一種高通量檢測生物體血液樣本中113種脂質(zhì)的液質(zhì)聯(lián)用方法
【專利摘要】一種高通量檢測生物體血液樣本中113種脂質(zhì)的液質(zhì)聯(lián)用方法，其屬于生物分析化學(xué)領(lǐng)域。該方法采用將待測樣本預(yù)處理并加入反應(yīng)溶劑及萃取劑萃取后，進(jìn)行液相?質(zhì)譜檢測。該方法操作簡單、選擇性高、靈敏度高，能快速檢測血液中113種脂質(zhì)，其中磷脂酰膽堿（PC）48個(gè)，溶血磷脂酰膽堿（Lyso?PC）21個(gè)，磷脂酰乙醇胺（PE）17個(gè)，溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）4個(gè)，溶血磷酯酰肌醇（PI）6個(gè)，鞘磷脂（SM）9個(gè)，神經(jīng)酰胺（Cer）8個(gè)。該方法的精密度符合血清樣本分析的要求、穩(wěn)定性良好，對于大部分脂質(zhì)類代謝物的檢測靈敏度較高，適用于血清樣本的脂質(zhì)組學(xué)分析。
【專利說明】
一種高通量檢測生物體血液樣本中113種脂質(zhì)的液質(zhì)聯(lián)用 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種高通量檢測生物體血液樣本中113種脂質(zhì)的液質(zhì)聯(lián)用方法，其屬 于生物化學(xué)分析檢測領(lǐng)域，可以快速高通量的進(jìn)行血液中113種脂質(zhì)成分的檢測，大大提高 了檢測效率和準(zhǔn)確性。
【背景技術(shù)】
[0002] 血液是人體內(nèi)重要組成部分，流經(jīng)人體內(nèi)各個(gè)器官、組織，參與人體的新陳代謝、 調(diào)節(jié)功能以及維持人體的內(nèi)外環(huán)境平衡，人體任何部位發(fā)生病理性變化時(shí)都會產(chǎn)生特定的 生物標(biāo)志物釋放到血液中，并且血液樣品檢測無創(chuàng)、是最易得的一種能夠作為體外診斷的 生物樣本，因此血常規(guī)也是醫(yī)療診斷中最直接易得的檢測數(shù)據(jù) [1]。
[0003] 目前，血液的代謝組學(xué)在發(fā)現(xiàn)新的疾病的早期生物標(biāo)記物上面日益被人們熟知。 2012年，Lokhov等釆用質(zhì)譜法對自莫斯科收集的100例肺癌患者和100例健康志愿者的血漿 樣品進(jìn)行了檢測。研究發(fā)現(xiàn)與肺癌相關(guān)的70個(gè)代謝物，且肺癌組水平均高于健康志愿者;而 且這些代謝物的水平在肺癌初期就發(fā)生了上調(diào) [2]。2015年，唐小虎等采用以核磁共振的代 謝組學(xué)檢測方法比較了 51名食管癌患者和50名正常人的血清樣本中代謝物的不同，找到了 代謝物脯氨酸和谷氨酰胺為食管癌相關(guān)的生物標(biāo)志物，并使用聚類分析對這兩個(gè)生物標(biāo)志 物進(jìn)行驗(yàn)證，最后對這兩個(gè)代謝物進(jìn)行了含量上的對比，發(fā)現(xiàn)脯氨酸和谷氨酰胺在食管癌 患者的血清中的含量都比正常人低 [3]。2012年，杜智勇等擬通過代謝組學(xué)技術(shù)檢測心衰患 者的血清代謝譜，分析其與超聲心肌能耗指標(biāo)MEE相關(guān)性，本研究共61人，其中正常對照組 15人，心力衰竭組46人，通過檢測共發(fā)現(xiàn)44種差異脂質(zhì)代謝產(chǎn)物與心衰相關(guān) [4]。因此血液標(biāo) 志物為疾病的深入研究提供了有效的證據(jù)，具有深刻的研究意義和探索價(jià)值。
[0004] 脂質(zhì)化合物是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分，其在細(xì)胞發(fā)育、能量儲備、信號傳導(dǎo)、 物質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬顒舆^程中均起著至關(guān)重要的作用。脂質(zhì)類化合物包括以下大類:脂肪酰 類，甘油酯類，甘油磷脂類，鞘脂類，留醇脂類，異戊煉醇脂類，糖脂類和多聚酮類，不同脂質(zhì) 反應(yīng)的生物學(xué)功能也不同。因此，脂質(zhì)代謝的動態(tài)變化可直接或間接地反映脂質(zhì)及其代謝 物與生物系統(tǒng)諸如細(xì)胞、體液、組織、器官及機(jī)體的生理、病理之間的相互作用情況。鑒于脂 質(zhì)的特殊生物學(xué)意義，檢查血液中的脂質(zhì)在代謝病篩查中具有不可替代的重要性，并且脂 質(zhì)存在于細(xì)胞、細(xì)胞器和細(xì)胞外的體液如血漿、膽汁、乳、腸液中，因此檢測血液中的脂質(zhì)成 分也成為了病人就診檢測時(shí)最方便的檢查手段 [5]。