一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，該方法包括如下工藝步驟：（1）樣品采集；（2）樣品溶液的制備；（3）脫鎂葉綠酸a含量測(cè)定；（4）蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量測(cè)定；（5）總黃酮含量測(cè)定；（6）確定鵝耳櫪葉最佳采收期。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單、快捷、明了，為測(cè)定歐洲鵝耳櫪中的活性物質(zhì)提供了方便，能有效確定歐洲鵝耳櫪葉的最佳采收時(shí)期，為歐洲鵝耳櫪活性物質(zhì)研究提供了技術(shù)支持。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，屬植物栽培技術(shù)與天然藥 物化學(xué)交叉領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 歐洲鸛耳櫪（Ca_rpi/3US Aeit/Jus)，樺木科落葉喬木。樹(shù)形清秀、質(zhì)地細(xì)膩、秋色葉 金黃，曾獲得過(guò)英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)獎(jiǎng)杯，可用作行道樹(shù)、庭院樹(shù)、綠蘺及盆景，是重要的園林 綠化樹(shù)種，在許多國(guó)家和地區(qū)得以廣泛應(yīng)用。
[0003] 目前，歐美國(guó)家對(duì)歐洲鵝耳櫪的研究處于領(lǐng)先的水平，尤其是在系統(tǒng)分類(lèi)、形態(tài)解 剖、地理分布研究等方面都已取得眾多成果。而國(guó)內(nèi)對(duì)歐洲鵝耳櫪的研究較少，內(nèi)容僅限于 其群落生態(tài)學(xué)、種質(zhì)資源、起源與演化、栽培繁殖技術(shù)等方面，而對(duì)歐洲鵝耳櫪的活性物質(zhì) 含量研究尚未報(bào)道。本發(fā)明以探索歐洲鵝耳櫪活性物質(zhì)含量的季節(jié)性變化綜合測(cè)定，以期 通過(guò)試驗(yàn)確定歐洲鵝耳櫪活性物質(zhì)含量最高的季節(jié)，對(duì)歐洲鵝耳櫪葉的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，確 定一種歐洲鵝耳櫪葉的最佳采收季節(jié)的方法，為歐洲鵝耳櫪生物活性物質(zhì)研究提供技術(shù)支 持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，其目的是提供一種確定歐洲鵝耳 櫪葉最佳采收期的方法，該方法利用高效液相色譜法測(cè)定了歐洲鵝耳櫪從3月份到10月份 的脫鎂葉綠酸a、蘆丁、槲皮素、山奈酚和異鼠李素的含量，并利用紫外-可見(jiàn)分光度法測(cè)定 了歐洲鵝耳櫪葉中總黃酮的含量，確定出歐洲鵝耳櫪葉的最佳采收季節(jié)，為歐洲鵝耳櫪生 物活性物質(zhì)研究提供技術(shù)支持。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案：一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，該方法包括如下 工藝步驟： (1) 樣品米集； (2) 樣品溶液的制備； (3) 脫鎂葉綠酸a含量測(cè)定； (4) 蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量測(cè)定； (5) 總黃酮含量測(cè)定； (6) 確定鸛耳櫪葉最佳采收期。
[0006] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):方法操作簡(jiǎn)單快捷，為測(cè)定歐洲鵝耳櫪中的活性物質(zhì)提供了方便， 能有效確定歐洲鵝耳櫪葉的最佳采收時(shí)期，為歐洲鵝耳櫪活性物質(zhì)研究提供了技術(shù)支持。
【附圖說(shuō)明】
[0007] 附圖1是脫鎂葉綠酸a標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜。
[0008] 附圖2是總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。
