基于熒光和比色方法檢測(cè)癌細(xì)胞中H₂O₂紙芯片的制備
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于熒光和比色方法檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)H2O2紙芯片的制備方法。利用Adobe illustrator CS4軟件設(shè)計(jì)紙芯片的疏水蠟打印圖案；利用蠟打印機(jī)打印紙芯片；利用激光切割機(jī)制備孔洞；將合成的熒光探針修飾在熒光工作區(qū)域，在捕獲癌細(xì)胞后在刺激物作用下用于熒光檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量；在比色區(qū)域滴加顯色劑溶液后將紙芯片折疊，從而進(jìn)一步通過(guò)比色實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞內(nèi)H2O2的測(cè)定。
【專利說(shuō)明】
基于熒光和比色方法檢測(cè)癌細(xì)胞中H2O2紙芯片的制備
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及納米材料技術(shù)、紙芯片技術(shù)、過(guò)氧化氫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)是一種基于熒光和比色方法檢測(cè)癌細(xì)胞中H2O2紙芯片的制備。
【背景技術(shù)】
[0002]活性氧作為信號(hào)分子對(duì)生物的影響一直受到人們的廣泛關(guān)注。H2O2因其性質(zhì)的相對(duì)穩(wěn)定、反應(yīng)的選擇性和自身的易擴(kuò)散性使其作為信號(hào)分子的研究相對(duì)容易。H2O2在調(diào)節(jié)DNA損傷、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞凋亡生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。適當(dāng)濃度的H2O2作為信號(hào)分子對(duì)細(xì)胞正常的生命進(jìn)程起到積極的作用，但是過(guò)高濃度的H2O2將會(huì)誘發(fā)細(xì)胞的老化和癌變，因此實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)H2O2的高靈敏檢測(cè)具有非常重要的意義。
[0003]電化學(xué)、光致電、化學(xué)發(fā)光以及毛細(xì)管電泳等是近年來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2O2的主要方法。利用熒光探針和比色技術(shù)結(jié)合檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的H2O2為更好的理解H2O2的生理作用開(kāi)辟了一種新的途徑。相比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，該方法操作更加簡(jiǎn)單、快速、靈敏，所需儀器成本低，裝置簡(jiǎn)單、便攜。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比，半導(dǎo)體量子點(diǎn)具有寬的激發(fā)波長(zhǎng)范圍以及窄的發(fā)射波長(zhǎng)范圍，發(fā)射峰窄而對(duì)稱，焚光強(qiáng)度以及穩(wěn)定性很好，壽命長(zhǎng)。石墨稀量子點(diǎn)作為一種新興的碳基材料因其好的生物相容性和穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度引起人們的廣泛關(guān)注。比色方法簡(jiǎn)便、快速、可視化，結(jié)合熒光檢測(cè)的高靈敏度可大大提高檢測(cè)的可靠性。
[0004]目前，紙基檢測(cè)設(shè)備以其低成本、可折疊、便于攜帶和處理等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于各種分析檢測(cè)中，比如金屬離子檢測(cè)、蛋白質(zhì)檢測(cè)、DNA檢測(cè)、多糖檢測(cè)以及一些生物小分子的檢測(cè)等。表面的粗糙和內(nèi)部的孔洞使紙具有很大的比表面積，可以更多的負(fù)載基底材料，表面帶有的相關(guān)基團(tuán)可以起到很好的連接作用。因此，基于熒光和比色方法檢測(cè)癌細(xì)胞中H2O2的紙芯片的構(gòu)建具有很重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是基于熒光和比色方法，結(jié)合石墨烯量子點(diǎn)熒光探針構(gòu)建用于高靈敏度檢測(cè)細(xì)胞中H2O2的紙芯片。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
(1)在計(jì)算機(jī)上利用Adobeillustrator CS4軟件設(shè)計(jì)紙芯片的打印圖案；
(2)將步驟(I)中設(shè)計(jì)的打印圖案通過(guò)蠟打印機(jī)打印在色譜紙上，隨后將打印過(guò)的A4色譜紙放置到平板加熱器或烘箱中，在125 °C下加熱3 min，使蠟融化并浸透整個(gè)紙的厚度，形成疏水墻；