脂質(zhì)的異常代謝與動脈硬化癥、糖尿病、 肥胖癥、阿爾茨海默病以及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，脂質(zhì)組學(xué)在近年隨著檢測技術(shù)的提高得到 了越來越多的發(fā)展，但是人們對脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)知仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于基因和蛋白質(zhì)， 主要的原因是由于脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的多樣性復(fù)雜性，以及相應(yīng)分析手段的滯后阻礙了人們對 生命體的整體脂質(zhì)及其復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)和功能調(diào)控進(jìn)行規(guī)模性整體性的系統(tǒng)研究 [6]。為了 避免疾病的誤檢以及漏檢，需要快速、精準(zhǔn)的檢測方法同時(shí)兼顧血液多組分檢測。在各種分 析手段中，高效液相串聯(lián)質(zhì)譜以其高通量高精度，在血液脂質(zhì)檢測方面發(fā)揮了巨大的優(yōu)勢。 本方法的精密度符合血清樣本分析的要求、穩(wěn)定性良好，對于大部分脂質(zhì)類代謝物的檢測 靈敏度較高，適用于血清樣本的脂質(zhì)組學(xué)分析。
[0005] 2014年，曲楓等使用了兩個(gè)臨床隊(duì)列，合計(jì)156例血清樣本采用高效液相色譜串聯(lián) 三重四級桿質(zhì)譜建立了一套靶向鞘脂質(zhì)組學(xué)的定量分析方法，通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫檢索(Lipid maps)鑒定分析了 43個(gè)鞘脂代謝網(wǎng)絡(luò)核心化合物，進(jìn)行了慢性丙性病毒性肝炎相關(guān)生物標(biāo) 志物方面的研究[7]。2013年，習(xí)聰?shù)炔捎酶咝б合嗌V串聯(lián)質(zhì)譜建立的分析方法，開展了 80 例二型糖尿病患者與28例健康志愿者血清樣本的脂質(zhì)組學(xué)研究，以尋找與二型糖尿病診 斷、治療密切相關(guān)的潛在脂質(zhì)類生物標(biāo)志物。通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫檢索(Lipid maps，METLIN) 及代謝物結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜裂解特征，推斷可能生物標(biāo)志物的可能結(jié)構(gòu)。結(jié)果鑒定出35個(gè)與二型 糖尿病診斷密切相關(guān)的脂質(zhì)類潛在生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)，另外鑒定出49個(gè)與二型糖尿病治療 密切相關(guān)的脂質(zhì)類潛在生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu) [8]。Jeanson L等運(yùn)用脂質(zhì)組學(xué)方法描述了血漿 脂質(zhì)在肺囊性纖維化中的網(wǎng)絡(luò)代謝變化，肺囊性纖維化的發(fā)病機(jī)制和囊性纖維化跨膜傳遞 調(diào)節(jié)因子基因突變導(dǎo)致氣道黏液梗阻，細(xì)菌定植，肺進(jìn)行性壞死有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)肺囊性纖維 化患者血漿中多種PC和LPC都顯著降低，這表明血漿中磷脂代謝的變化對肺囊性纖維化病 變過程起重要作用，是藥物治療的潛在靶點(diǎn) [9]。
[0006]目前已有的報(bào)道的檢測出的血液中脂質(zhì)數(shù)量均較少，或者只是單一的某一類脂 質(zhì)，并且不同報(bào)道中使用的不同檢測儀器檢測造成的檢測結(jié)果的不統(tǒng)一，并且多數(shù)方法結(jié) 合代謝相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析和數(shù)據(jù)庫檢索等手段，分析推斷可能生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)，而非使用 標(biāo)準(zhǔn)品指認(rèn)，結(jié)果準(zhǔn)確性有待商榷，無法提供真實(shí)有效的檢測標(biāo)準(zhǔn)。還未有使用一種前處理 方法后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的技術(shù)同時(shí)檢測七類113種脂質(zhì)并采用全部標(biāo)準(zhǔn)品指認(rèn)的報(bào) 道。
[0007] [1].范少娟.血液生物標(biāo)志物的光學(xué)聯(lián)合檢測方法探索.天津.天津大學(xué)， 2013.
