一種玉米赤霉烯酮類毒素的富集凈化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種玉米赤霉烯酮類毒素的富集凈化方法，該方法是將以多壁碳納米管為原料合成的磁性納米材料加入到農(nóng)產(chǎn)品的樣品提取液中，進(jìn)行毒素吸附，用磁鐵將含有玉米赤霉烯酮類毒素的磁性納米材料聚集，移去上清液，加入解吸附溶液解吸付后即獲得含目標(biāo)物的濃縮液。本發(fā)明的玉米赤霉烯酮類毒素的富集凈化方法穩(wěn)定、快速、成熟，能夠適用于玉米中的六種玉米赤霉烯酮類毒素的同時(shí)富集凈化，適用范圍廣，凈化效果好。
【專利說明】
一種玉米赤霉烯酮類毒素的富集凈化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種玉米赤霉烯酮類毒素的 富集凈化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米赤霉烯酮類毒素是一類由鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素，主要包括玉米赤霉烯酮 (ZEN)及其衍生物玉米赤霉酮(ΖΑΝ)、α-玉米赤霉烯醇(a-Z0L)、a-玉米赤霉醇(a-ZAL)、f3_玉 米赤霉烯醇(β-ZOL)和β-玉米赤霉醇(β-ZAL)六種。這類毒素主要存在于玉米、小麥、大麥、 大米等作物及其制品中，有較強(qiáng)的生殖毒性，可引起動(dòng)物雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致動(dòng)物不孕或流 產(chǎn)，給畜牧業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失，在食品中的污染可引起兒童性早熟。
[0003] 現(xiàn)有的食品、農(nóng)產(chǎn)品中玉米赤霉烯酮類毒素的富集凈化方法主要是固相萃取柱凈 化，商業(yè)化的固相萃取柱主要有HLB柱、免疫親和柱等。但是，商品化的固相萃取柱價(jià)格昂 貴，大多針對(duì)某一種毒素凈化，無法實(shí)現(xiàn)多種毒素同時(shí)凈化的目的，并且固相萃取柱大多需 要上樣、淋洗、洗脫等多步操作，過程繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。目前，尚缺乏一種價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn) 便、快速的富集凈化方法，可以同時(shí)、有效地富集凈化農(nóng)產(chǎn)品中的六種玉米赤霉烯酮類毒 素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種玉米赤霉烯酮類毒素的富集凈化方法，該方法包括如 下步驟：
[0005] 將以多壁碳納米管為原料合成的磁性納米材料加入到農(nóng)產(chǎn)品的樣品提取液中，進(jìn) 行毒素吸附，用磁鐵將含有玉米赤霉烯酮類毒素的磁性納米材料聚集，移去上清液，加入解 吸附溶液解吸付后即獲得含目標(biāo)物的濃縮液；
[0006] 該方法可以同時(shí)富集凈化農(nóng)產(chǎn)品如玉米中的六種玉米赤霉烯酮類毒素。
[0007] 其中所述的多壁碳納米管為多種型號(hào)的多壁碳納米管(如型號(hào)(8nm i.d.，10_30μ m length，500m2/g)及其相當(dāng)者）；
[0008] 其中所述的磁性納米材料是通過如下方法制備得到的：
