一種人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法，包括如下步驟：將未進(jìn)行前處理的人血用電解質(zhì)溶液稀釋后作為檢測溶液，所述檢測溶液中抗生素的濃度為0.1～15ppm，以垂直有序介孔二氧化硅孔道?膠束復(fù)合膜修飾的電極為工作電極，采用電化學(xué)方法，對人血中的抗生素含量進(jìn)行檢測。本發(fā)明采用垂直有序介孔二氧化硅孔道?膠束復(fù)合膜修飾的電極，通過疏水作用，生物樣本中疏水、電中性的抗生素被萃取\富集到膠束微腔中，以抗生素的還原峰電位為檢測信號，實(shí)現(xiàn)人血中抗生素的原位檢測，檢測靈敏度高、響應(yīng)時間短、檢測限低、抗干擾穩(wěn)定性好，對臨床評估抗生素療效具有重要的參考價值。
【專利說明】
一種人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于電化學(xué)傳感領(lǐng)域，尤其涉及一種人血中抗生素含量的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血液成分存在著多樣性、復(fù)雜性，并且涉及到生物體的生理過程，因此血液中成分 的準(zhǔn)確、快速、低成本檢測具有一定的難度。但由于其在生命科學(xué)以及人類生活中所呈現(xiàn)出 來的重要作用，目前世界范圍內(nèi)生命科學(xué)家、分析學(xué)家、醫(yī)學(xué)專家都在積極探索血液成分檢 測的高效途徑。
[0003] 抗生素又稱抗菌素，是由一些微生物合成的、能抑制或殺滅某些病原體的化學(xué)物 質(zhì)?？股貙θ祟惤】邓降奶岣吆蜕踩谋Ｕ掀鸬搅藰O其重要的作用，因此該類藥 物被廣泛地應(yīng)用于臨床、獸藥、農(nóng)業(yè)等方面?，F(xiàn)有抗生素的種類已達(dá)幾千種，常按以下方式 分類:內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖甙類、大環(huán)內(nèi)脂類、氟喹諾酮類、氯霉素類等。然而隨著 人類對抗生素藥物所引起的耐藥性以及長時間攝入含有抗生素的動物源性食品對人體的 危害問題的持續(xù)關(guān)注，抗生素藥物濫用的問題已經(jīng)引起了研究人員的濃厚興趣，研究者們 開始致力于開發(fā)分析測定方法來檢測人血中抗生素的含量。
[0004] 目前，研究測定人血中抗生素的方法有微生物法、色譜分析法、分光光度法、化學(xué) 發(fā)光分析法、免疫分析法、共振瑞利散射法等，這些方法都需要對人血樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處 理過程，如過濾、離心、萃取等，這些復(fù)雜的預(yù)處理過程使得測定結(jié)果極易受干擾。除此之 外，耗時長、大型儀器昂貴、專門的儀器操作人員等特點(diǎn)，已難以滿足當(dāng)前分析要求和發(fā)展 趨勢，限制了這些方法在實(shí)際生活中的應(yīng)用。電化學(xué)方法由于其操作簡單，價格低廉、響應(yīng) 速度快、靈敏度高、選擇性好和不受生物樣品的混濁度干擾等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對人血中抗生 素含量的快速、實(shí)時、在線監(jiān)測。
[0005] 介孔二氧化硅是一類孔徑在2~50nm、孔道取向垂直于基底的新型多孔材料，該類 材料因其具有獨(dú)特的孔徑結(jié)構(gòu)、大的比表面積和介孔孔容、超強(qiáng)的吸附能力等，在吸附、催 化、污水處理、生物傳感等領(lǐng)域表現(xiàn)出了誘人的應(yīng)用前景。
[0006] 近年來，科研工作者們采用St0ber溶液生長法(Angew · Chem · Int · Ed ·，2012，51， 2173-2177)和電化學(xué)輔助自組裝法(Nat.Mater. ,2007,6,602-608)等方法，誘導(dǎo)了表面活 性劑模板分子自助裝和有機(jī)硅烷分子水解/縮聚的協(xié)同反應(yīng)，在固體表面(金、鉬、玻碳、導(dǎo) 電玻璃、石墨電極、絲網(wǎng)印刷電極等)制備了孔徑為2~3nm且垂直有序的介孔二氧化硅孔道 和膠束的復(fù)合膜，簡稱為孔道-膠束復(fù)合物膜?？椎廊∠虼怪庇诨椎亩趸?，使得溶液 中的分析物能夠進(jìn)入孔道并在電極表面發(fā)生有效的電子轉(zhuǎn)移，為電化學(xué)分析提供了可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種基于垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜的電化學(xué)檢測人血 中抗生素含量的方法，該方法檢測靈敏度高，抗生物污染的能力強(qiáng)，檢測限低的不需要復(fù)雜 的預(yù)處理過程。
