一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測方法及檢測芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種外泌體分離、富集和檢測的集成檢測方法，包括：設(shè)計和組裝雙膜過濾芯片，構(gòu)建芯片ELISA檢測標準曲線，樣本收集、注樣和清洗，芯片ELISA檢測，數(shù)據(jù)處理分析。本發(fā)明還提供一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測芯片。本發(fā)明的反應體系與檢測方法，可用于檢測膀胱癌患者尿液樣本或膀胱癌細胞系培養(yǎng)液上清中外泌體的含量，本方法具有高度特異性的特點，且不會對人體造成任何影響或創(chuàng)傷，檢測方法也不需要昂貴且精密的實驗儀器（如超速離心機、熒光顯微鏡），具有很大的應用前景。
【專利說明】
一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測方法及檢測芯片
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及開發(fā)一種集成尿液外泌體分離、富集及ELISA檢測的微流體芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤。是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位，而在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居第2位。檢查方法包括尿常規(guī)檢查、尿脫落細胞學、尿腫瘤標記物、腹部和盆腔B超等檢查。根據(jù)上述檢查結(jié)果決定是否行膀胱鏡、靜脈尿路造影、盆腔CT或/和盆腔MRI等檢查明確診斷。其中，膀胱鏡檢查是診斷膀胱癌的最主要方法。然而膀胱鏡檢測費用高，并不適用于基層醫(yī)療單位或者貧困地區(qū)的普及應用，臨床上亟待尋找一種針對膀胱癌檢測的生物標志物來進行檢測。外泌體(exosomes)是一種直徑約為40-120nm，具有雙層質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡，由細胞通過胞吐作用釋放至細胞外隙或生物學體液中。近年來，外泌體成為新的研究熱點，因其內(nèi)包含來源細胞所特有的mRNAs、micr0RNAs及蛋白等多種信號分子，在信號傳導和免疫系統(tǒng)中起重要作用，并由完整的膜性結(jié)構(gòu)包裹而減少微環(huán)境干擾，這使其在疾病診斷方面具有獨特的優(yōu)越性，是研究生物標志物和進行腫瘤免疫的新的生物材料，同時也具有治療潛力。
[0003]目前針對外泌體的研究主要分為分離技術(shù)和檢測技術(shù)。分離技術(shù)包括超速離心法、過濾離心法、密度梯度超速離心法、免疫磁珠結(jié)合超速離心法和色譜法等。檢測技術(shù)主要包括:掃描電子顯微鏡觀察形態(tài)(但SEM對樣品的預處理和制備上面要求較高，樣品的準備階段比較復雜，不適合對外泌體進行大量快速的測量，而且由于外泌體經(jīng)過了預處理和制備過程，無法準確的進行外泌體濃度的測量)、動態(tài)光散射技術(shù)(但由于動態(tài)光散射技術(shù)是測量光強的波動數(shù)據(jù)，所以大顆粒的光強波動信號會掩蓋較小顆粒的光強波動信號，所以動態(tài)光散射不適合大小不一的復雜外泌體樣本的測量，只適合通過色譜法制備的大小均一的外泌體的尺寸測量，并且無法測量樣品中外泌體的濃度。)、流式細胞儀檢測技術(shù)(流式細胞儀不僅可以檢測囊泡的大小、數(shù)量，而且通過熒光標記可以檢測囊泡的來源，將囊泡進行分類，因此，流式細胞儀是進行囊泡快速、高通量、多參數(shù)檢測的最優(yōu)選擇。