[0009] 附圖3是蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0010] -種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，該方法包括如下工藝步驟： (1) 樣品米集； (2) 樣品溶液的制備； (3) 脫鎂葉綠酸a含量測(cè)定； (4) 蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量測(cè)定； (5) 總黃酮含量測(cè)定； (6) 確定鸛耳櫪葉最佳采收期。
[0011] 所述步驟⑴樣品采集:在歐洲鵝耳櫪種植4年后，從3月到10月份，每月中旬，于晴 朗無(wú)風(fēng)、光照良好的上午，采集四年生歐洲鵝耳櫪葉片5 g作為待測(cè)樣品。
[0012] 所述步驟(2)中的樣品溶液分A樣品溶液和B樣品溶液，制備方法分別如下： A樣品溶液的制備:采集樣品在40°C烘箱中烘干，經(jīng)粉碎后過(guò)80目篩，取1 g樣品，100 ml乙酸乙酯浸漬，置于25°C750 r/ min搖床上震蕩1 h，加熱回流2 h，過(guò)濾，濾液在50°C減 壓下旋干，用1 ml甲醇溶解，搖勻，得A樣品溶液，于-20°C保存，以備脫鎂葉綠酸a含量測(cè)定； B樣品溶液的制備:采集樣品在40°C烘箱中烘干，經(jīng)粉碎后過(guò)80目篩，取3 g樣品，置于 圓底燒瓶中，加入100 ml石油醚，70°C回流1 h，過(guò)濾后棄去濾液，加入20 ml石油醚，振蕩?kù)o 置分層，棄去石油醚溶解物得萃取后的固相，萃取4次，除去脂溶性雜質(zhì)，保留剩余固體，加 入100 ml甲醇，70°C回流6 h，過(guò)濾至錐形瓶中，經(jīng)超聲處理(功率150 W;溫度70°C;時(shí)間10 min)后;將濾液倒入清洗干凈的圓底燒瓶中，減壓回收提取液中的溶劑甲醇，得浸膏，使用 10 ml HPLC級(jí)甲醇稀釋溶劑，搖勻，得B樣品溶液，于-20°C保存?zhèn)溆茫詡渌姆N黃酮類(lèi)成分 及總黃酮含量測(cè)定。
[0013] 所述步驟(3)脫鎂葉綠酸a含量測(cè)定，由以下步驟組成： ① 確定高效液相色譜測(cè)試條件:操作波長(zhǎng)是408 nm，Ci8色譜柱:250 mmX 4.6 mm，5 μ m;柱溫:50°C ;流動(dòng)相：由0.1%(V/V)甲酸的乙腈和0.1%(V/V)甲酸的水，二者梯度變化:0.1% (V/V)甲酸的乙腈分別為0分鐘80%，5分鐘90%，22分鐘90%，22.1分鐘80%(V/V);流速：0.6 ml/min，注入量:10 μL，洗脫時(shí)間：35 min; ② 稱(chēng)取在100 °C減壓干燥至恒重的脫鎂葉綠酸a對(duì)照品0.2 mg于1 ml試管中，加少許 甲醇置40°C水浴中加熱溶解，冷卻，用甲醇定容至1 ml刻度，即為0.2 mg/ml的脫鎂葉綠酸 a對(duì)照品溶液，搖勻； ③吸取脫鎂葉綠酸a對(duì)照品溶液0.05, 0.1，0.2，0.4, 0.8 μL于1 ml試管中，分別 加1 ml甲醇搖勻，即濃度分別為0.1，0.2, 0.4, 0.8，1.6 μg/ml;A樣品溶液與脫鎂葉綠 酸a對(duì)照品各濃度溶液分別取10 μL進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣3次，在最大吸收波長(zhǎng)408 nm處測(cè)定樣 品峰面積，以脫鎂葉綠酸a對(duì)照品各點(diǎn)化合物峰面積均值為縱坐標(biāo)，各點(diǎn)化合物溶液質(zhì)量濃 度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求算回歸方程，再根據(jù)A樣品溶液測(cè)定的峰面積計(jì)算出在歐洲 鵝耳櫪葉片中相應(yīng)的含量。
[0014] 所述步驟(4)蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量測(cè)定，由以下步驟組成： ①確定高效液相色譜測(cè)試條件:操作波長(zhǎng)是368 nm;Ci8色譜柱：250 mmX 4.6 mm，5 μ m;柱溫:40°C ;流動(dòng)相：乙腈和0.1%(V/V)甲酸的水，二者梯度變化：乙腈分別為0分鐘10%， 15分鐘40%，40分鐘60%，41分鐘60%(V/V)，48分鐘60%，流速是0.8 ml / min，注入量是10 μ 1，洗脫時(shí)間:48分鐘;通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積測(cè)量值記錄定量值； ②分別稱(chēng)取9.7 mg蘆丁，9.6 