用于檢測(cè)α?酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器、制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供用于檢測(cè)α?酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器、制備方法及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，屬于電化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。用于檢測(cè)α?酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器，該電化學(xué)生物傳感器為三電極體系傳感器，工作電極是表面修飾有谷氨酸脫氫酶膜的玻碳電極。本發(fā)明還提供所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括在玻碳電極表面依次固定納米金?石墨烯復(fù)合膜和谷氨酸脫氫酶膜制備工作電極的步驟。采用該傳感器對(duì)α?酮戊二酸進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確性高、檢測(cè)時(shí)間短、成本低。
【專利說(shuō)明】
用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器、制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于電化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器、制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]α-酮戊二酸是腫瘤早期檢測(cè)、微生物工業(yè)發(fā)酵監(jiān)控等過(guò)程中一種重要的代謝標(biāo)志物，是三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間產(chǎn)物之一，是連接細(xì)胞內(nèi)碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，也是合成多種氨基酸和蛋白質(zhì)的重要的前體物質(zhì)。目前檢測(cè)α_酮戊二酸的方法主要有比色法、高效液相色譜法、熒光探針等，但是這些方法均存在誤差大、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)成本偏高等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明針對(duì)已有α-酮戊二酸檢測(cè)的缺點(diǎn)，提供用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器，采用該傳感器對(duì)α-酮戊二酸進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確性高、檢測(cè)時(shí)間短、成本低。
[0004]本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0005]—種用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器，該電化學(xué)生物傳感器為三電極體系傳感器，工作電極是表面修飾有谷氨酸脫氫酶膜的玻碳電極。
[0006]在本發(fā)明中，玻碳電極表面先固定納米金-石墨烯復(fù)合膜，然后再固定谷氨酸脫氫酶膜。
[0007]優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述納米金-石墨稀復(fù)合膜是通過(guò)一步電沉積方法固定在玻碳電極表面的;所述谷氨酸脫氫酶膜是通過(guò)滴涂法固定在玻碳電極上的。
[0008]優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述一步電沉積方法為循環(huán)伏安法。
[0009]優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述谷氨酸脫氫酶為來(lái)源于牛肝的L-谷氨酸脫氫酶。
[0010]本發(fā)明還提供所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法包括在玻碳電極表面依次固定納米金-石墨烯復(fù)合膜和谷氨酸脫氫酶膜制備工作電極的步驟。
優(yōu)選的技術(shù)方案中，將玻碳電極作為工作電極、鉑絲電極作為對(duì)電極、甘汞電極作為參比電極，以含有氧化石墨烯和氯金酸的溶液作為電解液，采用循環(huán)伏安法在玻碳電極表面沉積納米金-石墨烯復(fù)合膜。
[0011 ]優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述循環(huán)伏安法中掃描電位區(qū)間為-1.4?0.6伏，掃描速度為18?22毫伏/秒，所述電解液中含有0.5?2mg/ml氧化石墨烯和150?250μΜ氯金酸，沉積圈數(shù)為6?10圈。
[0012]優(yōu)選的技術(shù)方案中，在固定有納米金-石墨烯復(fù)合膜的玻碳電極表面滴涂谷氨酸脫氫酶液后固定，所述谷氨酸脫氫酶液的濃度為110 kU/L?200 1^]/1，體積為優(yōu)選為5?15yL，采用戊二醛固定谷氨酸脫氫酶。