(3)將步驟(2)中印有蠟打印圖案的紙芯片通過(guò)激光切割機(jī)切割，制備孔洞；
(4)對(duì)步驟(3)中紙芯片的熒光工作區(qū)域功能化:
取50 yL 0.25 mg mL-Ι氧化石墨稀于室溫下滴加到焚光工作區(qū)反應(yīng)30 min,用磷酸鹽緩沖溶液洗去未連接上的石墨烯，隨后滴加60yL 2 mmol mL_l伴刀豆球蛋白A反應(yīng)20min后用磷酸鹽緩沖溶液清洗;然后滴加80yL合成好的熒光探針?lè)磻?yīng)30 min后用磷酸鹽緩沖溶液清洗，隨后后用10.0 PL 1%的牛血清白蛋白掩蔽活性位點(diǎn)，然后后將不同濃度的癌細(xì)胞置于熒光工作區(qū)域孵化I h后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，然后將功能化的熒光工作區(qū)紙芯片放入熒光設(shè)備中，在360 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光測(cè)定，繪制熒光強(qiáng)度與細(xì)胞濃度關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)H2O2精確檢測(cè)；
(5)對(duì)步驟(3)中紙芯片的比色工作區(qū)域功能化:在比色層的工作區(qū)域分別滴加滴加顯色劑和pH為4?6的緩沖溶液；
(6)將(3)切割后所得的印有蠟打印圖案α的紙芯片和蠟打印圖案β的紙芯片進(jìn)行對(duì)折，反應(yīng)3 min后進(jìn)行比色測(cè)定繪制灰度與癌細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量。
[0007]本發(fā)明所述的紙芯片用Adobe illustrator CS4軟件來(lái)設(shè)計(jì)紙芯片的疏水錯(cuò)打印圖案和親水工作區(qū)域圖案，所用紙芯片的紙為一號(hào)色譜紙。
[0008]本發(fā)明所述的紙芯片由邊長(zhǎng)為20 mm的α紙芯片和β紙芯片組成，α紙芯片和β紙芯片之間是寬度為Imm的線折疊區(qū)，如附圖2。
[0009]本發(fā)明在步驟(4)中所述的熒光探針的制備步驟為:
將0.25 g炭黑溶于50 mL 6 M硝酸中，超聲I h后在130 °C條件下回流24 h，將上述溶液降到室溫后離心并干燥，然后將產(chǎn)物溶于二次水后透析三天，得到石墨烯量子點(diǎn)；將100μL 20μΜ的修飾有巰基的單鏈DNA和2 mL合成好的石墨烯量子在點(diǎn)室溫下反應(yīng)三個(gè)小時(shí)，石墨烯量子點(diǎn)通過(guò)J1-3I作用力連接到單鏈DNA上，形成熒光探針。
[0010]本發(fā)明在步驟(5)中所述顯色劑為3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺。
[0011]本發(fā)明的有益效果
(I)熒光探針的合成簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，高效。
[0012 ] (2 )熒光檢測(cè)和比色檢測(cè)方法的結(jié)合大大提高了檢測(cè)的可靠性。
[0013](3)本發(fā)明構(gòu)建的用于檢測(cè)H2O2紙芯片成本低廉，操作簡(jiǎn)單，易于處理，靈敏度高。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1:紙芯片的蠟打印圖案；
圖2:紙芯片的尺寸。
【具體實(shí)施方式】
[0015]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容。
[0016]實(shí)施例1
基于熒光和比色方法用于檢測(cè)癌細(xì)胞中H2O2紙芯片的應(yīng)用:
(1)在計(jì)算機(jī)上利用Adobeillustrator CS4軟件設(shè)計(jì)紙芯片的打印圖案；
(2)將步驟(I)中設(shè)計(jì)的打印圖案通過(guò)蠟打印機(jī)打印在色譜紙上，隨后將打印過(guò)的A4色譜紙放置到平板加熱器或烘箱中，在125 °C下加熱3 min，使蠟融化并浸透整個(gè)紙的厚度，形成疏水墻；
(3)將步驟(2)中印有蠟打印圖案的紙芯片通過(guò)激光切割機(jī)切割，制備孔洞；
(4)對(duì)步驟(3)中紙芯片的熒光工作區(qū)域功能化:
取50 yL 0.25 mg mL—1氧化石墨稀于室溫下滴加到焚光工作區(qū)反應(yīng)30 min,用磷酸鹽緩沖溶液洗去未連接上的石墨稀，隨后滴加60yL 2 mmol mL—1伴刀豆球蛋白A反應(yīng)20 min后用磷酸鹽緩沖溶液清洗;將0.25 g炭黑溶于50 mL 6 M硝酸中，超聲I h后在130 °C條件下回流24 h，將上述溶液降到室溫后離心并干燥，然后將產(chǎn)物溶于二次水后透析三天，得到石墨烯量子點(diǎn)；將10yL 20μΜ的修飾有巰基的單鏈DNA和2 mL合成好的石墨烯量子在點(diǎn)室溫下反應(yīng)三個(gè)小時(shí)，石墨烯量子點(diǎn)通過(guò)JT-JT作用力連接到單鏈DNA上，形成熒光探針;然后滴加80yL合成好的熒光探針，隨后后用10.0 uL 1%的牛血清白蛋白掩蔽活性位點(diǎn)，隨后將不同濃度的癌細(xì)胞置于熒光區(qū)域孵化I h后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗未成功連接的細(xì)胞，然后將功能化的熒光工作區(qū)紙芯片放入熒光設(shè)備中，在360 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光測(cè)定，繪制熒光強(qiáng)度與細(xì)胞濃度關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)H2O2精確檢測(cè)；
