn)的異常的Luterial體現(xiàn)與干細(xì)胞相似的 持續(xù)生長(zhǎng)的特性，從而異常的Luterial具有600-80化m或更大的尺寸，且在一些情況中，生 長(zhǎng)至200皿(200,000皿)或更大的尺寸。此外，異常的Luterial在紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等 中表現(xiàn)侵略性的生長(zhǎng)行為，且與其他Luterial聚集，與病毒相似。
[0062]同時(shí)，Luterial的數(shù)目、大?。ㄖ睆交蛎娣e）、形狀、涂層形成和納米追蹤速度取決 于個(gè)體中疾病的存在或不存在而不同，從而可能通過(guò)運(yùn)些特征的一種或組合診斷疾病或預(yù) 測(cè)疾病的預(yù)后。運(yùn)可由從源自健康無(wú)疾病人的Luterial的數(shù)目、大小(直徑或面積）、形狀、 涂層形成和納米追蹤速度與源自患有疾病的人的Luterial的那些不同的事實(shí)來(lái)理解。所述 不同由Luterial中突變的存在和不存在引起，且因此源自患有疾病的人的Luterial在下文 中稱作"突變Luterial" W與源自健康人的正常Luterial進(jìn)行區(qū)分。
[0063] 總之，可能通過(guò)觀察患者體液中存在的Luterial的數(shù)目和形態(tài)或生化特性診斷疾 病或預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后。
[0064] 更具體地，在患者中，Luterial特別是具有400皿或更小尺寸的Luterial的數(shù)目與 正常人相比減少，且在嚴(yán)重的疾病狀態(tài)中，Luterial的數(shù)目減少20-80 %。因此，其中 Luterial的數(shù)目小于等于正常人中的20%的情況可疑似具有腫瘤。
[0065] 此外，如果具有大于20WI1尺寸（長(zhǎng)直徑）的突變Luterial,可確定受試者疑似具有 腫瘤。而且，即使在發(fā)現(xiàn)Luterial具有少于20μπι的長(zhǎng)直徑的情況中，如果涂層在突變的 Luterial外側(cè)形成，則可確定受試者疑似具有腫瘤。然而，即使在具有長(zhǎng)直徑超過(guò)20μπι的 Luterial存在的情況中，不存在涂層形成可指示受試者具有良性腫瘤。
[0066] 此外，源自患者的Luterial的運(yùn)動(dòng)與源自正常人的相比顯著減少。Luterial的運(yùn) 動(dòng)可通過(guò)測(cè)量納米追蹤速度量化。
[0067] 因此，一方面，本發(fā)明提供為診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后提供信息的方法，其經(jīng)由：
[0068] a)通過(guò)顯微術(shù)測(cè)量來(lái)自如下的至少一種標(biāo)準(zhǔn)：患者體液中存在的Luterial的數(shù) 目、大小(直徑或面積）、形狀、膜(例如筋膜、涂層、薄膜等)形成和納米追蹤速度;并
[0069] b)將從步驟a)測(cè)量或確認(rèn)的結(jié)果與正常人的Luterial、正常Luterial或紅細(xì)胞的 那些進(jìn)行比較。
[0070] 另一方面，本發(fā)明設(shè)及用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法，其經(jīng)由：
[0071 ] a)通過(guò)顯微術(shù)測(cè)量來(lái)自如下的至少一種標(biāo)準(zhǔn)：患者體液中存在的Luterial的數(shù) 目、大小(直徑或面積）、形狀、膜(例如筋膜、涂層、薄膜等)形成和納米追蹤速度;并
[0072] b)將從步驟a)測(cè)量或確認(rèn)的結(jié)果與正常人的Luterial、正常Luterial或紅細(xì)胞的 那些進(jìn)行比較。
[0073] 在本發(fā)明中觀察到的Luterial可從患者體液分離。如本文使用，術(shù)語(yǔ)"患者體液" 可包括但不限于血液、唾液、淋己、精液、陰道粘液、母乳(特別是初乳）、廝帶血、腦細(xì)胞、脊 髓或骨髓。最優(yōu)選地，源自血液的Luterial可用于本研究的目的。更具體地，可能通過(guò)使用 顯微鏡觀察存在于收集的血液樣品中或從血液中分離的Luterial來(lái)診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病 預(yù)后。
[0074] 在本發(fā)明例示性的實(shí)施方案中，Luterial通過(guò)如下步驟獲得:從血液分離血清的 第一分離步驟;從分離的血清分離不穿過(guò)具有l(wèi)〇〇nm-2mm直徑范圍的多種孔徑的過(guò)濾器的 沉淀的第二分離步驟;和洗涂分離的沉淀的洗涂步驟。
[0075] 更詳細(xì)地，第一分離步驟可包括從患者收集血液和使用離屯、機(jī)Wl200-50(K)rpm將 收集的血液樣品離屯、5-15分鐘W獲得血清。第二分離步驟可包括使用離屯、去除一般EV如來(lái) 自血清的外來(lái)體W獲得上清級(jí)分的步驟;和將獲得的上清穿過(guò)具有l(wèi)〇〇nm-2mm直徑范圍的 多個(gè)孔徑的過(guò)濾器W分離不穿過(guò)過(guò)濾器的沉淀的步驟。外來(lái)體的去除可伴隨但不限于 ExoQuick。洗涂步驟可包括用生理鹽水洗涂從沉淀（其可含有外來(lái)體)分離的血清的步驟。 洗涂步驟可進(jìn)一步包括洗涂后在冰中（4°C或更低)溫育的步驟。
[0076] 在步驟b)中觀察到或拍攝到的Luterial的長(zhǎng)直徑為紅細(xì)胞中的8-30倍大，或步驟 b)中觀察到或拍攝到的Luterial的面積為紅細(xì)胞中的8-30倍大的情況中，可確定疾病為癌 癥疑似狀態(tài)。