[0013]本發(fā)明還提供所述電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè)α-酮戊二酸方面的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明首創(chuàng)將納米金-石墨烯復(fù)合膜和谷氨酸脫氫酶膜修飾在玻碳電極上得到了工作電極，采用傳統(tǒng)的三電極體系，對(duì)α-酮戊二酸進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)原理如下:在順+和NADH存在的情況下，復(fù)合電極上谷氨酸脫氫酶催化α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化成谷氨酸，同時(shí)消耗NADH生成NAD+，隨著NADH濃度的變化，電流值也隨之變化，即α-酮戊二酸的加入導(dǎo)致電流值的變化，通過(guò)計(jì)時(shí)電流法，得到α-酮戊二酸與電流值的線性關(guān)系(如圖1所示)，具體檢測(cè)時(shí)，根據(jù)具體的電流值就能夠計(jì)算出α-酮戊二酸的濃度。本發(fā)明生物傳感器，顯著降低NADH氧化電位(如圖3)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)α-酮戊二酸高準(zhǔn)確性、高選擇性、高靈敏度、高線性檢測(cè)范圍、低檢測(cè)限的檢測(cè)，該檢測(cè)方法高效、簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，僅需幾分鐘就可以完成。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是本發(fā)明傳感器檢測(cè)原理示意圖。
[0016]圖2是納米金-石墨烯復(fù)合膜電沉積到電極表面的循環(huán)伏安圖，其中(vs.SCE)表示電位相對(duì)于甘汞參比電極，下同。
[0017]圖3是本發(fā)明工作電極與普通玻碳電極對(duì)NADH的循環(huán)伏安圖。
[0018]圖4是傳感器對(duì)NADH檢測(cè)的電流-時(shí)間響應(yīng)圖。
[0019]圖5是傳感器對(duì)NADH檢測(cè)的線性擬合圖，其中[NADH]表示NADH的濃度。
[0020]圖6是傳感器對(duì)α-酮戊二酸檢測(cè)的電流-時(shí)間響應(yīng)圖。
[0021]圖7是傳感器對(duì)α-酮戊二酸檢測(cè)線性擬合圖，其中[α-KG]表示α-酮戊二酸的濃度。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明:本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作步驟，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0023]實(shí)施例1工作電極的構(gòu)建
一、氧化石墨烯和氯金酸混合電解液的制備
(I)氧化石墨烯分散液:取10 mg氧化石墨烯粉末(購(gòu)自蘇州恒球石墨烯科技有限公司)，加入10 mL去離子水中，用超聲破碎機(jī)破碎20分鐘，配制I mg/mL氧化石墨稀分散液。
[0024](2)氯金酸溶液:取412 mg氯金酸，溶于10 mL去離子水中，配制0.01 M氯金酸溶液。
[0025](3)氧化石墨烯和氯金酸混合電解液:取(2)配制的氯金酸溶液200yL溶于(I)配制的氧化石墨烯分散液中，得到混合電解液。
[0026]二、固定納米金-石墨稀復(fù)合膜
用粒徑為0.3 Mi的氧化鋁粉打磨玻碳電極，直到電極表面成鏡面，然后用去離子水沖洗干凈，再在去離子水中超聲清洗2分鐘，再將玻碳電極浸泡在乙醇溶液中超聲清洗2分鐘，然后在0.5 M硫酸中采用循環(huán)伏安法掃描，掃描20圈取出，在含有0.1 M氯化鉀的5 mM鐵氰化鉀溶液中用循環(huán)伏安法掃描，如果獲得的循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定，用蒸餾水清洗干凈，氮?dú)獯蹈?，得到預(yù)處理好的玻碳電機(jī)。
[0027]按照三電極體系，將預(yù)處理好的玻碳電極(工作電極)、鉑絲電極(對(duì)電極)和甘汞電極(參比電極)插入本實(shí)施例標(biāo)題一制備的氧化石墨烯和氯金酸混合電解液中，連接好電極線，通氮?dú)?5分鐘，然后采用循環(huán)伏安法在玻碳電極表面沉積納米金-石墨烯復(fù)合膜(循環(huán)伏安圖如圖2所不)，掃描6圈，掃描電位區(qū)間為-1.4伏?+0.6伏，掃描速度為20毫伏/秒，得到固定有納米金-石墨稀復(fù)合膜的玻碳電極。
[0028]步驟三、固定谷氨酸脫氫酶膜
(I)谷氨酸脫氫酶液:取6.5 mgL-谷氨酸脫氫酶粉末(購(gòu)自Sigma，來(lái)源于牛肝)，溶于ImL濃度為0.1M磷酸緩沖溶液(pH7.2)中，配制110 kU/L的酶液。
[0029](2)戊二醛溶液:量取400 yL戊二醛，溶于9.6 mL去離子水中，配制成4%(體積百分?jǐn)?shù))戊二醛溶液。
[0030](3)移取SyL谷氨酸脫氫酶液，滴涂在固定有納米金-石墨烯復(fù)合膜的玻碳電極表面，氮?dú)獯蹈?，然后將電極插入4%戊二醛溶液中，3秒后取出，即得到工作電極。
[0031]實(shí)施例2用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器
用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器，是經(jīng)典的三電極體系傳感器，包括實(shí)施例1制備的工作電極、對(duì)電極和參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，甘汞電極作為參比電極。
[0032]實(shí)施例3用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器對(duì)NADH的檢測(cè)
將實(shí)施例2中傳感器的三種電極均置于pH7.2、0.1M的磷酸緩沖溶液中，采用計(jì)時(shí)電流法，施加電位為0.3伏，向磷酸緩沖液中滴加4.5 mM的NADH溶液，每滴之間間隔10s，得到電流-時(shí)間響應(yīng)曲線，如圖4。取NADH濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的電流為縱坐標(biāo)，可得到散點(diǎn)圖5，做線性擬合后分析可知，實(shí)施例2中傳感器對(duì)NADH檢測(cè)的線性范圍為31.9μΜ -1.09mM，檢測(cè)下線為2μΜ，說(shuō)明該傳感器靈敏度非常高。