[0008] 本發(fā)明所提供的人血中抗生素的電化學(xué)檢測方法的具體步驟如下：
[0009] 將未進(jìn)行前處理(過濾、提純等操作）的人血用電解質(zhì)溶液稀釋后作為檢測溶液， 以垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的電極為工作電極，采用電化學(xué)方法，對人 血中的抗生素含量進(jìn)行檢測。
[0010] 本發(fā)明采用電化學(xué)方法，以垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的電極 為工作電極，鉑絲電極和銀/氯化銀分別為對電極和參比電極，對人血中抗生素進(jìn)行快速電 化學(xué)檢測。
[0011] 作為優(yōu)選，所述電解質(zhì)溶液為氯化鈉水溶液、氯化鉀水溶液、硫酸鈉水溶液、硝酸 鈉水溶液、硝酸鉀水溶液、磷酸緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液或tri S-鹽酸緩沖溶液中的一 種;進(jìn)一步優(yōu)選氯化鈉水溶液。所述電解質(zhì)溶液濃度為〇. 02~0.5mol/L，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1 ~0.2mol/L;所述電解質(zhì)溶液的pH值為6~8,進(jìn)一步優(yōu)選為6~7。作為優(yōu)選，人血樣品用電 解質(zhì)溶液稀釋，稀釋倍數(shù)為1~100倍，進(jìn)一步優(yōu)選為10倍。
[0012] 作為優(yōu)選，所述工作電極為垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的如下 電極:氧化銦錫(ΙΤ0)電極、氟摻雜氧化錫電極、金電極、鉑電極、玻碳電極、石墨電極或絲網(wǎng) 印刷電極中的一種，進(jìn)一步優(yōu)選為ΙΤ0電極。作為優(yōu)選，所述工作電極為垂直有序介孔二氧 化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的ΙΤ0電極。
[0013] 作為優(yōu)選，所述工作電極為垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的電極。 所述工作電極可采用現(xiàn)有的制備方法，如Stdber溶液生長法或電化學(xué)輔助自組裝法，進(jìn)一 步優(yōu)選為St5ber溶液生長法。
[0014] 作為優(yōu)選，所述膠束為十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)或雙子表面活性劑中的一種 組成，進(jìn)一步優(yōu)選為CTAB。
[0015] 作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述工作電極為垂直有序介孔二氧化硅孔道-十六烷基三甲基 溴化銨膠束復(fù)合膜修飾的ΙΤ0電極。垂直有序介孔二氧化硅陣列的孔徑為2~3nm。對所述工 作電極進(jìn)行分析，從上至下分別垂直介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合物膜層、ΙΤ0層和玻璃層 所述工作電極中垂直有序介孔二氧化硅孔道-十六烷基三甲基溴化銨膠束復(fù)合膜的厚度為 110~115nm〇
[0016] 如圖7所示，本發(fā)明以垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的電極為工作 電極，脂溶性抗生素可以通過疏水作用被萃取/富集到由膠束組成的疏水空腔中，以脂溶性 抗生素還原峰電流為檢測信號。此外，這種修飾電極由于垂直介孔二氧化硅(孔徑2~3nm) 存在，可以防止血液中蛋白、血細(xì)胞等大尺寸物質(zhì)對電極表面的污染。因此，該電極可以實(shí) 現(xiàn)人血中（蛋白、血細(xì)胞存在下）的復(fù)雜背景下抗生素含量的測定。膠束由十六烷基三甲基 溴化銨(CTAB)等的表面活性劑自組裝而成，帶電的極性基團(tuán)朝外，與介孔硅孔道上的硅羥 基靜電作用，而非極性的長烷鏈則通過疏水作用堆積，在介孔硅內(nèi)部形成了一個疏水空腔。 通過疏水作用，水溶液中的脂溶性分析物能夠被萃取/富集到有膠束組成的疏水空腔中，并 在膠束/電極界面上發(fā)生電化學(xué)氧化還原反應(yīng)。本發(fā)明構(gòu)建的傳感器，不需要復(fù)雜的預(yù)處理 過程，靈敏度高，檢測限低，響應(yīng)快，操作簡單，在藥物檢測領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。