[2] . Lokhov PG, Trifonova OP, Maslov DL, Archakov AI. Blood plasma metabolites and the risk of developing lung cancer in Russia. [j]. Eur J Cancer Prev. 2013 Jul; 22(4):335-41.
[3] .唐小虎.基于代謝組學(xué)尋找食管癌生物標(biāo)志物以及肺癌的耐藥生物標(biāo)志物研 究.北京.北京化工大學(xué)，2015.
[4] .杜智勇.代謝組學(xué)方法評價(jià)慢性心力衰竭代謝重構(gòu)的基礎(chǔ)與臨床研究.[D]. 廣東省:南方醫(yī)科大，2012.
[5] .蔡潭溪.劉平生.楊福全.楊福愉.脂質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展.生物化學(xué)與生物物理 進(jìn)展，2010，37(2):121-128.
[6] .馬小瓊，脂類組學(xué)及神經(jīng)脂類組學(xué)進(jìn)展[J]，中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2008, 22 (2):156-160.
[7] .曲楓.脂質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)及其在發(fā)現(xiàn)免疫性疾病和病毒性肝炎相關(guān)生物標(biāo)志物 方面的研究.[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2014.
[8] .習(xí)聰，基于技術(shù)的型糖尿病血清脂質(zhì)組學(xué)研究.北京.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2013.
[9] . Jeanson L, Guerrera IC, Papon JF, Chhuon C, Zadigue P, et. al. Proteomic analysis of nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients.[ J]· PLoS One. 2014 S印 30;9(9)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種高通量檢測血液中113種脂質(zhì)的 液質(zhì)聯(lián)用方法，提供一種檢測效率高、準(zhǔn)確度精準(zhǔn)的脂質(zhì)檢測技術(shù)。采用高效液相色譜 (HPLC)分離、電噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-Q-T0F-MS)同時(shí)測定生物樣品中 113種脂質(zhì)化合物的成分。其中，高效液相色譜以含甲酸的甲醇-水溶液為流動相，電噴霧離 子源高分辨串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜采用內(nèi)標(biāo)法，同時(shí)對113種脂質(zhì)化合物進(jìn)行定性及分析。
[0009] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種高通量檢測生物體血液樣本中113種脂質(zhì)的液質(zhì) 聯(lián)用方法，采用超高效液相色譜分離與電噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-Q-T0F-MS)正、負(fù)離子掃描模式對樣本中系列脂質(zhì)成分檢測分析。包括磷脂酰膽堿(PC)、溶血 磷脂酰膽堿(Lyso-PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血磷脂酰膽堿(Lyso-PC)、溶血磷酯酰肌醇 (Lyso-PI)，鞘磷脂(SM)、神經(jīng)酰胺(ceramide)共計(jì)7類成分，共113種脂質(zhì)單體化合物。