[0033]另外，比較實(shí)施例1中制備的工作電極(本發(fā)明工作電極)與普通玻碳電極對(duì)NADH的循環(huán)伏安圖，如圖3所示?？梢钥吹奖景l(fā)明工作電極顯著降低了NADH氧化電位，將有利于減少溶液中其他物質(zhì)對(duì)α-酮戊二酸檢測(cè)的干擾。
[0034]實(shí)施例4采用傳感器檢測(cè)α-酮戊二酸
以含I mM氯化銨的0.1 M磷酸緩沖溶液(ρΗ7.2)為電解液。將實(shí)施例2中生物傳感器的三種電極均置于電解液中，采用計(jì)時(shí)電流法，施加電位為0.3伏，在電解液中先滴加220 yL濃度為33.7 mM的NADH溶液，然后滴加2.5 mM的α-酮戊二酸溶液，每滴間隔30秒，得到電流-時(shí)間響應(yīng)曲線，如圖6。取α-酮戊二酸濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的電流為縱坐標(biāo)，可得到散點(diǎn)圖7，做線性擬合后分析可知，實(shí)施例2中傳感器對(duì)α-酮戊二酸檢測(cè)的線性范圍為66.7μΜ -494.5μΜ，檢測(cè)下線為10 PM，說(shuō)明該傳感器靈敏度非常高。
[0035]實(shí)施例5傳感器檢測(cè)α-酮戊二酸的準(zhǔn)確性
以含I mM氯化銨的0.1 M磷酸緩沖溶液(ρΗ7.2)為電解液。將實(shí)施例2中生物傳感器的三種電極均置于電解液中，采用計(jì)時(shí)電流法，施加電位為0.3伏，在電解液中先滴加220 yL濃度為33.7 mM的NADH溶液，然后滴加I ml濃度為2.5 mM的α-酮戊二酸溶液，檢測(cè)電流值，根據(jù)圖7中的線性方程算出所測(cè)α-酮戊二酸溶液的濃度，算出回收率為100.7%(回收率=測(cè)量值/實(shí)際值)，說(shuō)明實(shí)施例2中生物傳感器檢測(cè)α-酮戊二酸具有較高的準(zhǔn)確性。
[0036]實(shí)施例6傳感器的穩(wěn)定性
以含I mM氯化銨的0.1 M磷酸緩沖溶液(ρΗ7.2)為電解液。將實(shí)施例2中生物傳感器的三種電極均置于電解液中，采用計(jì)時(shí)電流法，施加電位為0.3伏，在電解液中先滴加220 yL濃度為33.7 mM的NADH溶液，然后滴加I ml濃度為2.5 mM的α-酮戊二酸溶液，在經(jīng)過(guò)50分鐘后，電流只下降了2.5%，說(shuō)明實(shí)施例2中生物傳感器檢測(cè)α-酮戊二酸具有較好的響應(yīng)穩(wěn)定 y
ο π-1
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器，該電化學(xué)生物傳感器為三電極體系傳感器，其特征在于工作電極是表面修飾有谷氨酸脫氫酶膜的玻碳電極。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于玻碳電極表面先固定納米金-石墨烯復(fù)合膜，然后再固定谷氨酸脫氫酶膜。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于所述納米金-石墨烯復(fù)合膜是通過(guò)一步電沉積方法固定在玻碳電極表面的；所述谷氨酸脫氫酶膜是通過(guò)滴涂法固定在玻碳電極上的。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于所述一步電沉積方法為循環(huán)伏安法。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述用于檢測(cè)α-酮戊二酸的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于所述谷氨酸脫氫酶為來(lái)源于牛肝的L-谷氨酸脫氫酶。6.—種權(quán)利要求1所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于包括在玻碳電極表面依次固定納米金-石墨烯復(fù)合膜和谷氨酸脫氫酶膜制備工作電極的步驟。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于將玻碳電極作為工作電極、鉑絲電極作為對(duì)電極、甘汞電極作為參比電極，以含有氧化石墨烯和氯金酸的溶液作為電解液，采用循環(huán)伏安法在玻碳電極表面沉積納米金-石墨烯復(fù)合膜。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于所述循環(huán)伏安法中掃描電位區(qū)間為-1.4?0.6伏，掃描速度為18?22毫伏/秒，所述電解液中含有0.5?2mg/ml氧化石墨烯和150?250μΜ氯金酸，沉積圈數(shù)為6?10圈。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于在固定有納米金-石墨烯復(fù)合膜的玻碳電極表面滴涂谷氨酸脫氫酶液后固定，所述谷氨酸脫氫酶液的濃度為110 kU/L?200 kU/L，體積為優(yōu)選為5?15yL，采用戊二醛固定谷氨酸脫氫酶。10.權(quán)利要求1-5之一所述電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè)Ct-酮戊二酸方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N27/327GK106093149SQ201610395430
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日 公開(kāi)號(hào)201610395430.7, CN 106093149 A, CN 106093149A, CN 201610395430, CN-A-106093149, CN106093149 A, CN106093149A, CN201610395430, CN201610395430.7
【發(fā)明人】黃和, 彭鋼, 俞亞?wèn)|, 徐生盼, 江凌
【申請(qǐng)人】南京工業(yè)大學(xué)