[0017] 作為優(yōu)選，所述電化學(xué)檢測方法為循環(huán)伏安法、差示脈沖伏安法、方波伏安法、方 波溶出伏安法、線性掃描溶出伏安法中的一種，進(jìn)一步優(yōu)選為差示脈沖伏安法。
[0018] 作為進(jìn)一步優(yōu)選，檢測得到電流密度后，可通過如下公式直接得到待檢測體系中 抗生素的含量：
[0020]其中X為待檢測體系中抗生素的含量，單位是ppm，y為電流密度值，單位是μΑ cnf2， ki = 0 · 9-1 (μΑ cm-2)-1 · 8~1 · 9(μΑ cm-2)-ippm;bi = 0 · 14~0 · 16ppm;b2 = 3 · 9~ 4. lppm。作為進(jìn)一步優(yōu)選，ki = 0.962(yA cm-2) -ippm; k2 = 1 · 852 (μΑ cm-2)-ippm; bi = 0.154ppm；b2 = 3.917ppm；
[0021]采用該方法，能夠在0.1~15.Oppm的濃度范圍內(nèi)精確檢測，更適于血液環(huán)境的檢 測。
[0022]作為優(yōu)選，所述富集方法為攪拌富集，攪拌時間為0~30min，優(yōu)選為30s。
[0023] 作為優(yōu)選，所述抗生素為脂溶性抗生素，所述脂溶性抗生素為氯霉素或呋喃妥因 中的一種，進(jìn)一步優(yōu)選為氯霉素。作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述檢測溶液中氯霉素的濃度為〇. 1~ 15ppm〇
[0024] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果具體體現(xiàn)在：
[0025] 1、本發(fā)明采用的垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的電極，可以實(shí)現(xiàn) 對人血中脂溶性抗生素的檢測。
[0026] 2、垂直有序介孔二氧化硅陣列的孔徑為2~3nm，具有尺寸選擇性，可以排阻人血 中的蛋白、血細(xì)胞等尺寸大于二氧化硅孔徑的物質(zhì)到達(dá)電極表面。
[0027] 3、由膠束組成的疏水空腔，具有電荷/親疏水選擇性，只有脂溶性的中性分子能夠 被萃取/富集疏水空腔中，進(jìn)而在膠束/電極表面發(fā)生電化學(xué)氧化還原反應(yīng)。而這種萃取/富 集作用能夠提高電極響應(yīng)的分析性能(如高靈敏度、低檢測限等）。
[0028] 4、該方法檢測快速，簡單，價格低廉，電極可以大批量生產(chǎn)。
[0029] 5、該方法無需對人血進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理過程，電極抗生物污染能力好，靈敏度高， 檢測限低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于裸ΙΤ0電極的檢測限，檢測周期短，穩(wěn)定性高，比同等條件下的裸ΙΤ0電 極的化學(xué)信號衰減程度大大降低。
[0030] 6、本發(fā)明的檢測方法可以拓展到其他復(fù)雜實(shí)際樣品，如食品，污水，以及人血清中 的電活性物質(zhì)的原位或臨床檢測。
[0031 ] 7、本發(fā)明的檢測方法可以拓展到其他疏水的中性小分子的檢測，如爆炸物、有機(jī) 磷農(nóng)藥、抗氧化劑等。
[0032]總之，本發(fā)明采用垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的電極，通過疏水 作用，生物樣本中疏水、電中性的抗生素被萃取\富集到膠束微腔中，以抗生素的還原峰電 位為檢測信號，實(shí)現(xiàn)人血中抗生素的原位檢測，檢測靈敏度高、響應(yīng)時間短、檢測限低、抗干 擾穩(wěn)定性好，對臨床評估抗生素療效具有重要的參考價值。
【附圖說明】
[0033]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中人血稀釋后的待檢測溶液。
[0034]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中垂直介孔二氧化硅陣列的透射電鏡圖（a)和掃描電鏡圖 (b) 〇
[0035] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中裸ΙΤ0電極(a)及垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束修飾的 ΙΤ0電極(b)在含有l(wèi)ppm氯霉素的人血中的差示脈沖伏安曲線。