[0010] (1)標(biāo)準(zhǔn)物數(shù)據(jù)庫的建立 根據(jù)ESI源下的離子化形式及化學(xué)式，得到每種化合物母離子的精確質(zhì)量數(shù)，形成T0F/ MS數(shù)據(jù)庫。在Q-T0F/MS模式下，分別采集每種脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物在3個(gè)不同碰撞能量下的碎片離子 質(zhì)譜圖，形成Q-T0F/MS數(shù)據(jù)庫;所述3個(gè)不同碰撞能量分別為:20psi、35psi和50psi ;標(biāo)準(zhǔn)品 內(nèi)標(biāo)溶液的稀釋液為80%甲醇水溶液； (2) 生物血液樣本處理 1) 取-80 °C下凍存血漿，于4 °C冰箱中解凍，取10此血漿，依次加入1 OyL混合內(nèi)標(biāo)溶液， 10yL 0.9% NaCl，100yL提取液，渦旋20s后于4°C冰箱靜置30min，所述提取液為體積比2:1 的氯仿與甲醇的混合液;所述混合內(nèi)標(biāo)溶液為含19:0-19:0磷脂酰膽堿、17:0-17:0磷脂 酰乙醇胺、12:0鞘磷脂、19:0溶血磷脂酰膽堿，濃度均為5 yg/mL的異丙醇-乙腈溶液，異 丙醇、乙腈的比例為1:1; 2) 取靜置后樣品7800g/min離心3min，用lmL注射器吸取下層液于0.5mLEP管中，立刻吸 取40yL于內(nèi)襯管中，氮?dú)獯蹈珊竺芊獯嬗?20°C冰箱中待用； 3) 進(jìn)樣前用40yL乙腈:異丙醇體積比為1:1的混合液復(fù)溶，渦旋60s，進(jìn)樣； (3) 定性檢測 采用HPLC/ESI-Q-T0F-MS測定步驟3)中的血液樣品處理液，通過比對樣品中保留時(shí) 間、一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息，確定樣品中是否含有113種目標(biāo)脂質(zhì)成分； 色譜條件:柱溫：50°C，進(jìn)樣室溫度:4°C，流速:0.4 mL/min，進(jìn)樣體積：2yL，流動相:A 相：10謹(jǐn)〇1^1乙酸銨+0.1%甲酸+99.9%水，8相：10 111111〇171乙酸銨+0.1%甲酸+49.95%乙腈 +49.95%異丙醇梯度洗脫。
[0011] 所述梯度洗脫程序?yàn)?〇. Olmin時(shí)65/35(A/B，V/V)，逐漸改變梯度到2min變成20/ 80(六/8，￥八），進(jìn)一步改變梯度到91^11變成0/100(4/8，￥八），并維持到151^11，到161^11變?yōu)?初始濃度65/35(A/B，V/V)并維持到20min。
[0012]正離子檢測質(zhì)譜條件為：離子源：ESI源；離子噴霧電壓：+5.5kV;渦輪噴射溫度 (TEM):550°C;GS1:50 psi;GS2:50 psi;CUR:30psi;T0F MS 和 T0F MS/MS 掃描范圍分別 為:m/z 100-1500和50-1200。負(fù)離子檢測質(zhì)譜條件為：離子源:ESI源；離子噴霧電壓：- 4·5kV;渦輪噴射溫度（TEM):550°C;GSl:50psi ;GS2:50psi;CUR:30psi;T0FMS和T0F-MS/MS掃描范圍分別為:m/z 200-1200和50-1200。
[0013] (4)相對定量檢測 以含19:0-19:0磷脂酰膽堿、17:0-17:0磷脂酰乙醇胺、12:0鞘磷脂、19:0溶血磷脂 酰膽堿的異丙醇-乙腈溶液為內(nèi)標(biāo)，對生物樣品中檢測到的脂質(zhì)成分進(jìn)行相對定量，在樣品 預(yù)處理過程中加入濃度確定的內(nèi)標(biāo)化合物，19:0-19:0磷脂酰膽堿、17:0-17:0磷脂酰乙 醇胺、12:0鞘磷脂、19:0溶血磷脂酰膽堿，采用峰面積比值方法，每一類的化合物對應(yīng)其 內(nèi)標(biāo)進(jìn)行相對定量，若沒有相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的，采用保留時(shí)間相近的原則選擇內(nèi)標(biāo)進(jìn)行相對定量。
[0014] 本專利方法確定該113種化合物ESI源下的離子化形式及化學(xué)式，得到每種化合物 母離子在正負(fù)離子采集中的精確質(zhì)量數(shù)，形成T0F/MS數(shù)據(jù)庫。在Q-T0F/MS模式下，分別采集 每種脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物正負(fù)采集模式不同碰撞能量下的碎片離子質(zhì)譜圖，形成Q-T0F/MS數(shù)據(jù)庫。
[0015 ] 采用HPLC/ESI -Q-T0F-MS測定生物樣品處理液，通過比對樣品中保留時(shí)間、一級質(zhì) 譜和二級質(zhì)譜信息，確定樣品中是否含有113種目標(biāo)脂質(zhì)成分。
[0016] 色譜條件 柱溫:50°C進(jìn)樣室溫度:4°C流速:0.4 mL/min進(jìn)樣體積:2yL 流動相4:10臟〇171乙酸銨+0.1%甲酸+99.9%水 B: 10 mmoL/L乙酸銨+0.1%甲酸+49.95%乙腈+49.95%異丙醇 梯度洗脫條件：
質(zhì)譜方法 正離子模式參數(shù)設(shè)置
負(fù)離子模式參數(shù)設(shè)置