然而，傳統(tǒng)流式細胞儀針對的樣本主要是細胞，散射光的檢測極限通常是300-500nm，而大多數(shù)細胞外囊泡的直徑都在300nm以下，因此很難進行精確地定量和定性分析。)、納米微粒追蹤分析技術(shù)(是一種比較新穎的研究納米顆粒的方法，可以直接和實時的觀測納米顆粒。由于外泌體表面有標志物CD9、CD63等跨膜分子的存在，在復雜的背景環(huán)境下(如血清中)，可以用熒光抗體標記外泌體，再用NTA的熒光測量功能實現(xiàn)在復雜背景下對外泌體的測量，但是需要精密的儀器)、流式細胞儀分析技術(shù)(但是流式細胞分析一次只能針對一個標志物進行檢測，夕卜泌體太小，由目前的流式細胞儀設(shè)備檢測，有必要先綁定外來抗體包被的磁珠，需要精密的儀器設(shè)備，且操作繁瑣、敏感度各異)、免疫印跡檢測技術(shù)(操作過程復雜)和熒光定量PCR檢測分析microRNA(提取核酸步驟復雜，需要昂貴的實驗儀器)。因此，發(fā)展一種能夠可靠、快速、經(jīng)濟地無創(chuàng)檢測外泌體尤其是膀胱癌患者來源的外泌體的方法非常必要。微流體芯片微流體芯片實驗室，是指把生物和化學等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物與化學反應、分離檢測等基本操作單位集成或基本集成一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學反應過程，并對其產(chǎn)物進行分析的一種技術(shù)。是生命科學、化學科學與信息科學信號檢測和處理方法研究的重要技術(shù)平臺。具有集成性、分析速度快、高通量、能耗少、污染小、廉價、安全等特點。因此，構(gòu)建一種集成外泌體分離、富集、檢測為一體的微流體芯片，擁有巨大的經(jīng)濟效益。
[0004]外泌體在尿液中可以穩(wěn)定存在，尤其是尿液樣品可以在非創(chuàng)傷性損傷的前提下大量獲得。因此，如果能夠檢測尿液外泌體中的癌癥信息，則有望將其用于癌癥的無創(chuàng)診斷、監(jiān)控等臨床應用。然而，實際上，由于單位體積尿液中的外泌體含量非常低，采用一般方法單次提取得到的外泌體，根本無法滿足后續(xù)檢測的要求，所以目前針對外泌體的檢測主要是先對樣本中的外泌體進行濃縮處理，之后再采取一定的表征測量。因此，本發(fā)明針對上述問題，研制了一種集成外泌體分離、富集和檢測為一體的微流體芯片，同時利用外泌體跨膜蛋白⑶63這一特有的標志物，建立了一種芯片ELISA快速診斷方法。該方法在膀胱癌患者外泌體檢測、監(jiān)測等方面具有一定的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種外泌體分離、富集和檢測的集成檢測方法，該方法為外泌體芯片ELISA檢測方法，可有效檢測膀胱癌患者體內(nèi)外泌體的量，檢測結(jié)果特異性強，實用性強。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測方法，其特征在于，包括如下具體步驟:
I)設(shè)計和組裝雙膜過濾芯片:所述雙膜過濾芯片為四層PMMA板，從上至下的每一層厚度分別為2 mm, I mm, I mm,和2 mm,芯片外徑尺寸為20 I 40 I 6 mm，相鄰兩層PMMA板之間用雙面膠(DSA)連接，中間兩層PMMA板上分別切割有上下位置一致的進液孔和廢液排出孔，最上層的PMMA板為切割有直徑1.8 mm的兩個圓孔的PMMA板層;第二層為切割有直徑10 mm的兩個圓孔的PMMA板層;第三層為割有直徑10 mm的兩個圓孔，同時兩個圓孔之間用寬度1.5mm，長度為I Imm的渠道相連的PMMA板層;最后一層，為PMMA平板。其中，中間兩層PMMA板之間設(shè)有兩層DSA膠，這兩層DSA膠之間粘附有孔徑分別為200nm和30nm的聚碳酸酯膜(如圖1)，用于液體的過濾和外泌體的收集。