[0036] 圖4(a)為本發(fā)明實(shí)施例1中垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的ΙΤ0電 極在人血中未加和加有不同濃度的氯霉素的差示脈沖伏安曲線以及(b)氯霉素還原峰電流 與濃度的線性關(guān)系圖。
[0037] 圖5(a)為本發(fā)明實(shí)施例1裸ΙΤ0電極在人血中未加和加有不同濃度的氯霉素的差 示脈沖伏安曲線以及(b)氯霉素還原峰電流與濃度的線性關(guān)系圖。
[0038]圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中裸ΙΤ0電極及垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束修飾的ΙΤ0 電極在含有1 Oppm氯霉素的人血中還原峰電流下降比率隨時間的變化圖。
[0039]圖7為本發(fā)明利用垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的ΙΤ0電極檢測原 理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 實(shí)施例1
[0041] 使用垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的ΙΤ0電極，檢測人血中氯霉素 的電化學(xué)過程：
[0042] (1)垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的ΙΤ0電極的制備方法為smber 溶液生長法，具體步驟為:將0.16g CTAB、70mL水、30mL無水乙醇、100yL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5 %的 氨水和80yL四乙氧基硅烷混合后，將干凈的ΙΤ0電極置于該溶液內(nèi)。在60°C下反應(yīng)24小時 后，用水徹底清洗并在1 〇〇 °C烘箱中老化過夜。
[0043] (2)用0.15mo 1 /L、pH值為7的氯化鈉溶液將人血稀釋10倍，作為待檢測溶液，如圖1 所示。在測試之前，將惰性氣體(氮?dú)饣驓鍤?通入該待測溶液中20min，以除去溶液中氧氣 的干擾。電化學(xué)測試過程中，采用傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)，垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù) 合膜修飾的ΙΤ0電極、鉑絲電極及銀/氯化銀電極分別作為工作電極、對電極和參比電極，整 個電極系統(tǒng)置于惰性氣體氛圍中，防止空氣中氧氣影響電化學(xué)測定。
[0044] (3)將氯霉素溶于乙醇中配置成儲備液，在待測溶液中加入不同體積氯霉素儲備 液得到一系列待測溶液(氯霉素的濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0、3.0、5.0、 7.0、10.0、15.Oppm)，進(jìn)行差示脈沖伏安測試。
[0045] 圖2(a)為垂直有序介孔二氧化硅陣列的透射電鏡圖，白色亮點(diǎn)即為孔，也就是圓 柱形膠束所處位置，黑色部分即為二氧化硅。從圖中可以看出介孔二氧化硅的孔徑為2~ 3nm，且孔隙率為4 X l(T12Cnf2;圖2(b)為垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的ΙΤ0 電極的截面掃描電鏡圖，從圖中可以清晰地看到三層，從上至下分別垂直介孔二氧化硅孔 道-膠束復(fù)合物膜層、ΙΤ0層和玻璃層，且垂直介孔二氧化硅陣列層的厚度為111.Onm。
[0046] 圖3為裸ΙΤ0電極(a)及垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合物膜修飾的ΙΤ0電極 (b)在含有l(wèi)ppm氯霉素的人血中的差示脈沖伏安曲線，從中可以看出，氯霉素在復(fù)合物膜修 飾的IT0電極上的還原峰電流是其在裸IT0上的3倍。
[0047] 圖4中（a)為垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的ΙΤ0電極在人血中未 加和加有不同濃度的氯霉素中的差示脈沖伏安曲線?？梢钥闯?，隨著人為加入的氯霉素濃 度的提高，在0.75V處的還原峰電流增加。圖4中（b)為該復(fù)合物膜修飾電極上抗生素的還原 峰電流和濃度的線性響應(yīng)曲線。由圖4中（b)可知，在3.7ppm線性關(guān)系發(fā)生變化，檢測精度更 尚。
[0048]圖5中（a)為裸ΙΤ0電極在人血中未加和加有不同濃度的氯霉素中的差示脈沖伏安 曲線?？梢钥闯觯S著人為加入的氯霉素濃度的提高，在0.75V處的還原峰電流增加，但是峰 型變寬。圖5中（b)為裸ΙΤ0電極上抗生素的還原峰電流和濃度的線性響應(yīng)曲線，由圖5中（b) 可知，裸ΙΤ0電極對人血中氯霉素進(jìn)行檢測時，檢測精度較低。