[0077] 當(dāng)通過(guò)觀察或拍照測(cè)量Luterial的大小時(shí)，正常人的Luterial具有100-250nm的 大小，但在疲勞綜合征的情況中，Luterial具有250-800nm的大小，且在疾病的情況中， Luterial具有800nm或更大的大小，最大可為數(shù)百μηι(約200μηι)。
[0078] 在步驟b)中觀察到或拍攝到的Luterial的數(shù)目為正常人的Luterial的數(shù)目的 20% W下且其大小(直徑)為0.8-1WI1的情況可確定為處于疾病發(fā)展疑似狀態(tài)，且其大小超 過(guò)20WI1的情況可確定為處于癌癥疑似狀態(tài)。在突變Luterial外部上形成涂層的情況中，突 變Luterial可確定為癌癥標(biāo)記物而無(wú)論其大小。具體地，在形成涂層且觀察到鞭毛(觸角） 樣結(jié)構(gòu)的情況中，所述突變Luterial可確定為對(duì)于惡性腫瘤嚴(yán)重狀態(tài)的標(biāo)記物。涂層形成 的存在或不存在可使用暗視野顯微鏡或電子顯微鏡觀察。
[0079] 在步驟a)中，觀察到或拍攝到Luterial的形狀，且在步驟b)中，基于觀察到或拍攝 到的Luterial的形狀診斷疾病。
[0080] 在步驟b)中，Luterial的形狀可選自下組:正常形狀、其中Luterial具有在其外部 形成鞭毛樣結(jié)構(gòu)的鞭毛狀，團(tuán)(M)狀、棒化)狀、和復(fù)合狀。
[0081 ] 在正常形狀的Luterial中，長(zhǎng)直徑和短直徑的比例可為1:1-3:1。
[0082] 團(tuán)狀是呈圓形及其大量的膜開(kāi)放的Luterial的聚集物，且其長(zhǎng)和短直徑間的比例 可 W 為3:1-5:1。
[0083] 棒狀是呈尖銳和棱角形及其大量的膜閉合的Luterial的聚集物，且其長(zhǎng)和短直徑 間的比例可W為5:1-12:1。
[0084] 棒狀可W是由單圓形或卵形鏈組成的棒狀-1形或由兩條或多條單鏈彼此偶聯(lián)組 成的棒狀-2形。
[0085] 復(fù)合形可W是棒狀和團(tuán)狀、棒狀和棒狀或團(tuán)狀和團(tuán)狀的融合形式。
[0086] 在從步驟b)中的觀察或照片確定的Luterial的形狀為棒狀的情況中，運(yùn)樣的 Luterial可作為用于肺癌、乳腺癌、膜腺癌、膽總管癌、胸膜間皮瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、膽道 癌、前列腺癌或成淋己細(xì)胞血癌發(fā)展的標(biāo)記物發(fā)揮功能。在確定的形狀為團(tuán)狀的情況中， Luterial可作為肝癌、肝的血管瘤、結(jié)腸直腸癌、子宮癌、胃部癌癥(gastric cancer(胃癌 (stomach cancer)))、腎癌、直腸癌或髓性血癌發(fā)展的標(biāo)記物發(fā)揮功能。在確定的形狀為復(fù) 合形的情況中，Luterial可作為嚴(yán)重白血病或轉(zhuǎn)移疑似狀態(tài)的標(biāo)記物發(fā)揮功能。在確定的 形狀為鞭毛狀的情況中，Luterial可作為用于末期腫瘤疑似狀態(tài)標(biāo)記物發(fā)揮功能。
[0087] 此外，癌癥的原發(fā)位點(diǎn)可從突變luteiral的形狀追蹤。在Luterial具有棒狀的情 況中，癌癥的原發(fā)位點(diǎn)可確定為肺，乳腺，膜腺，膽管，甲狀腺，卵巢，膽道，前列腺或成淋己 細(xì)胞血液。在Luterial具有團(tuán)狀的情況中，癌癥的原發(fā)位點(diǎn)可確定為肝、大腸、子宮、消化器 官（胃）、腎、直腸或髓性血液。此外，在luteiral具有復(fù)合形的情況中，如果其從棒狀進(jìn)展成 為團(tuán)狀，癌癥的原發(fā)位點(diǎn)與棒狀Luterial相同，且如果其從團(tuán)狀進(jìn)展成為棒狀，則癌癥的原 發(fā)位點(diǎn)與團(tuán)狀Luterial相同。
[0088] 根據(jù)本發(fā)明，1-4期的癌癥疑似狀態(tài)可通過(guò)測(cè)量指示Luterial運(yùn)動(dòng)性的納米追蹤 速度而確定。在步驟b)中通過(guò)觀察或照片測(cè)量的Luterial的納米追蹤速度為8.0至Ι?μπι/秒 的情況中，可確定為1期癌癥疑似狀態(tài)。在納米追蹤速度為2.5至8.Ομπι/秒的情況中，可確定 為2期癌癥疑似狀態(tài)。在納米追蹤速度為0.5至2.5μπι/秒的情況中，可確定為3期癌癥疑似狀 態(tài)。在納米追蹤速度小于0.5μπι/秒的情況中，可確定為4期癌癥疑似狀態(tài)。
[0089] -方面，本發(fā)明設(shè)及為診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后提供信息的方法，其經(jīng)由：
[0090] a)使用電子顯微術(shù)鑒定存在于患者體液中的Luterial的形狀；
[0091] b)根據(jù)單形狀、融合形狀、多重融合形狀和其中膜破裂的融合形狀中的形狀對(duì) Luterial進(jìn)行分類;和
[0092] C)基于來(lái)自步驟b)的分類確定疾病的階段。
[0093] 另一方面，本發(fā)明設(shè)及用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法，其經(jīng)由：
[0094] a)使用電子顯微術(shù)鑒定存在于患者體液中的Luterial的形狀；
[0095] b)根據(jù)單形狀、融合形狀、多重融合形狀和其中膜破裂的融合形狀中的形狀對(duì) Luterial進(jìn)行分類;和