[0007]2)構(gòu)建芯片ELISA檢測標準曲線:
①收集膀胱癌患者尿液樣本200mL，采用超速離心方法(2，OOOg室溫離心10-15min，并去除細胞及其碎片，將上清液用100，000 g轉(zhuǎn)速超離l_2h，后用pH 7.4的I3BS重懸外泌體沉淀，
②將①所得外泌體懸液，按照1:3，1:9,1:27和1:81的不同比例進行稀釋，之后分別取上述一定量的外泌體懸液原液和稀釋液各300 yL，以40yL/min的流速用微流注射栗注入到步驟I)的雙膜過濾芯片中，
③之后，每個雙膜過濾芯片繼續(xù)以相同的流速注入300yL ant1-⑶63(1:200-1:500稀釋，濃度為2-5 yg/mL)后，于25°C條件下進行孵育l-1.5h，
④用300-400yLPBS緩沖液清洗雙膜過濾芯片，重復三-四次，清洗結(jié)束后向每個雙膜過濾芯片內(nèi)以相同的流速注入500yL—定量的空氣來排盡雙膜過濾芯片內(nèi)液體，
⑤向每個雙膜過濾芯片注入300yL鏈霉親合素標記的HRP(1:2000-1:5000稀釋，濃度為0.2-0.5 yg/mL)，并放在于濕盒里于37°C孵育l_2h，
⑥重復步驟④和⑤三-四次。
[0008]⑦向每個雙膜過濾芯片注入300yL TMB顯色液，并于暗室中37°C顯色5-30min，
⑧用手機成像系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集，
⑨最后利用無線信號傳輸?shù)焦P記本電腦，對采集數(shù)據(jù)進行處理分析，從而構(gòu)建標準曲線。
[0009]3)樣本收集、注樣和清洗:收集健康志愿者/膀胱癌患者尿液樣本10 ml，采用2，000 g室溫離心10-15分鐘，并去除細胞及其殘片，將上清液用微流注射栗以40yL/min的流速連續(xù)注入雙膜過濾芯片中，注入體積為8mL，最后用400yLpH 7.4的PBS以40yL/min的流速注入到雙膜過濾芯片中，重復該步驟3-4次，完成捕獲樣本的清洗。
[0010]4)芯片ELISA檢測:采用步驟2)的③-⑨，對步驟3)所捕獲的外泌體進行檢測。
[0011]5)數(shù)據(jù)處理分析:將檢測結(jié)果帶入標準曲線，進行外泌體濃度的比對。
[0012]6)按照步驟2)-5)以PBS緩沖液替代外泌體，設(shè)立陰性對照組進行試驗對照。
[0013]本發(fā)明中首先進行微流體芯片的設(shè)計和組裝。利用激光切割機進行芯片主體PMMA板的切割組裝。PMMA板的厚度范圍為l_2mm。樣本進出口軟管外徑為1.5-1.8mm，所述軟管和芯片主體均用膠粘合牢固。
[0014]構(gòu)建外泌體ELISA檢測標準曲線，即將超離自尿液中的外泌體連讀系列倍比稀釋(1；1:3; 1:9; 1:27; 1:81)成不同的濃度，之后構(gòu)建標準曲線。后續(xù)，樣本收集測定結(jié)果與已知的標準曲線進行對比，來判定患者體內(nèi)外泌體的含量。
[0015]在采用上述技術(shù)方案的同時，本發(fā)明還可以采用或者組合采用以下進一步的技術(shù)方案:
將液體注入到雙膜過濾芯片中時，液體進樣速度范圍為30-60yL/min，用微流注射栗或者自動進樣器進行樣本注入。
[0016]所述樣本清洗中采用的洗滌液，為磷酸鹽緩沖液roS(pH 7.4 土 0.2)，洗滌次數(shù)通?？梢詾?-4次。
[0017]在向雙膜過濾芯片中加樣時，每個樣本做2-3個重復，每孔300yL。
[0018]所述加完樣的酶標板的靜置反應為生物素和鏈霉親合素結(jié)合，其反應溫度一般為35-37°C，時間通常為1-2小時。