[0049] 表1歸納了裸ΙΤ0電極和垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合物膜修飾的ΙΤ0電 極在人血中電化學(xué)檢測氯霉素的分析結(jié)果，包括靈敏度、檢測范圍和檢測限。從中可以看 出，相對于裸ΙΤ0電極，垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合物膜修飾的ΙΤ0電極顯示出優(yōu) 越的分析性能，包括高靈敏度、寬響應(yīng)范圍、低檢測限。
[0050] 表 1
[0051]
[0052] 圖6為裸ΙΤ0電極及垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束修飾的ΙΤ0電極在含有l(wèi)Oppm 氯霉素的人血中還原峰電流比率(電流/Omin時刻的電流)隨時間的變化圖。從中可以看出， 在測試時間范圍內(nèi)（45min)，氯霉素在兩種電極的電化學(xué)信號都有了不同程度的下降，但是 氯霉素在復(fù)合膜修飾的IT0電極上峰電流的衰減程度(~21.0%)遠(yuǎn)小于其在裸IT0電極上 的峰電流衰減程度(~75.5% )。由此證明了，復(fù)合物膜修飾的IT0電極具有較好的抗生物污 染的能力，可以用于復(fù)雜生物樣本的長時間在線分析。
[0053] 以上分析結(jié)果證明了垂直有序介孔二氧化硅孔道-膠束復(fù)合膜修飾的電極可以成 功地用于人血中抗生素含量的檢測。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 將未進(jìn)行前處理的人血用電解質(zhì)溶液稀釋后作為檢測溶液，所述檢測溶液中抗生素的 濃度為0.1~15ppm，W垂直有序介孔二氧化娃孔道-膠束復(fù)合膜修飾的電極為工作電極，采 用電化學(xué)方法，對人血中的抗生素含量進(jìn)行檢測。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法，其特征在于，所述膠束 為十六烷基Ξ甲基漠化錠或雙子表面活性劑中的一種組成。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法，其特征在于，所述膠束 為十六烷基Ξ甲基漠化錠，其中垂直有序介孔二氧化娃陣列的孔徑為2~化m;所述工作電 極中垂直有序介孔二氧化娃孔道-膠束復(fù)合膜的厚度為110~115nm。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法，其特征在于，所述抗生 素為氯霉素或巧喃妥因中的一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法，其特征在于，所述電解 質(zhì)溶液為氯化鋼水溶液、氯化鐘水溶液、硫酸鋼水溶液、硝酸鋼水溶液、硝酸鐘水溶液、憐酸 緩沖液、醋酸-醋酸鋼緩沖溶液或tris-鹽酸緩沖溶液中的一種；所述電解質(zhì)溶液濃度為 0.02~0.5mol/L，所述電解質(zhì)溶液的pH值為6~8。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法，其特征在于，所述工作 電極為垂直有序介孔二氧化娃孔道-膠束復(fù)合膜修飾的下列電極之一:氧化銅錫電極、氣滲 雜氧化錫電極、金電極、玻碳電極、銷電極、石墨電極或絲網(wǎng)印刷電極中的一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法，其特征在于，檢測之 前，向電解質(zhì)溶液中通入惰性氣體，排除電解質(zhì)溶液中的氧氣。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法，其特征在于，檢測前可 進(jìn)行富集，富集方法為攬拌富集，攬拌時間30~60s。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法，其特征在于，所述工作 電極采用如下的方法制備得到:紛創(chuàng)3汾溶液生長法或電化學(xué)輔助自組裝法。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血中抗生素含量的電化學(xué)檢測方法，其特征在于，所述電 化學(xué)檢測方法為循環(huán)伏安法、差示脈沖伏安法、方波伏安法、方波溶出伏安法、線性掃描溶 出伏安法中的一種。
【文檔編號】G01N27/48GK106093172SQ201610403645
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】蘇彬, 孫琴琴, 晏菲, 姚麗娜
【申請人】浙江大學(xué)