(5)對(duì)步驟(3)中紙芯片的比色工作區(qū)域功能化:在比色層的工作區(qū)域分別滴加滴加50 uL 3，3 ’，5，5 ’ -四甲基聯(lián)苯胺和pH為4?6的緩沖溶液；
(6)將(3)切割后所得的印有蠟打印圖案α的紙芯片和蠟打印圖案β的紙芯片進(jìn)行對(duì)折，反應(yīng)3 min后進(jìn)行比色測(cè)定繪制灰度與癌細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.基于熒光和比色方法檢測(cè)癌細(xì)胞中H2O2紙芯片的制備，其特征是包括以下步驟: 1.1在計(jì)算機(jī)上利用Adobe illustrator CS4軟件設(shè)計(jì)紙芯片的打印圖案； 1.2將步驟1.1中設(shè)計(jì)的打印圖案通過(guò)蠟打印機(jī)打印在色譜紙上，隨后將打印過(guò)的A4色譜紙放置到平板加熱器或烘箱中，在125 °C下加熱3 min，使蠟融化并浸透整個(gè)紙的厚度，形成疏水墻； I.3將步驟1.2中印有蠟打印圖案的紙芯片通過(guò)激光切割機(jī)切割，制備孔洞； 1.4對(duì)步驟1.3中紙芯片的熒光工作區(qū)域進(jìn)行功能化: 取50 yL 0.25 mg mL—1的氧化石墨稀于室溫下滴加到焚光工作區(qū)域反應(yīng)30 min,用磷酸鹽緩沖溶液洗去未連接上的石墨烯，隨后滴加60yL 2 mmol mL—1的伴刀豆球蛋白A反應(yīng)20min后用磷酸鹽緩沖溶液清洗;然后滴加80yL合成好的熒光探針?lè)磻?yīng)30 min后用磷酸鹽緩沖溶液清洗，隨后后用10.0 uL 1%的牛血清白蛋白掩蔽活性位點(diǎn)，隨后將不同濃度的癌細(xì)胞置于熒光工作區(qū)域孵化I h后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，然后將功能化的熒光工作區(qū)域紙芯片放入熒光設(shè)備中，在360 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光測(cè)定，繪制熒光強(qiáng)度與細(xì)胞濃度關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)H2O2的精確檢測(cè)； 1.5對(duì)步驟1.3中紙芯片的比色工作區(qū)域功能化:在比色層的工作區(qū)域分別滴加滴加顯色劑和pH為4?6的緩沖溶液； 1.6將1.3切割后所得的印有蠟打印圖案α的紙芯片和蠟打印圖案β的紙芯片進(jìn)行對(duì)折，反應(yīng)3 min后進(jìn)行比色測(cè)定繪制灰度與癌細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述基于熒光和比色方法檢測(cè)癌細(xì)胞中H2O2紙芯片的制備，其特征在于，用Adobe illustrator CS4軟件來(lái)設(shè)計(jì)紙芯片的疏水錯(cuò)打印圖案和親水工作區(qū)域圖案，所用紙芯片的紙為一號(hào)色譜紙。3.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述基于熒光和比色方法檢測(cè)癌細(xì)胞中H2O2紙芯片的制備，其特征在于，本發(fā)明所述的紙芯片由邊長(zhǎng)為20 mm的α紙芯片和紙芯片組成，α紙芯片和紙芯片之間是寬度為Imm的線折疊區(qū)。4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述基于熒光和比色方法檢測(cè)癌細(xì)胞中H2O2紙芯片的制備，其特征在于，在步驟1.4中所述熒光探針的制備步驟為: 將0.25 g炭黑溶于50 mL 6 M硝酸中，超聲I h后在130 °C條件下回流24 h，將上述溶液降到室溫后離心并干燥，然后將產(chǎn)物溶于二次水后透析三天，得到石墨烯量子點(diǎn)；將100μL 20μΜ的修飾有巰基的單鏈DNA和2 mL合成好的石墨烯量子在點(diǎn)室溫下反應(yīng)三個(gè)小時(shí)，石墨烯量子點(diǎn)通過(guò)J1-3I作用力連接到單鏈DNA上，形成熒光探針。5.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述基于熒光和比色方法檢測(cè)癌細(xì)胞中H2O2紙芯片的制備，其特征在于，在步驟1.5中所述顯色劑為3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK106092999SQ201610726361
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月26日
【發(fā)明人】蘭飛飛, 葛慎光, 梁琳琳, 王賀, 鑒燕楠, 李麗, 楊紅梅, 于京華, 顏梅
【申請(qǐng)人】濟(jì)南大學(xué)