[0096] C)基于來(lái)自步驟b)的分類確定疾病的階段。
[0097] 源自血液的Luterial可經(jīng)由用一種或多種選自下組的染料的陽(yáng)性染色進(jìn)行確認(rèn)： 羅丹明123(Miodaminel23)、Mito1:racke;r、日丫晚澄、DAPI和詹納斯綠B，且看起來(lái)具有可通過(guò) 電子顯微術(shù)確認(rèn)的具有崎狀的雙膜結(jié)構(gòu)。
[009引在步驟C)中，通過(guò)觀察或照片確定的Luterial的形狀與單一Luterial形式80- 100%吻合的情況可確定為正常。其形狀與融合形80-100%吻合的情況可確定為疾病疑似 狀態(tài)。其形狀與多重融合形80-100%吻合的情況可確定為腫瘤疑似狀態(tài)。其形狀與融合形 80-100%吻合且其膜破裂的情況可確定為嚴(yán)重腫瘤疑似狀態(tài)。
[0099]此后，本發(fā)明將通過(guò)實(shí)施例進(jìn)行詳述。然而，運(yùn)些實(shí)施例僅為了說(shuō)明本發(fā)明，且本 領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解的是，運(yùn)些實(shí)施例不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。
[0…0] 實(shí)施例1:源自血液的Luterial的分離
[0101]通過(guò)將25化1收集自末期非小細(xì)胞肺癌患者的血液在leOOrpm離屯、10分鐘分離血 清。將63μ1 Exo如ick(SBI Co巧.）添加至血清并在3000rpm實(shí)施離屯、15分鐘后，將產(chǎn)物額外 保持15分鐘，然后，分離不與ExoQuick反應(yīng)的上層。分離的上層(上清）用微濾器（lOOnm)過(guò) 濾，由此分離不穿過(guò)微濾器的沉淀。產(chǎn)物用生理鹽水洗涂數(shù)次，且維持冰凍(4°C或更低），由 此分離對(duì)應(yīng)于微材料的Luterial。
[?！?shí)施例2:顯微觀察和Luterial確認(rèn)
[0103] 實(shí)施例1中分離的Luterial可使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察（圖2A)，并用羅丹 明123染色然后使用共聚焦激光掃描顯微鏡確認(rèn)（圖2B)，且用詹納斯綠B染色的Luterial的 陽(yáng)性反應(yīng)使用共聚焦顯微鏡確認(rèn)。
[0104] 此外，將分離的Luterial制成電子顯微鏡樣品的形式由此觀察（圖2C)。用MICA固 定血細(xì)胞后，使用探針剝離膜，由此使確認(rèn)DNA和RNA(使用原子力顯微鏡)成為可能。可使用 固定劑Cell-Tack BD(Bioscience Co巧.）或戊二醒/聚心賴氨酸代替MICA。應(yīng)用羅丹明123 (巧光染色劑）5分鐘后，洗涂Luterial然后在暗視野顯微鏡中使用澄色濾鏡（具有506nm- 520nm波長(zhǎng)帶的濾鏡)觀察，由此確認(rèn)觀察到綠色。
[0105] 圖2A-2C是實(shí)施例1中分離的Luterial的照片，且在如圖2B中所示用羅丹明123巧 光染色Luterial的情況中，Luterial特異性染色，并通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。 Luterial可用詹納斯綠B特異性染色，并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察。Luterial的染色可通過(guò)巧光 染色劑Mitotracker、日丫晚澄和DAPI確認(rèn)。
[0106] 在圖2A中所示的Luterial具有至多718nm的直徑，即0.71祉m，且確認(rèn)涂層如圖2C 所述在外部形成。事實(shí)上，對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的患者診斷為末期非小細(xì)胞肺癌。因此，在根據(jù)本發(fā) 明的診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法中，觀察到或拍攝到的Luterial的直徑為0.5ymW上 且涂層在外部形成的情況可確定為處于癌癥疑似狀態(tài)。
[0107] 圖2C是Luterial的電子顯微鏡照片，且其確認(rèn)用于根據(jù)本發(fā)明的診斷疾病和預(yù)測(cè) 疾病預(yù)后的方法的Luterial具有雙膜結(jié)構(gòu)，其中涂層在外部形成且內(nèi)部崎樣結(jié)構(gòu)未完成。
[0…引實(shí)施例3:源自多位受試者的Luterial直徑的測(cè)量(電子顯微鏡)
[0109] 通過(guò)與實(shí)施例1中相同的方法從多位受試者(30人）（從正常人至末期癌癥患者）的 血液分離Lu t er i a 1后，使用電子顯微鏡測(cè)量Lu t er i a 1的直徑。
[0110] 圖3展示了觀察到的Luterial的照片，通過(guò)直徑排列（從100至1皿）。發(fā)現(xiàn)融合或突 變的Luterial直徑為450皿W上(基本上800皿W上），且其中的大多數(shù)診斷了疾病。因此，在 根據(jù)本發(fā)明的用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法中，其中使用顯微鏡觀察到或拍攝到的 Luterial的直徑為8(K)nm，即0.祉mW上的情況可確定為處于疾病發(fā)展疑似狀態(tài)(其也可用 電子顯微鏡或原子力顯微鏡觀察到直徑為〇.45μπι)。用顯微鏡觀察到的最大尺寸為200WI1， 但最大尺寸可取決于病人而增加。