[0009] 多壁碳納米管中加入水（多壁碳納米管與水的質(zhì)量/體積比（mg/ml)為：1:0.1-10)，超聲0. 1-2h后，轉(zhuǎn)移到30-80°C恒溫水浴鍋中，邊攪拌邊通氮?dú)?. 1-2h;然后加入六水 合氯化鐵和四水合氯化亞鐵，其中多壁碳納米管、六水合氯化鐵、四水合氯化亞鐵的用量比 例為 1-500:0.1-100:0. l-100(m/m/m)，反應(yīng)0. 1-2h后，調(diào)節(jié)pH至 10-14，繼續(xù)反應(yīng)0. l-5h;整 個(gè)反應(yīng)過程中，都保持30-80°C恒溫、攪拌及通氮?dú)?反應(yīng)完成后，容器下方用磁鐵吸附，棄 上層液體，加水清洗沉淀物，最后將沉淀物烘干，研磨成粉末，即為所需的磁性納米材料。 [0010]其中所述的樣品提取液為:將樣品加入乙腈水溶液聲提取l_3h，氮?dú)獯抵两?，?加入吸附液，得樣品提取液;其中吸附液為甲醇水溶液或乙腈水溶液;其中乙腈水溶液或甲 醇水溶液中甲醇或乙腈的體積比例為〇. 1-50% ;
[0011] 其中毒素吸附時(shí)間為l_60min;
[0012] 毒素吸附的方式為渦旋、震蕩或超聲中的一種或兩種；
[0013] 解吸附溶液為含0.1-5% (v/v)甲酸的甲醇、含0.1-5% (v/v)甲酸的乙腈或者含 0.1-5% (v/v)甲酸的丙酮；
[0014] 解吸附時(shí)間為l-60min;
[0015] 解吸附的方式為渦旋、震蕩或超聲中的一種或兩種。
[0016] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0017] (1)首次采用具有大比表面積的磁性納米材料作為吸附材料，用于同時(shí)富集凈化 農(nóng)產(chǎn)品如玉米中的六種玉米赤霉烯酮類毒素。該磁性納米材料對(duì)目標(biāo)物具有很好的吸附性 能，能夠顯著除去干擾雜質(zhì)；
[0018] (2)自制的新型磁性納米材料合成步驟簡(jiǎn)單，不依賴特殊儀器，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)均可 制備；
[0019] (3)磁性固相萃取遵循通用的吸附、解吸付步驟，屬于常規(guī)使用方法，一般實(shí)驗(yàn)人 員簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可使用，不需要特殊儀器設(shè)備，實(shí)用性強(qiáng)；
[0020] (4)與固相萃取相比，磁性固相萃取操作更為簡(jiǎn)便，不需要上柱、淋洗、洗脫等步 驟，不需要固相萃取儀，只需一塊磁鐵和燒杯即可完成，實(shí)驗(yàn)流程較快，整個(gè)過程不超過1小 時(shí)；
[0021] (5)多壁碳納米管、六水合氯化鐵以及四水合氯化亞鐵均可以商品化得到，價(jià)格低 廉，若以單次磁性固相萃取使用量為20mg，那單次材料價(jià)格不超過5元，與現(xiàn)有的商品化固 相柱相比，在保證凈化效果的同時(shí)，大大節(jié)約了時(shí)間、節(jié)省了成本；
[0022] (6)本發(fā)明的凈化方法穩(wěn)定、快速、成熟，能夠適用于玉米中的六種玉米赤霉烯酮 類毒素的同時(shí)富集凈化，適用范圍廣，凈化效果好。
【附圖說明】
[0023] 圖1為發(fā)明實(shí)例中自制的新型磁性納米材料透射電鏡圖。
[0024] 圖2為發(fā)明實(shí)例中磁性固相萃取的步驟圖。
[0025]圖3為發(fā)明實(shí)例中玉米未通過和通過磁性固相萃取凈化表觀特征的比較。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：
[0027] 用于玉米赤霉烯酮類毒素凈化富集的磁性固相萃取步驟見圖2,主要為吸附和解 吸附過程。
[0028]實(shí)施1:玉米中六種玉米赤霉烯酮類毒素的富集凈化