mg槲皮素，0.5 mg山奈酸，異鼠李素 0.4 mg于50 ml試管 中，加入40 ml甲醇進(jìn)行溶解，搖勻，配成標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，于-20°C保存，以備四種黃酮類(lèi)成 分的含量測(cè)定； 所述步驟（5)總黃酮含量測(cè)定：精密稱(chēng)取在120°C減壓干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品30 mg于100 ml容量瓶中，加 80% (V/V)的乙醇置水浴中加熱溶解，冷卻，用80% (V/V)的乙 醇定容至刻度，即為0.3 mg/ml的蘆丁對(duì)照品溶液，搖勻。準(zhǔn)確吸取該蘆丁對(duì)照品溶液0， 0.1，0.2, 0.4, 0.8，1.6, 3.2 ml分別置于25 ml容量瓶中，分別加 30% (V/V)乙醇溶液 至 5 ml;加 5% (m/V) NaN02 溶液0.3 ml，搖勻，放置6 min;再加 10% (m/V) A1(N03)3 溶液 0.3 ml，搖勻，放置6 min;加 4% (m/V) NaOH溶液4 ml，用蒸餾水定容至10 ml，搖勻，濃度 分別為〇，3, 6，12，24，48，96 μg/ml放置15-20 min。各取200 μL至酶標(biāo)儀板后，在最 大吸收波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度(Α)為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度(C)為 橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出回歸方程。然后根據(jù)B樣品溶液的吸光度和蘆丁對(duì)照品的標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定B樣品溶液中總黃酮的含量，根據(jù)B樣品溶液的質(zhì)量與原樣品質(zhì)量的比例，通 過(guò)計(jì)算得到歐洲鵝耳櫪葉中總黃酮的含量，完成一種歐洲鵝耳櫪葉的質(zhì)量檢測(cè)方法。
[0015] 所述步驟(6)確定歐洲鵝耳櫪葉最佳采收期：綜合所測(cè)3-10月份的脫鎂葉綠酸a、 總黃酮、蘆丁、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量，評(píng)價(jià)歐洲鵝耳櫪葉的質(zhì)量，篩選活性物質(zhì)含 量最高對(duì)應(yīng)的季節(jié)，完成一種確定歐洲鵝耳櫪葉最佳采收期的方法。
[0016] 本發(fā)明考慮到歐洲鵝耳櫪葉中含有具有光動(dòng)力特性的脫鎂葉綠酸a化合物，利用 高效液相色譜法測(cè)定歐洲鵝耳櫪脫鎂葉綠酸a從3月份到10月份的含量;考慮到歐洲鵝耳櫪 葉中含有多種黃酮類(lèi)成分，主要以蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素為主，因此本發(fā)明以這四 種成分作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，通過(guò)高效液相色譜測(cè)定，得到各標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品對(duì)應(yīng)色譜峰的峰面積， 利用外標(biāo)法測(cè)定樣品中蘆丁、槲皮素、山奈酚和異鼠李素從3月份到10月份的含量;還考慮 到歐洲鵝耳櫪中其他黃酮類(lèi)成分，因此本發(fā)明利用紫外-可見(jiàn)分光光度法，采用蘆丁作為標(biāo) 準(zhǔn)對(duì)照品，硝酸鋁與黃酮類(lèi)化合物形成配合物的顯色原理進(jìn)行測(cè)定，完成一種歐洲鵝耳櫪 葉的質(zhì)量檢測(cè)方法，篩選出最佳采收期。
[0017] 根據(jù)所選月份的不同，測(cè)定不同月份歐洲鵝耳櫪葉中脫鎂葉綠酸a、四種黃酮類(lèi)成 分及總黃酮的含量，具體如下表：
從上表中可以看出，4月份的脫鎂葉綠酸a含量最高達(dá)0.564 mg/g，7月份采集的歐洲鵝 耳櫪葉片中蘆丁、槲皮素、山奈酚含量最高分別為19.05,19.05，0.077mg/g，5月份的異鼠李 素含量最高為0.89 mg/g, 6月份采集的歐洲鸛耳櫪總黃酮含量最高為98.68 mg/g，由于歐 洲鵝耳櫪葉內(nèi)總黃酮除蘆丁、槲皮素、山奈酚和異鼠李素外還含有其他黃酮類(lèi)化合物，而6 月份采集的歐洲鵝耳櫪葉總黃酮含量最高，且6月份歐洲鵝耳櫪葉內(nèi)脫鎂葉綠酸a含量為 0.393 mg/g，相比最高含量0.564 mg/g差距不大，，歐洲鵝耳櫪葉的活性物質(zhì)含量主要集中 在7月份，因此，歐洲鵝耳櫪葉最佳采收期為7月。