[0111] 在源自癌癥患者的血液中發(fā)現(xiàn)具有800nm(0.8ym)直徑并形成涂層的多個(gè) Luterial(圖3)。因此在根據(jù)本發(fā)明的用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法中，使用顯微鏡 觀察到或拍攝到的Luterial的直徑為0.祉mW上且形成涂層的情況中，可確定疾病為癌癥 疑似狀態(tài)。
[0112] 實(shí)施例4:源自正常人的Luterial的顯微鏡觀察
[0113] 從無(wú)疾病癥狀的正常人收集的血液涂于載玻片并覆蓋蓋玻片后，在其上添加用于 暗視野的油滴，并使用暗視野顯微鏡(N化on Eclipse化（1000^))^1000^放大倍數(shù)觀察血 液。
[0114] 作為結(jié)果，如圖4A所示，觀察到指示為閃爍點(diǎn)的Luterial。圓形材料指示紅細(xì)胞， 且觀察到源自正常人的Luterial與紅細(xì)胞相比顯著小。
[0115] 實(shí)施例5:依賴于Luterial直徑的疾病診斷和疾病預(yù)后預(yù)測(cè)
[0116] 通過(guò)與實(shí)施例1相同的方法從收集自1期、2期、3期和4期癌癥患者(每期：15位患 者）的血液分離Luterial。
[0117] 將分離的Luterial放入緩沖溶液并用羅丹明123染色后，使用共聚焦激光掃描顯 微鏡測(cè)量其直徑。具有上直徑的Luterial變體即突變Luterial的觀察率如下：
[0118] [表 1]
[0119]
[0120] ~由于癌癥的階段從早期至晚期增加
，具有上直徑的突變Luterial增加。在約 94%的4期癌癥患者中，發(fā)現(xiàn)具有上直徑的突變Luterial，且觀察到最大尺寸為200μπι W上。此外，在1期至3期癌癥患者中，具有0.5-5μπι直徑的突變Luterial的觀察率高。此外， 在對(duì)應(yīng)于末期癌癥患者的4期癌癥患者中，具有如mW上直徑的突變Luterial的觀察率高。
[0121] 因此，在根據(jù)本發(fā)明的用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法中，其中使用顯微鏡 觀察到或拍攝到的Luterial的直徑為1.0-200μπι的情況可確定為處于癌癥疑似狀態(tài)，且 Luterial的直徑為上且涂層形成的情況可確定為處于癌癥疑似狀態(tài)。
[01。] 實(shí)施例6:依賴于Luterial的形狀診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后
[0123] 從正常人收集血液后，將具有基因甲基化異常的患者、具有基因突變的患者、具有 腫瘤相關(guān)基因突變的患者和具有腫瘤相關(guān)基因復(fù)合突變的患者(末期前列腺癌患者）涂于 載玻片上并用蓋玻片覆蓋，在其上添加用于暗視野的油滴，并使用暗視野顯微鏡（Nikon Eel ipse Ni (lOOOx)) W lOOOx放大倍數(shù)觀察血液。
[0124] 此外，在實(shí)驗(yàn)組的患者中，相對(duì)于1期至4期癌癥患者計(jì)算鞭毛形Luterial對(duì)于觀 察到的Luterial的觀察率。
[0125] [表 2]
[0126]
[0127]
[0128] 根據(jù)實(shí)施例6拍攝的Luterial的形狀取決于疾病的嚴(yán)重程度分為8步驟(步驟2-步 驟9)，且示于圖4B-4I中，且步驟1示于圖4A中。
[0129] 圖4B和4C是源自正常人血液的Luterial的照片(步驟2和步驟3)，圖4D是源自具有 甲基化異常的患者血液的Luterial的照片（步驟4)，圖4E和4F是源自具有基因突變的患者 血液的Luterial的照片(步驟5和步驟6)，圖4G是源自具有腫瘤相關(guān)基因突變的患者血液的 Luterial的照片（步驟7)，圖4H是源自具有腫瘤相關(guān)基因復(fù)合突變的患者血液的Luterial 的照片（步驟8)，且圖41是源自來(lái)自具有腫瘤相關(guān)基因復(fù)合突變的患者（末期前列腺癌患 者）的血液的Luteria 1的照片(步驟9)。在圖4B至41中，圓形材料為紅細(xì)胞或白細(xì)胞。
[0130] 首先，除圓形材料外閃爍的銀色微材料為圖4B和4C中的Luterial。源自正常人的 Luterial具有比紅細(xì)胞小的尺寸，且未發(fā)現(xiàn)具有融合或變形形狀的Luterial簇。
[0131] 圖4D是源自具有染色體甲基化異常的患者血液的Luterial的照片，且在與圖4C的 Luterial(分類步驟3)比較時(shí)，尺寸增加，但尚未發(fā)現(xiàn)具有融合或變形形狀的Luterial簇。
[0132] 圖4E和4F是源自具有基因突變的患者血液的Luterial的照片，且具體地，在圖4F 的分類步驟6中，可W理解的是與圖4D的分類步驟4相比Luterial的融合進(jìn)展。在圖4E和4F 的具有基因突變的患者中，腫瘤相關(guān)基因的突變尚未發(fā)生。
[0133] 圖4G是源自其中在一些腫瘤相關(guān)基因中生成突變的患者血液的Luterial的照片 (分類步驟7)，且與圖4E和4F相比觀察到具有等于或大于紅細(xì)胞尺寸20倍的絕對(duì)大尺寸的 突變Luterial (團(tuán)狀Luterial)簇（中央銀色材料）。
[0134] 圖4H是源自其中在一些腫瘤相關(guān)基因中生成復(fù)合突變的患者血液的Luterial的 照片（分類步驟8)，且觀察到Luterial的尺寸與分類步驟7相比顯著增加，且Luterial具有 棒狀。