本申請的有益效果是：該方法采用將待測樣本預(yù)處理并加入反應(yīng)溶劑及萃取劑萃取 后，進(jìn)行液相-質(zhì)譜檢測。該方法操作簡單、選擇性高、靈敏度高，能快速檢測血液中113種脂 質(zhì)，其中磷脂酰膽堿(PC)48個(gè)，溶血磷脂酰膽堿(Lys 〇-PC)21個(gè)，磷脂酰乙醇胺(PE)17個(gè)，溶 血磷脂酰乙醇胺(LPE)4個(gè)，溶血磷酯酰肌醇(PI)6個(gè)，鞘磷脂(SM)9個(gè)，神經(jīng)酰胺(Cer)8個(gè)。 該方法能同時(shí)定性和定量檢測113種脂質(zhì)，檢測靈敏度高。本方法的精密度符合血清樣本分 析的要求、穩(wěn)定性良好，對于大部分脂質(zhì)類代謝物的檢測靈敏度較高，適用于血清樣本的脂 質(zhì)組學(xué)分析。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品LC-T0F-MS正離子采集模式TIC色譜圖。
[0018]圖2為本發(fā)明脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品LC-T0F-MS負(fù)離子采集模式TIC色譜圖。
[0019]圖3為本發(fā)明實(shí)際應(yīng)用中血液樣品脂質(zhì)檢測LC-T0F-MS正離子采集模式TIC色譜 圖。
[0020] 圖4為本發(fā)明實(shí)際應(yīng)用中血液樣品脂質(zhì)檢測LC-T0F-MS負(fù)離子采集模式TIC色譜 圖。
[0021] 圖5為本發(fā)明脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品LC-T0F-MS正離子采集模式XIC色譜圖。 具體實(shí)施方案
[0022] -血友病患者血液中脂質(zhì)種類檢測 1)內(nèi)標(biāo)液及提取液配制 內(nèi)標(biāo)溶液:含 19:0-19:0 PC、17:0-17:0 PE、12:0 SM、19:0 Lyso PC 濃度為5yg/mL的 異丙醇-乙腈溶液(1:1)。提取液:氯仿-甲醇(2:1)。
[0023] 2)患者血液樣品處理 患者血液樣品處理，-80 °C下凍存血漿，于4 °C冰箱中解凍，取1 OyL血漿，依次加入1 OyL 混合內(nèi)標(biāo)溶液，l〇yL 0.9%NaCl，100yL氯仿-甲醇（2 :1)提取液，渦旋20s，4°C冰箱靜置 30min。7800g/min離心3min。lmL注射器吸取下層液于0.5mLEP管中，立刻吸取40yL于內(nèi)襯管 中。氮?dú)獯蹈桑芊獯嬗?20°C冰箱中待用。進(jìn)樣前用40yL乙腈-異丙醇（1:1)復(fù)溶，渦旋60s， 進(jìn)樣。
[0024] 3)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫建立 采用HPLC/ESI-Q-TOF-MS測血液中的113種脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，確定該113種化合物 ESI源下的離子化形式及化學(xué)式，得到每種化合物母離子的精確質(zhì)量數(shù)，形成T0F/MS數(shù)據(jù) 庫。在Q-T0F/MS模式下，分別采集每種脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物在35±15psi三個(gè)不同碰撞能量下的碎片 離子質(zhì)譜圖，形成Q-T0F/MS數(shù)據(jù)庫。
[0025] 4)定性檢測 采用HPLC/ESI-Q-TOF-MS測定步驟2)中的血液樣品處理液，正離子檢測質(zhì)譜條件為:離 子源:ESI源;離子噴霧電壓:+5·5kV;渦輪噴射溫度(TEM) :550°C;GSl:50psi;GS2:50psi ; CUR:30psi;T0F MS 和 TOF MS/MS 掃描范圍分別為:m/z 100-1500 和50-1200。負(fù)離子檢 測質(zhì)譜條件為：離子源:ESI源;離子噴霧電壓:-4.5kV;渦輪噴射溫度(TEM): 550°C ;GS1:50 psi;GS2:50 psi;CUR:30psi;T0F MS 和 T0F-MS/MS掃描范圍分別為:m/z 200-1200和50-1200〇
[0026] 通過比對樣品中保留時(shí)間、一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息，確定人血清樣品中是否含 有113種目標(biāo)脂質(zhì)成分，檢測結(jié)果見附表2、3。
[0027] 5)定量檢測 附表1:113種脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品基本fg息



附表2:血友病患者血清脂質(zhì)正離子模式檢測結(jié)果