[0018]前述具體示例性實(shí)施方案的描述時(shí)為了說(shuō)明和例證的目的，這些描述并非想將 本發(fā)明限定為所公開(kāi)的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化， 對(duì)示例性實(shí)施方案進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而 本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的 選擇和改變，本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書(shū)及其等同形式所限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，其特征在于該方法包括如下工藝步驟： (1) 樣品米集； (2) 樣品溶液的制備； (3) 脫鎂葉綠酸a含量測(cè)定； (4) 蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量測(cè)定； (5) 總黃酮含量測(cè)定； (6) 確定歐洲鵝耳櫪葉最佳采收期。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，其特征在于所述步驟 (1)樣品采集:從3月到10月份，每月中旬，采集四年生歐洲鵝耳櫪葉片5 g作為待測(cè)樣品。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，其特征在于所述步驟 (2 )樣品溶液的制備;所述的樣品溶液分A樣品溶液和B樣品溶液，各自的制備方法分述如 下： A樣品溶液的制備：采集樣品在40°C烘箱中烘干，經(jīng)粉碎后過(guò)80目篩，取1 g樣品，100 ml乙酸乙酯浸漬，置于25°C750 r/ min搖床上震蕩1 h，加熱回流2 h，過(guò)濾，濾液在50°C減 壓下旋干，用1 ml甲醇溶解，搖勻，得A樣品溶液于-20°C保存?zhèn)溆?，以備脫鎂葉綠酸a含量測(cè) 定； B樣品溶液的制備:采集樣品在40°C烘箱中烘干，經(jīng)粉碎后過(guò)80目篩，取3 g樣品，置于 圓底燒瓶中，加入100 ml石油醚，70°C回流1 h，過(guò)濾后棄去濾液，加入20 ml石油醚，振蕩?kù)o 置分層，棄去石油醚溶解物得萃取后的固相，萃取4次，除去脂溶性雜質(zhì)，保留剩余固體，加 入100 ml甲醇，70°C回流6 h，過(guò)濾至錐形瓶中，在功率150 W、溫度70°C條件下超聲處理時(shí) 間10 min，將濾液倒入清洗干凈的圓底燒瓶中，減壓回收提取液中的溶劑甲醇，得浸膏，使 用10 ml HPLC級(jí)甲醇稀釋溶劑，搖勻，得B樣品溶液，于-20°C保存，以備四種黃酮類(lèi)成分及 總黃酮含量測(cè)定。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，其特征在于所述步驟 (3)脫鎂葉綠酸a含量測(cè)定，由以下步驟組成： ① 確定高效液相色譜測(cè)試條件:操作波長(zhǎng)是408 nm，Ci8色譜柱:250 mmX4.6 mm，5 μπι; 柱溫:50°C ;流動(dòng)相：由含0.1%(V/V)甲酸的乙腈和含0.1%(V/V)甲酸的水組成，二者梯度變 化:含0.1%(V/V)甲酸的乙腈分別為0分鐘80%，5分鐘90%，22分鐘90%，22.1分鐘80%;流速： 0.6 ml/min，注入量:10 μL，洗脫時(shí)間：35 min; ② 稱(chēng)取在100 °C減壓干燥至恒重的脫鎂葉綠酸a對(duì)照品0.2 mg，放于1 ml試管中，加 甲醇置40°C水浴中加熱溶解，冷卻，用甲醇定容至1 ml刻度，即為0.2 mg/ml的脫鎂葉綠酸 a對(duì)照品溶液，搖勻； ③ 吸取脫鎂葉綠酸a對(duì)照品溶液0.05，0.1，0.2, 0.4，0.8 μL對(duì)應(yīng)于1 ml試管中，分 別加1 ml甲醇搖勻，即濃度分別為0.1，0.2, 0.4, 0.8，1.6 μg/ml;A樣品溶液與脫鎂葉 綠酸a對(duì)照品各濃度溶液分別取10 μL進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣3次，在最大吸收波長(zhǎng)408 nm處測(cè)定 樣品峰面積，以脫鎂葉綠酸a對(duì)照品各點(diǎn)化合物峰面積均值為縱坐標(biāo)，各點(diǎn)化合物溶液質(zhì)量 濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求算回歸方程，再根據(jù)A樣品溶液測(cè)定的峰面積計(jì)算出在歐 洲鵝耳櫪葉片中相應(yīng)的含量。