[0135] 圖41是源自末期癌癥患者血液的Luterial的照片（步驟9)，且觀察到與步驟8不同 的是，Luterial具有鞭毛狀。其中觀察到具備鞭毛的突變Luterial的患者分類為末期癌癥 患者，且具有鞭毛狀Luterial的癌癥患者的存活時(shí)間為1-4個(gè)月。此外，在其中釋放鞭毛 (300nmW上)如圖41中所示的情況中，存活時(shí)間在2個(gè)月內(nèi)。
[0136] 作為根據(jù)實(shí)施例6的顯微觀察結(jié)果，可確認(rèn)源自血液的Luterial可具有正常形狀、 鞭毛形狀、團(tuán)狀、棒狀和復(fù)合狀。
[0137] 正常形狀的Luterial,其為具有其中在觀察到的或拍攝到的Luterial中不存在變 形如單獨(dú)的融合、破裂等的形狀且L U t e r i a 1的長(zhǎng)直徑和短直徑間比例為1 : 1 - 3 : 1的 Luterial，在顯微觀察時(shí)指示為小點(diǎn)。正常形狀的Luterial示于圖4A-4C。在根據(jù)本發(fā)明的 用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法中，其中觀察到的或拍攝到的Luterial形狀與正常形 狀80-100 %吻合的情況可確定為正常。
[0138] 在圖41中觀察到鞭毛狀Luterial,其為具有其中觀察到或拍攝到的Luterial變形 或融合由此在其外部部分具備鞭毛的形狀的Luterial。隨癌癥的階段接近末期，鞭毛狀 Luterial的觀察比例迅速增加，且在4期癌癥中，觀察比例為99.1%，從而在大多數(shù)的4期癌 癥患者中，觀察到鞭毛狀Luterial。在根據(jù)本發(fā)明的用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法 中，其中觀察到或拍攝到的Luterial的形狀與鞭毛狀80-100%吻合的情況可確定為處于末 期腫瘤疑似狀態(tài)。診斷具有末期腫瘤的患者的生存時(shí)間為1-4個(gè)月。具體地，在鞭毛狀的情 況中，患者的長(zhǎng)期存活是不可能的。
[0139] 團(tuán)(M)狀Luterial,其為具有其中觀察到或拍攝到的Luterial為破裂或融合由此 具有從正常形狀的Luterial變化的大小和形狀的形狀的Luterial,其具有不規(guī)則的體積形 狀，其中其長(zhǎng)直徑和短直徑間的差別不大。優(yōu)選地，其長(zhǎng)直徑和短直徑間的比例可為3:1-5: 1。圖4G和5為團(tuán)狀Luterial的照片，使用暗視野顯微鏡根據(jù)實(shí)施例6拍攝，且觀察到具有不 同形狀的團(tuán)狀Luterial?？赏ㄟ^(guò)使用團(tuán)狀Luterial作為對(duì)照組比較觀察到的或拍攝到的 Luterial的形狀來(lái)確定疾病。
[0140] 棒化）狀Lut er ia 1是具有其中觀察到或拍攝到的Luter ia 1破裂的形狀的 Luterial，其變形或融合由此具有棒狀，且長(zhǎng)直徑和短直徑間的長(zhǎng)度差比團(tuán)狀Luterial大。 優(yōu)選地，長(zhǎng)直徑和短直徑間的比例可為5:1-12:1多種形狀觀察到棒狀Luterial,如圖6 中所示。棒狀Luterial可包括具有由圓形或卵圓形單鏈組成的1型棒狀的Luterial,和具有 由兩條或多條單鏈彼此偶聯(lián)組成的2型棒狀的Luterial。1型棒狀Luterial是具有棒狀的單 Luterial，且1型棒狀通過(guò)破裂和/或變形形成。2型棒狀Luterial通過(guò)兩個(gè)或多個(gè)Luterial 彼此偶聯(lián)形成由此具有棒形，且2型棒狀通過(guò)至少破裂、變形和融合中至少一種形成。
[0141] 鞭毛狀Luterial可包括于大類別中的棒狀Luterial中，但存在鞭毛突出上的區(qū) 另Ij。因此，在確定Luterial是否具有棒狀后，可能確定Luterial是否具有鞭毛狀。
[0142] 復(fù)合形可W為棒狀和團(tuán)狀的融合形。在其中彼此整合形成的Luterial的部分具有 棒狀而其另一部分具有團(tuán)狀的情況中，Luterial可稱作復(fù)合形Luterial。
[01創(chuàng)實(shí)施例7:依賴于源自多個(gè)癌癥患者的Luterial的形狀診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后
[0144] 觀察從診斷為多種癌癥的患者(表3)收集的血液或通過(guò)與實(shí)施例1中相同的方法 從所述血液獲得的Luterial。
[0145] 將血液樣品或Luterial放入緩沖溶液W涂于載玻片上并用蓋玻片覆蓋后，向其添 加用于暗視野的油滴，且使用暗視野顯微鏡(Nikon Eclipse Ni(lOOOx))和共聚焦掃描顯 微鏡觀察血液或Luterial。
[0146] 作為結(jié)果，在肺癌、乳腺癌、膜腺癌、膽總管癌、胸膜間皮瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、膽 道癌、前列腺癌或急性成淋己細(xì)胞白血病的情況中，觀察到棒化)狀Luterial,如表4所示。
[0147] 此外，在肝癌、肝的血管肉瘤、結(jié)腸直腸癌，子宮癌，胃部癌癥(gastric cancer(胃 癌（stomach cancer)))、直腸癌或急性髓性白血病的情況中，觀察到團(tuán)(Μ)狀Luterial。
[0148] 在具有轉(zhuǎn)移的癌癥患者中，觀察到其中團(tuán)狀luteiral和棒狀Luterial組合的復(fù)合 形Luterial。且在末期癌癥患者中，觀察到鞭毛狀Luterial，如圖41所示。