附表3:血友病患者血清脂質(zhì)負(fù)離子模式檢測結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高通量檢測生物體血液樣本中113種脂質(zhì)的液質(zhì)聯(lián)用方法，采用超高效液相色 譜分離與電噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS)正、負(fù)離子掃描模式對樣 本中系列脂質(zhì)成分檢測分析，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 標(biāo)準(zhǔn)物數(shù)據(jù)庫的建立 根據(jù)ESI源下的離子化形式及化學(xué)式，得到每種化合物母離子的精確質(zhì)量數(shù)，形成TOF/ MS數(shù)據(jù)庫;在Q-TOF/MS模式下，分別采集每種脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物在3個(gè)不同碰撞能量下的碎片離子 質(zhì)譜圖，形成Q-TOF/MS數(shù)據(jù)庫； (2) 生物血液樣本處理 取血漿加入混合內(nèi)標(biāo)溶液，再加入提取液，離心;取下清，氮?dú)獯蹈珊螅尤霃?fù)溶液進(jìn)行 復(fù)溶，得到待測樣品；所述提取液為體積比2:1的氯仿與甲醇的混合液;所述混合內(nèi)標(biāo)溶液 為含19:0-19:0磷脂酰膽堿、17:0-17:0磷脂酰乙醇胺、12:0鞘磷脂、19:0溶血磷脂酰膽 堿濃度均為5 yg/mL的異丙醇-乙腈溶液;所述復(fù)溶液為乙腈：異丙醇體積比為1:1的混合 液； (3) 定性檢測 采用HPLC/ESI-Q-TOF-MS測定待測樣品，通過比對樣品中保留時(shí)間、一級質(zhì)譜和二級 質(zhì)譜信息，確定樣品中是否含有113種目標(biāo)脂質(zhì)成分； HPLC色譜條件：柱溫：50 °C，進(jìn)樣室溫度：4 °C，流速:0.4 mL/min，進(jìn)樣體積：2yL，流動 相:A相：含10mM/L乙酸銨、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的水，B相:含10mM/L乙酸銨、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲 酸的乙腈-異丙醇混合液，乙腈-異丙醇混合液中乙腈：異丙醇的體積比為1:1，流動相梯度 洗脫； 正離子檢測質(zhì)譜條件為:離子源:ESI源;離子噴霧電壓:+5.5kV;渦輪噴射溫度(TEM): 550°C;GS1:50 psi;GS2:50 psi;CUR:30psi;T0F MS 和 TOF MS/MS 掃描范圍分別為:m/z 100-1500 和50-1200; 負(fù)離子檢測質(zhì)譜條件為：離子源:ESI源；離子噴霧電壓:-4.5kV;渦輪噴射溫度(TEM): 550°C;GS1:50 psi;GS2:50 psi;CUR:30psi;T0F MS 和 T0F-MS/MS掃描范圍分別為:m/z 200-1200和50-1200。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高通量檢測生物體血液樣本中113種脂質(zhì)的液質(zhì)聯(lián)用方 法，其特征在于:它還包括脂質(zhì)的相對定量檢測，檢測方法為以含19:0-19:0磷脂酰膽堿、 17:0-17:0磷脂酰乙醇胺、12:0鞘磷脂、19:0溶血磷脂酰膽堿的異丙醇-乙腈溶液為內(nèi) 標(biāo)，對生物樣品中檢測到的脂質(zhì)成分進(jìn)行相對定量，采用峰面積比值方法，每一類的化合物 對應(yīng)其內(nèi)標(biāo)進(jìn)行相對定量，若沒有相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的，采用保留時(shí)間相近的原則選擇內(nèi)標(biāo)進(jìn)行相 對定量。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高通量檢測生物體血液樣本中113種脂質(zhì)的液質(zhì)聯(lián)用方 法，其特征在于:所述梯度洗脫程序?yàn)?0.0 lmin時(shí)A相/B相的體積比為65/35，逐漸改變梯度 到2min變成A相/B相的體積比為20/80,進(jìn)一步改變梯度到9min變成A相/B相的體積比為0/ 100,并維持到15min，到16min變?yōu)槌跏紳舛華相/B相的體積比為65/35并維持到20min。
【文檔編號】G01N30/02GK106093227SQ201610380851
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】曹云峰, 孫曉宇, 洪沫, 房中則, 高鵬, 趙福榮, 趙欣慰, 董軍
【申請人】遼寧潤生康泰生物醫(yī)藥科技有限公司