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，其特征在于所述步驟 (4) 蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量測(cè)定，由以下步驟組成： ① 確定高效液相色譜測(cè)試條件:操作波長(zhǎng):368 nm;Ci8色譜柱:250 mmX4.6 mm，5 μπι; 柱溫:40°C ;流動(dòng)相：乙腈和含0.1%(V/V)甲酸的水，二者梯度變化：乙腈分別為0分鐘10%， 15分鐘40%，40分鐘60%，41分鐘60%，48分鐘60%，流速是0.8 ml / min，注入量是10 μL，洗 脫時(shí)間:48分鐘;通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積測(cè)量值記錄定量值； ② 分別稱(chēng)取9.7 mg蘆丁，9.6 mg槲皮素，0.5 mg山奈酸，異鼠李素 0.4 mg于50 ml試管 中，加入40 ml甲醇進(jìn)行溶解，搖勻，配成標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，于-20°C保存，以備四種黃酮類(lèi)成 分的含量測(cè)定。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，其特征在于所述步驟 (5) 總黃酮含量測(cè)定:精密稱(chēng)取在120°C減壓干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品30 mg于100 ml容 量瓶中，加80% (V/V)的乙醇置水浴中加熱溶解，冷卻，用80% (V/V)的乙醇定容至刻度， 即為0.3 mg/ml的蘆丁對(duì)照品溶液，搖勻； 準(zhǔn)確吸取該蘆丁對(duì)照品溶液〇, 0.1，0.2, 0.4, 0.8，1.6, 3.2 ml分別置于25 ml容 量瓶中，分別加 30% (V/V)乙醇溶液至5 ml;加 5% (m/V) NaN02溶液0.3 ml，搖勻，放置6 min;再加 10% (m/V) Α1(Ν〇3)3溶液0.3 ml，搖勾，放置6 min;加4% (m/V) NaOH 溶液4 ml， 用蒸餾水定容至10 ml，搖勻，濃度分別為0，3，6，12，24，48，96 μg/ml放置15-20 min； 各取200 μL至酶標(biāo)儀板后，在最大吸收波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度(A)為縱 坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出回歸方程； 然后根據(jù)B樣品溶液的吸光度和蘆丁對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定B樣品溶液中總黃酮的含 量，根據(jù)B樣品溶液的質(zhì)量與原樣品質(zhì)量的比例，通過(guò)計(jì)算得到歐洲鵝耳櫪葉中總黃酮的 含量，完成一種歐洲鵝耳櫪葉的質(zhì)量檢測(cè)方法。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種確定歐洲鵝耳櫪葉采收期的方法，其特征在于所述步驟 (6) 確定歐洲鵝耳櫪葉最佳采收期:綜合所測(cè)3-10月份的脫鎂葉綠酸a、總黃酮、蘆丁、槲皮 素、山奈酚和異鼠李素含量，評(píng)價(jià)歐洲鵝耳櫪葉質(zhì)量，篩選活性物質(zhì)含量最高對(duì)應(yīng)的季節(jié)， 完成一種確定歐洲鵝耳櫪葉最佳采收期的方法。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK106093249SQ201610716119
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月25日
【發(fā)明人】祝遵崚, 圣倩倩
【申請(qǐng)人】南京林業(yè)大學(xué)