[0149] 在其中l(wèi)uteiral的形狀從棒狀進(jìn)展至棒-團(tuán)化-M)狀的情況中，可確定初始的癌癥 發(fā)展位點(diǎn)與棒化)-狀Luterial中的相同，但轉(zhuǎn)移是進(jìn)展的。此外，在其中Luterial的形狀從 團(tuán)狀進(jìn)展為團(tuán)-棒(M-L)狀的情況中，可確定初始癌癥發(fā)展位點(diǎn)與團(tuán)狀Luterial中的相同， 但轉(zhuǎn)移是進(jìn)展的。
[0150] [表 3] Ef ? ?
[0152]
[0153] 作為結(jié)果，在根據(jù)本發(fā)明的用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法中，當(dāng)觀察到或 拍攝到的Luterial的形狀為棒狀時(shí)，可確定患者處于肺癌、乳腺癌、膜腺癌、膽總管癌、胸膜 間皮瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、膽道癌、前列腺癌或成淋己細(xì)胞血癌發(fā)展?fàn)顟B(tài)。
[0154] 此外，在根據(jù)本發(fā)明的用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法中，當(dāng)觀察到或拍攝 到的Luterial的形狀為團(tuán)狀時(shí)，可確定患者處于肝癌、肝的血管肉瘤、結(jié)腸直腸癌，子宮癌， 胃部癌癥（胃癌）、直腸癌、腎癌或髓性血癌發(fā)展?fàn)顟B(tài)。
[0155]此外，在根據(jù)本發(fā)明的用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法中，當(dāng)Luterial的形 狀為復(fù)合形狀時(shí)，可確定患者處于嚴(yán)重的血癌或轉(zhuǎn)移疑似狀態(tài)，且當(dāng)檢測(cè)到鞭毛狀 Luterial時(shí)，可確定患者處于末期癌癥疑似狀態(tài)。
[0巧引實(shí)施例8:依賴于Luterial的納米追蹤速度診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后
[0157] 從1期、2期、3期和4期癌癥患者(每階段15個(gè)患者)通過(guò)與實(shí)施例1中相同的方法獲 得Luterial。將Luterial放入緩沖溶液中并用詹納斯綠B染色，然后使用光學(xué)顯微鏡觀察。
[0158] 作為運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)，Luterial的納米追蹤速度使用具有200nm大小的Luterial和納 米追蹤（nano-hacking) (3i Co;rp ,US)測(cè)量。詳細(xì)地說(shuō)，使用亮視野顯微鏡觀察Luterial 后，在Luterial的中屯、設(shè)置追蹤并操作納米追蹤時(shí)，顯示實(shí)時(shí)運(yùn)動(dòng)軌跡連同Luterial的運(yùn) 動(dòng)，由此計(jì)算每秒的速度（圖31)。
[0159] [表 4]
[0160]
[0161]根據(jù)本文實(shí)施例的源自癌癥患者的Luterial的納米追蹤速度指示Luterial的運(yùn) 動(dòng)。在正常人中，納米追蹤速度為12μπι/秒W上，但觀察到隨癌癥的階段從對(duì)應(yīng)早期的1期增 加至對(duì)應(yīng)末期的4期，運(yùn)動(dòng)性減少，從而在4期癌癥中，幾乎無(wú)運(yùn)動(dòng)。因此，在根據(jù)本發(fā)明的用 于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法中，其中觀察到或拍攝到的Luterial的納米追蹤速度為 8.0-11μπι/秒的情況中，可確定患者為1期癌癥患者，在其中Luterial的納米追蹤速度為 2.5-8.0皿/秒的情況中，可確定患者為2期癌癥患者，在其中Luterial的納米追蹤速度為 0.5-2.5皿/秒的情況中，可確定患者為3期癌癥患者，和在其中Luterial的納米追蹤速度為 0-0.5皿/秒的情況中，可確定患者為4期癌癥患者。
[01創(chuàng)實(shí)施例9:使用電子顯微鏡依賴于Luterial的形狀診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后
[0163] 在使用電子顯微鏡觀察Luterial的情況中，可顯示單一形狀、融合形狀、多重融合 形狀和其中膜破裂的融合形狀，且可能基于觀察到的形狀診斷疾病并預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后。
[0164] 單一形狀是在單一 Luterial中觀察到的形狀，融合形狀是當(dāng)二至四個(gè)Luterial簇 融合時(shí)觀察到的形狀，多重融合形狀是當(dāng)融合的Luterial簇再次反復(fù)融合時(shí)觀察到的形 狀，且其中膜破裂的融合形狀是當(dāng)融合的Luterial的膜破裂且其內(nèi)部材料排出時(shí)觀察到的 形狀。
[0165] 從來(lái)自正常人至末期癌癥患者的多個(gè)受試者(30人)的血液通過(guò)與實(shí)施例1中相同 的方法獲得Luterial。獲得的Luterial固定在載玻片上，且使用電子顯微鏡觀察或拍攝 Luterial的形狀。
[0166] 作為結(jié)果，在正常人中，觀察到具有單一形狀的Luterial。在患有除癌癥外的疾病 的患者中，觀察到具有融合形狀的Luterial，且因此，如果Luterial具有融合形狀，可判定 患者疑似患有疾病。
[0167] 在多個(gè)其中觀察到具有多重融合形狀的Luterial的患者中發(fā)現(xiàn)了腫瘤。因此，可 判定具有多重融合形狀的Luterial是腫瘤疑似狀態(tài)的標(biāo)記物。