[0019]所述的顯色液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，顯色反應為HRP和TMB結(jié)合反應，顯色反應時間一般為5-30分鐘，反應溫度一般為35-37 °C。
[0020]本發(fā)明的ELISA檢測方法的反應體系，主要包括以下組分:外泌體、生物素標記的ant 1-⑶63、鏈霉親合素的HRP、TMB顯色液、終止反應液、樣本洗滌液PBS和尿液樣本。
[0021]本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測芯片，能夠完成外泌體的分離、富集并為檢測做基礎(chǔ)。
[0022]本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測芯片，包括底板、頂板以及位于所述底板和頂板之間的檢測板，所述檢測板包括上層檢測板和下層檢測板，所述頂板上設(shè)有切割形成的注液孔和排液孔，所述注液孔上連接有注液軟管，所述排液孔上連接有排液軟管，所述上層檢測板和下層檢測板上分別設(shè)有進樣孔和廢液排出孔所述注液孔與所述進樣孔的位置相對應，所述排液孔和所述廢液排出孔的位置相對應；
所述頂板和所述上層檢測板之間通過第一雙面膠層固定粘貼在一起，所述第一雙面膠層上設(shè)有分別與所述注液孔和所述排液孔相對應的第一開孔，所述上層檢測板和所述下層檢測板之間設(shè)有兩層第二雙面膠層，這兩層DSA雙面膠層上均設(shè)有分別與所述進樣孔和所述廢液排出孔對應的第二開孔，位于進樣孔下方的第二開孔之間粘附有孔徑為200nm的第一聚碳酸酯膜片，位于廢液排出孔下方的第二開孔之間粘附有孔徑為30nm的第二聚碳酸酯膜片;所述下層檢測板上設(shè)有連通所述進樣孔和所述廢液排出孔的第一通道;下層檢測板和所述底板之間設(shè)有第三雙面膠層，所述第三雙面膠層上設(shè)有分別與所述進樣孔和所述廢液排出孔對應的第三開孔，所述第三開孔之間設(shè)有與所述第一通道對應的第二通道。
[0023]在采用上述技術(shù)方案的同時，本發(fā)明還可以采用或者組合采用以下進一步的技術(shù)方案:
所述底板、頂板和上下層檢測板均為形狀大小一致的PMMA板。
[0024]所述注液孔和所述排液孔的孔徑均為1.8mm，所述進樣孔和所述廢液排出孔的孔徑均為10mm，所述注液孔與進樣孔同心設(shè)置，所述排液孔與所述廢液排出孔同心設(shè)置。
[0025]構(gòu)成所述底板、頂板以及檢測板的PMMA板的長度為40mm，寬度為20mm，所述集成檢測芯片的厚度為6mm。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
I)本發(fā)明提供了一種用于集成外泌體分離、富集及檢測微流體芯片，同時構(gòu)建了芯片ELISA檢測方法。該反應體系與檢測方法，可用于檢測膀胱癌患者尿液樣本或膀胱癌細胞系培養(yǎng)液上清中外泌體的含量，本方法具有高度特異性的特點。
[0027]2)本發(fā)明的檢測對象是排出人體之外的尿液，容易獲得，且不會對人體造成任何影響或創(chuàng)傷，檢測方法也不需要昂貴且精密的實驗儀器(如超速離心機、熒光顯微鏡)，具有很大的應用前景。
【附圖說明】
[0028]附圖用于和具體實施案例結(jié)合對本發(fā)明作進一步說明。
[0029]圖1是雙膜過濾芯片結(jié)構(gòu)示意圖。
[0030]圖2是雙膜過濾芯片實物圖。
[0031]圖3是雙膜過濾芯片的檢測結(jié)果對比圖。
[0032]圖4是外泌體ELISA檢測原理圖。
[0033]圖5是外泌體芯片ELI SA檢測標準曲線。
[0034]圖6是外泌體分離、富集及檢測流程圖。
[0035]圖7是ELISA檢測方法臨床檢測箱線圖。
[0036]圖8是ROC曲線分析結(jié)果。
【具體實施方式】