[0029] 第一步，合成磁性納米材料：300mg多壁碳納米管（8nm i ·(!·，10-30μηι length, 500m2/g)(南京先豐納米材料科技有限公司）中加入250mL去離子水，超聲lh后，轉(zhuǎn)移到60 °C 恒溫水浴鍋中，邊攪拌邊通氮?dú)?.5h以排盡反應(yīng)環(huán)境中的氧氣。加入0.81g六水合氯化鐵和 0.30g四水合氯化亞鐵反應(yīng)0.5h后，用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至12，繼續(xù)反應(yīng)2h。整 個(gè)反應(yīng)過程中，都保持60°C恒溫、持續(xù)攪拌及通氮?dú)狻７磻?yīng)完成后，容器下方用磁鐵吸附，棄 上層液體，加適量去離子水清洗沉淀物，反復(fù)三次，最后將沉淀物在80°C烘干，研磨成粉末， 即為磁性納米材料。
[0030]第二步，制備樣品提取液：取2g粉碎的玉米樣品粉末（上海市售隨機(jī)樣本）置于 50mL離心管，加10mL乙腈水溶液(84/16，v/v)超聲提取lh，取5mL提取液氮?dú)獯抵两桑尤?5mL的乙腈/水溶液(5/95，v/v)，得樣品提取液；
[0031 ]第三步，吸附：向上述樣品提取液中加入20mg第一步制備得到的磁性納米材料，禍 旋3min，離心管底部放置一塊磁鐵，使吸附劑聚集，棄去上層液體；
[0032] 第四步，解吸附：向離心管中加入5mL含0.5 %甲酸的丙酮溶液，禍旋0.5min，超聲 3min，用磁鐵聚集吸附劑，收集上清液，重復(fù)此步驟，合并兩次共10mL解吸附液，氮?dú)獯蹈桑?用lmL乙腈定容，過膜后進(jìn)LC-MS/MS分析；
[0033] 第五步，檢測(cè)：采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(UHPLC-XEVO TQ-S，Waters公司，美 國(guó)）對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。液相條件為:流動(dòng)相為(A)5mmol/L的醋酸銨水溶液；（B)甲醇。線性梯 度洗脫：初始：50%B，4min 70%B，6-7min 75%B，7.2min 50%B，平衡1.8min，總運(yùn)行時(shí)間 為9min。進(jìn)樣體積為3yL。質(zhì)譜條件為:離子源溫度：150°C ;脫溶劑氣溫度:500°C ;錐孔氣和 脫溶劑氣流量分別是30和1000L/h。采用MRM法檢測(cè)，具體各個(gè)毒素的檢測(cè)參數(shù)見表1。
[0034]表1.玉米赤霉烯酮類毒素的質(zhì)譜參數(shù)
[0035]
[0036] *表示定量離子。
[0037] 結(jié)果：
[0038] (1)材料表征:磁性納米材料的透射電鏡圖如圖1所示：100nm尺寸下可見中空的細(xì) 管(多壁碳納米管)上均勻分布著小黑點(diǎn)(具有磁性的四氧化三鐵納米粒子），說明成功合成 了磁性納米材料；
[0039] (2)表觀特征:如圖3所示:從表觀上看，經(jīng)過以磁性納米材料為吸附劑的磁性固相 萃取過程凈化后的玉米樣品液，與未凈化樣品液相比，明顯澄清透明，且經(jīng)過凈化的樣品 液，完全可以除去色素等大多數(shù)干擾雜質(zhì)，可以達(dá)到凈化的目的；
[0040] (3)樣品凈化后基質(zhì)干擾去除情況：基質(zhì)的干擾情況采用信號(hào)增益或抑制程度 (SSE)進(jìn)行評(píng)估，分別配制濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200和500即/11^的六 種毒素的乙腈溶液和玉米基質(zhì)溶液，測(cè)線性，其斜率之比為SSE。凈化前后的玉米基質(zhì)溶液 中六種毒素 SSE范圍分別為69.9-127.6%和92.1-103.8%，表明凈化過程有效消除了基質(zhì) 干擾；
[00411 (4)方法的回收率驗(yàn)證:采用基質(zhì)加標(biāo)法對(duì)方法的回收率進(jìn)行考察，向玉米樣品中 添加低、中、高三個(gè)濃度水平(5yg/kg，50yg/kg和200yg/kg)的六種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，以原樣 本為對(duì)照組，各平行三份實(shí)驗(yàn)。樣品按照上述步驟凈化后檢測(cè)，回收率結(jié)果為75.8-104.1% ；