[0168] 圖32A-32C是展示具有其中膜破裂的融合形狀的Luterial的照片，隨后使用電子 顯微鏡拍攝。形成膜的Luterial簇（圖32A)逐漸增殖（圖32B)，使得最終膜破裂且其中變形 的顆粒排出（圖32C)。在多個(gè)其中Luterial具有其中膜破裂的融合形狀的患者中發(fā)現(xiàn)了嚴(yán) 重的癌癥。因此，可判定具有其中膜破裂的融合形狀的Luterial是嚴(yán)重癌癥疑似狀態(tài)的標(biāo) 記物。
[0169] 因此，在根據(jù)本發(fā)明的用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法中，在比較存在于血 液中且在電子顯微鏡上確認(rèn)其雙膜結(jié)構(gòu)和崎結(jié)構(gòu)的Luterial的形狀時(shí)，Luterial的形狀與 單一正常形狀80-100%吻合的情況可確定為正常，形狀與融合形狀80-100%吻合的情況可 確定處于疾病疑似狀態(tài)，形狀與多重融合形狀80-100%吻合的情況可確定處于腫瘤疑似狀 態(tài)，和形狀與其中膜破裂的融合形狀80-100%吻合的情況可確定處于嚴(yán)重腫瘤疑似狀態(tài)。
[0170] 因此，在根據(jù)本發(fā)明的用于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的方法中，Luterial用作用 于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的標(biāo)記物，從而Luterial可有效用于診斷特別是癌癥患者，確 定治療方法的效果存在或不存在，比較治療之前和之后的效果和判定接受治療的患者是否 可存活長(zhǎng)的時(shí)間段。
[0171] 盡管本發(fā)明已基于其具體特征詳細(xì)描述，但對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是運(yùn) 些特定的技術(shù)僅為優(yōu)選的實(shí)施方案且因此本發(fā)明的范圍不限于所述實(shí)施方案。因此，本發(fā) 明的實(shí)質(zhì)范圍通過(guò)所附權(quán)利要求及其等同物限定。
[0172] 工業(yè)實(shí)用性
[0173] 根據(jù)本發(fā)明，Luterial其為已從患者排泄的體液中存在的微材料，可將其用作用 于診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的標(biāo)記物，從而Luterial可有效用于診斷特別是癌癥患者，確 定操作方法和治療方法的效果存在或不存在，比較治療之前和之后的效果和判定接受治療 的患者是否可存活長(zhǎng)的時(shí)間段。具體地，無(wú)論癌癥的類型，即使癌癥組織的大小為5mmW下， 可能判定癌癥的當(dāng)前狀態(tài)(present state)，癌癥的復(fù)發(fā)概率和患者長(zhǎng)期存活的概率。
[0174] 此外，由于疾病可自動(dòng)診斷且疾病的預(yù)后可僅通過(guò)顯微觀察而不使用單獨(dú)的基因 分析和昂貴的設(shè)備預(yù)測(cè)，活檢或昂貴的圖像診斷并不需要，從而根據(jù)本發(fā)明的方法具有經(jīng) 濟(jì)優(yōu)勢(shì)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種為疾病的診斷和預(yù)后提供信息的方法，其包括： a) 通過(guò)顯微術(shù)測(cè)量來(lái)自如下的至少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：患者體液中存在的Luterial的數(shù)目、大 小(直徑或面積）、形狀、涂層(例如筋膜、涂層、薄膜等)形成和納米追蹤速度;并 b) 將從步驟a)測(cè)量或確認(rèn)的結(jié)果與正常人的Luterial、正常Luterial或紅細(xì)胞的那些 進(jìn)行比較。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述體液是血液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟a)為來(lái)自使用一種或多種選自下組的熒光染 料對(duì)Luterial陽(yáng)性染色的測(cè)量或確認(rèn)：羅丹明123 (Rhodamine 123)、Mitotracker(線粒體焚 光探針），卩丫啶橙(Acridine Orange)、DAPI和詹納斯綠B( Janus Green B)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述Luterial通過(guò)過(guò)程獲得，所述過(guò)程包括:從血液分 離血清;從分離的血清分離不穿過(guò)具有1 〇〇nm-2mm直徑范圍的多種孔徑的過(guò)濾器的沉淀;和 洗滌分離的沉淀。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述步驟b)包括如果Luterial的觀察到的長(zhǎng) 直徑為紅細(xì)胞的8-30倍大；或Luterial觀察到的面積為紅細(xì)胞的8-30倍大，則確定患者疑 似患有癌癥。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述步驟b)包括如果Luterial的觀察到的數(shù) 目少于正常人中Luterial數(shù)目的20%，且如果Luterial的觀察到的長(zhǎng)直徑為20μπι或更長(zhǎng)， 則確定患者疑似患有癌癥。