[0037]下面結(jié)合具體實例，進一步闡述本發(fā)明。應注意，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0038]實施案例中未注明具體試驗條件和試驗方法的按照常規(guī)條件和方法或者制造商所建議的條件予以實施。
[0039]本發(fā)明中未特別說明的各種儀器和試劑均為本領(lǐng)域熟知的市售產(chǎn)品，可通過商業(yè)途徑米購獲得。
[0040]實施例1:膀胱癌患者尿液中外泌體的分離及芯片ELISA方法檢測，參照附圖1_8。
[0041]請參閱圖1-7，一種尿液外泌體分離、富集及ELISA檢測的集成檢測方法，包括如下步驟:
I)在患者知情及倫理委員會同意的前提下，收集膀胱癌患者(臨床活檢已證實為膀胱癌)尿液樣本16份，健康捐贈者8份，每份100ml，在室溫2，OOOg的離心條件下去除細胞及大的碎片，然后得到上層清液。
[0042]2)將I)得到的上層清夜，于4°C條件下，100，OOOg超速離心60分鐘，棄掉上清取沉淀，并用ImL pH 7.4的PBS緩沖液重懸外泌體(如圖1)。
[0043]3)將I)所得上層清夜，利用微流栗，以流速40yL/min注入到雙膜過濾芯片中，連續(xù)過濾8次。
[0044]4)將2)所得外泌體，按照3倍倍比進行系列稀釋，分別保存，以備后續(xù)構(gòu)建標準曲線。
[0045 ] 5 )將4 )所備外泌體進行芯片ELISA檢測(原理如圖2 )，首先向4 )中芯片注入抗體，每孔加入1:200-1: 500稀釋的300 yL的ant1-CD63(b1tin_labeled)抗體(即濃度為2-5 μ8/!1^)，25°(:溫育1-1.511。
[0046]6)向5)中注入300-400yL PBS緩沖液進行清洗，重復三次。
[0047]7)向6)每個芯片內(nèi)以相同的流速注入500yL空氣來排盡芯片內(nèi)液體。
[0048]8)向7)每個芯片注入300yL鏈霉親合素標記的HRP( 1:2000-1:5000稀釋，濃度為
0.2-0.5 yg/mL)，并放在濕盒里于37°C孵育1-2K9)重復步驟6)和7)。
[0049]10)向9)中每個過濾芯片注入300yL TMB顯色液，并于暗室中37°C顯色5_30min。
[0050]11)用圖像采集系統(tǒng)(例如手機中從成像系統(tǒng))進行數(shù)據(jù)采集。
[0051]12)將11)所得數(shù)據(jù)通過無線信號傳輸?shù)焦P記本電腦中，利用ImageJ進行RGB分析，構(gòu)建標準曲線(如圖4-5)，同時采用上述1)-12)步驟進行膀胱癌患者外泌體含量檢測，并進行ROC曲線分析和構(gòu)建箱線圖。檢測結(jié)果如圖6。
[0052]實施例2，集成檢測芯片，參照附圖1-3。
[0053]本發(fā)明的微流體芯片包括底板1、頂板2以及位于所述底板和頂板之間的檢測板，所述檢測板內(nèi)設(shè)有液體檢測腔，所述液體檢測腔能夠?qū)⒛蛞褐械耐饷隗w收集于其中，并通過多次注樣富集達到檢測的要求。
[0054]所述檢測板包括上層檢測板3和下層檢測板4，所述頂板2上設(shè)有切割形成的注液孔5和排液孔12，所述注液孔5上連接有注液管6，所述排液孔12上連接有排液管13，所述上層檢測板3和下層檢測板4上分別設(shè)有進樣孔7和廢液排出孔8，所述注液孔5與所述進樣孔7的位置相對應，所述排液孔12和所述廢液排出孔8的位置相對應。
[0055]所述頂板2和所述上層檢測板3之間通過第一雙面膠層9固定粘貼在一起，所述第一雙面膠層9上設(shè)有分別與所述注液孔5和所述排液孔12相對應的第一開孔14，所述上層檢測板3和所述下層檢測板4之間設(shè)有兩層第二雙面膠層15，這兩層DSA雙面膠層15上均設(shè)有分別與所述進樣孔7和所述廢液排出孔8對應的第二開孔16，位于進樣孔7下方的第二開孔16之間粘附有孔徑為200nm的第一聚碳酸酯膜片10，位于廢液排出孔8下方的第二開孔16之間粘附有孔徑為30nm的第二聚碳酸酯膜片17。