[0042] (5)方法的精密度驗(yàn)證:在同一天內(nèi)，平行5份樣品進(jìn)行試驗(yàn)，純化檢測(cè)后得到日內(nèi) 精密度:3.4-11.2%;連續(xù)3天，每天平行5份樣品進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)計(jì)算后得到日間精密度： 3.2-13.2%。
[0043]綜上可見，本發(fā)明的磁性固相萃取方法，可以有效的對(duì)玉米中的六種玉米赤霉烯 酮類毒素富集凈化，具有明顯的凈化效果，每份所用的磁性納米材料制備成本不超過5元， 經(jīng)凈化后的玉米樣品基本不受基質(zhì)干擾，明顯優(yōu)于現(xiàn)有的分析方法，并且回收率高，精密度 好。與現(xiàn)有的商品化固相萃取柱相比，在保證甚至優(yōu)于其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性的前提下，極大的 簡(jiǎn)化了凈化步驟，縮短了時(shí)間，節(jié)省了成本，顯著的降低了基質(zhì)干擾，明顯提高了方法靈敏 度。
[0044]本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于實(shí)施例中所作的描述，不偏離本發(fā)明方案中心的修改 都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種玉米赤霉烯酮類毒素的富集凈化方法，其特征在于該方法為： 將以多壁碳納米管為原料合成的磁性納米材料加入到農(nóng)產(chǎn)品的樣品提取液中，進(jìn)行毒 素吸附，用磁鐵將含有玉米赤霉烯酮類毒素的磁性納米材料聚集，移去上清液，加入解吸附 溶液解吸附后即獲得含目標(biāo)物的濃縮液； 其中所述的樣品提取液為:將樣品加入乙腈水溶液聲提取l-3h，氮?dú)獯抵两桑偌尤?吸附液，得樣品提取液;其中吸附液為甲醇水溶液或乙腈水溶液;其中乙腈水溶液或甲醇水 溶液中甲醇或乙腈的體積比例為〇. 1-50% ; 其中解吸附溶液為含〇. 1-5%甲酸的甲醇、含0.1-5%甲酸的乙腈或者含0.1-5%甲酸 的丙酮。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米赤霉烯酮類毒素的富集凈化方法，其特征在于其中所述 的磁性納米材料是通過如下方法制備得到的： 多壁碳納米管中加入水，超聲〇.1-2h后，30-80°C恒溫水浴，邊攪拌邊通氮?dú)?然后加入 六水合氯化鐵和四水合氯化亞鐵，其中多壁碳納米管、六水合氯化鐵、四水合氯化亞鐵的用 量比例為1-500:0.1-100:0.1-100，反應(yīng)0.1-2h后，調(diào)節(jié)pH至10-14,繼續(xù)反應(yīng)0.1-5h;反應(yīng) 完成后，容器下方用磁鐵吸附，棄上層液體，加水清洗沉淀物，最后將沉淀物烘干，研磨成粉 末，即為所需的磁性納米材料。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米赤霉烯酮類毒素的富集凈化方法，其特征在于： 其中毒素吸附時(shí)間為l-60min; 毒素吸附的方式為渦旋、震蕩或超聲中的一種或兩種； 解吸附時(shí)間為l_60min; 解吸附的方式為渦旋、震蕩或超聲中的一種或兩種。
【文檔編號(hào)】G01N30/08GK106093254SQ201610719869
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月24日
【發(fā)明人】韓錚, 趙志輝, 董茂鋒, 蔣可秋, 郭文博, 范楷, 聶冬霞
【申請(qǐng)人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院