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述步驟b)包括如果外涂層形成于所述 Luterial周?chē)?，則確定患者疑似患有癌癥。8. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述Luterial的形狀選自下組：正常狀、其中所述 Luterial具有在其外部形成的鞭毛樣結(jié)構(gòu)的鞭毛狀、團(tuán)裝、棒狀和復(fù)合形狀。9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述正常狀Luterial具有1:1~3:1的長(zhǎng)直徑和短直徑 間比例，所述團(tuán)狀Luterial具有3:1~5:1的長(zhǎng)直徑和短直徑間比例，所述棒狀Luterial具 有5:1~12:1的長(zhǎng)直徑和短直徑間比例，所述復(fù)合形狀的Luterial具有棒狀、團(tuán)狀的融合形 式，或棒狀和團(tuán)狀的組合。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中所述步驟b)包括（i)如果所述Luterial是棒狀，則 確定患者疑似患有肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膽總管癌、胸膜間皮瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、膽道 癌、前列腺癌或成淋巴細(xì)胞白血病，（i i)如果所述Luteria 1是團(tuán)狀，則確定患者疑似患有肝 癌、肝的血管肉瘤、結(jié)腸直腸癌，子宮癌，胃部癌癥（gastric cancer(胃癌（stomach cancer)))、腎癌、直腸癌或髓細(xì)胞性白血病，（iii)如果所述Luterial是復(fù)雜形狀，則確定 患者疑似患有嚴(yán)重的白血病或?yàn)檗D(zhuǎn)移疑似狀態(tài)，和（iv)如果所述Luterial為鞭毛狀，則確 定患者疑似患有末期腫瘤。11. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述步驟b)包括如果所述Luterial的納米追 蹤速度為8.0-1 Ιμπι/秒，則確定患者疑似處于癌癥階段1， 如果所述Luterial的納米追蹤速度為2.5~8. Ομπι/秒，則確定患者疑似處于癌癥階段 2， 如果所述Luterial的納米追蹤速度為0.5~2.5μηι/秒，則確定患者疑似處于癌癥階段 3， 如果所述Luter ial的納米追蹤速度為少于0.5μπι/秒，則確定患者疑似處于癌癥階段4。12. -種為診斷疾病和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后提供信息的方法，其包括： a) 使用電子顯微術(shù)鑒定存在于患者體液中的Luterial的形狀； b) 根據(jù)單形狀、融合形狀、多重融合形狀和其中膜破裂的融合形狀類別中的形狀對(duì) Luterial進(jìn)行分類;和 c) 基于來(lái)自步驟b)的分類確定疾病的階段。13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述體液是血液。14. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述步驟a)為來(lái)自使用一種或多種選自下組的熒光 染料對(duì)Luterial陽(yáng)性染色的測(cè)量或確認(rèn)：羅丹明123、Mitotracker、吖啶橙、DAPI和詹納斯 綠B，和使用電子顯微術(shù)確認(rèn)來(lái)自Luterial的雙膜樣結(jié)構(gòu)和嵴樣結(jié)構(gòu)的存在。15. 根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的方法，其中所述步驟c)包括如果觀察到的Luterial與 單形狀Luterial 80-100%匹配，則確定正常， 如果觀察到的Luterial與融合形狀的Luterial 80-100 %匹配，則確定患者疑似患有 疾病， 如果觀察到Luterial與多重融合形狀的Luterial 80-100 %匹配，則確定患者疑似具 有腫瘤，或 如果觀察到Luterial與其中膜破裂的融合形狀的Luterial 80-100%匹配，則確定患 者疑似具有嚴(yán)重腫瘤。
【文檔編號(hào)】G01N33/58GK106068455SQ201480050194
【公開(kāi)日】2016年11月2日
【申請(qǐng)日】2014年1月14日 公開(kāi)號(hào)201480050194.4, CN 106068455 A, CN 106068455A, CN 201480050194, CN-A-106068455, CN106068455 A, CN106068455A, CN201480050194, CN201480050194.4, PCT/2014/393, PCT/KR/14/000393, PCT/KR/14/00393, PCT/KR/2014/000393, PCT/KR/2014/00393, PCT/KR14/000393, PCT/KR14/00393, PCT/KR14000393, PCT/KR1400393, PCT/KR2014/000393, PCT/KR2014/00393, PCT/KR2014000393, PCT/KR201400393
【發(fā)明人】權(quán)寧娥, 崔元哲, 崔碩訓(xùn), 崔彰訓(xùn), 權(quán)圣弼, 全晛廷
【申請(qǐng)人】權(quán)寧娥, 崔元哲, 崔碩訓(xùn), 崔彰訓(xùn)