[0056]所述下層檢測板4上設(shè)有連通所述進樣孔7和所述廢液排出孔8的第一通道11。
[0057]下層檢測板4和所述底板I之間設(shè)有第三雙面膠層18，所述第三雙面膠層18上設(shè)有分別與所述進樣孔7和所述廢液排出孔8對應的第三開孔19，所述第三開孔19之間設(shè)有與所述第一通道11對應的第二通道20。
[0058]所述底板1、頂板2和上下層檢測板均為形狀大小一致的PMMA板。
[0059]構(gòu)成所述底板1、頂板2以及檢測板的PMMA板的長度為40mm，寬度為20mm，所述微流體芯片的整體厚度為6mm。
[0060]所述第一雙面膠層9、第二雙面膠層15以及第三雙面膠層18均為DSA雙面膠。
[0061 ]所述注液管5和所述排液管13均為無菌軟管。
[0062]所述注液孔5和所述排液孔12的孔徑均為1.8mm，所述進樣孔7和所述廢液排出孔8的孔徑均為10mm，所述注液孔5與進樣孔7同心設(shè)置，所述排液孔12與所述廢液排出孔8同心設(shè)置。
[0063]本實施例中，利用激光切割機進行芯片主體PMMA板的切割組裝，PMMA板的厚度范圍為1-2_，作為樣本進出口軟管的注液管外徑為1.5-1.8mm，所述軟管和芯片主體均用膠粘合牢固。
[0064]本發(fā)明的微流體芯片的工作原理是:將待檢測的尿液通過注液管5按照一定流速注入到注液孔5中，并由此進入上層檢測板3的進樣孔7，尿液經(jīng)過設(shè)置在上層檢測板3的進樣孔7下方的孔徑為200nm的第一聚碳酸酯膜片10的過濾，將雜志和大分子細胞去除，濾液進入到下層檢測板4的進樣孔7中，并通過通道11進入下層檢測板4上的廢液排出孔8內(nèi)，經(jīng)由孔徑為30nm的第二聚碳酸酯膜片17的過濾，外泌體被收集在下層間的版14的廢液排出孔8內(nèi)，濾液透過第二聚碳酸酯膜片17進入到上層檢測板3的廢液排出孔8內(nèi)，并能經(jīng)由排液孔12和排液管13被排出。
[0065]本發(fā)明的芯片在實際使用中的案例如實施例1所述。
【主權(quán)項】
1.一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測方法，其特征在于，包括如下具體步驟: 1)設(shè)計和組裝雙膜過濾芯片:所述雙膜過濾芯片為四層PMMA板，相鄰兩層PMMA板之間用雙面膠(DSA)連接，中間兩層PMMA板上分別切割有上下位置一致的進液孔和廢液排出孔，最上層的PMMA板上切割有分別與進液孔和廢液排出孔對應的注液孔和排液孔，所述注液孔和排液孔上分別連接軟管，最底層為PMMA平板，中間兩層PMMA板之間設(shè)有兩層DSA膠，這兩層DSA膠之間粘附有孔徑分別為200nm和30nm的聚碳酸酯膜，用于液體的過濾和外泌體的收集； 2)構(gòu)建芯片ELISA檢測標準曲線: ①收集，并去除細胞及其碎片，將上清液超離后用PBS重懸外泌體沉淀， ②將①所得外泌體懸液，按照不同比例進行稀釋，之后分別取一定量的外泌體懸液原液和稀釋液用微流注射栗注入到步驟I)的雙膜過濾芯片中， ③之后，每個雙膜過濾芯片繼續(xù)注入ant1-CD63(1:200-1:500稀釋，濃度為2-5yg/mL)后進行孵育， ④用PBS緩沖液進行清洗雙膜過濾芯片，清洗結(jié)束后向每個雙膜過濾芯片內(nèi)注入一定量的空氣來排盡雙膜過濾芯片內(nèi)液體， ⑤向每個雙膜過濾芯片注入300yL鏈霉親合素標記的HRP(1:2000-1:5000稀釋，濃度為0.2-0.5 yg/mL)，并于濕盒孵育， ⑥向每個雙膜過濾芯片注入TMB顯色液，并于暗室中顯色， ⑦用成像系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集， ⑧對采集數(shù)據(jù)進行處理分析，從而構(gòu)建標準曲線； 3)樣本收集、注樣和清洗:收集尿液樣本，室溫離心并去除細胞及其殘片，將上清液用微流注射栗連續(xù)注入雙膜過濾芯片中，后用pH 7.4的I3BS以一定流速注入到雙膜過濾芯片中，重復數(shù)次，完成樣本的清洗； 4)芯片ELISA檢測:采用步驟2)的③-⑧，對步驟3)所捕獲的外泌體進行檢測； 5)數(shù)據(jù)處理分析:將檢測結(jié)果帶入標準曲線，進行外泌體濃度的比對。2.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測方法，其特征在于，將液體注入到雙膜過濾芯片中時，液體的進樣速度范圍為30-60yL/min，用微流注射栗或者自動進樣器進行樣本注入。3.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測方法，其特征在于，所述樣本清洗中采用的洗滌液為磷酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4 ± 0.2)，洗滌次數(shù)為2-4次。4.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測方法，其特征在于，在向雙膜過濾芯片中加樣時，每個樣本重復2-3次，每孔300yL。5.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測方法，其特征在于，加完樣的酶標板在進行濕盒孵育時的靜置反應為生物素和鏈霉親合素結(jié)合，其反應溫度為35-37°C，時間為1-2小時。6.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測方法，其特征在于，所述的顯色液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，顯色反應為HRP和TMB結(jié)合反應，顯色反應時間為5-30分鐘，反應溫度為35-37 °C。7.一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測芯片，其特征在于:包括底板(I)、頂板(2)以及位于所述底板和頂板之間的檢測板，所述檢測板包括上層檢測板(3)和下層檢測板(4)，所述頂板(2)上設(shè)有切割形成的注液孔(5)和排液孔(12)，所述注液孔(5)上連接有注液軟管(6)，所述排液孔(12)上連接有排液軟管(13)，所述上層檢測板(3)和下層檢測板(4)上分別設(shè)有進樣孔(7)和廢液排出孔(8)，所述注液孔(5)與所述進樣孔(7)的位置相對應，所述排液孔(12)和所述廢液排出孔(8)的位置相對應； 所述頂板(2)和所述上層檢測板(3)之間通過第一雙面膠層(9)固定粘貼在一起，所述第一雙面膠層(9)上設(shè)有分別與所述注液孔(5)和所述排液孔(12)相對應的第一開孔(14)，所述上層檢測板(3)和所述下層檢測板(4)之間設(shè)有兩層第二雙面膠層(15)，這兩層DSA雙面膠層(15)上均設(shè)有分別與所述進樣孔(7)和所述廢液排出孔(8)對應的第二開孔(16)，位于進樣孔(7)下方的第二開孔(16)之間粘附有孔徑為200nm的第一聚碳酸酯膜片(10)，位于廢液排出孔(8)下方的第二開孔(16)之間粘附有孔徑為30nm的第二聚碳酸酯膜片(17);所述下層檢測板(4)上設(shè)有連通所述進樣孔(7)和所述廢液排出孔(8)的第一通道(11);下層檢測板(4)和所述底板(I)之間設(shè)有第三雙面膠層(18)，所述第三雙面膠層(18)上設(shè)有分別與所述進樣孔(7)和所述廢液排出孔(8)對應的第三開孔(19)，所述第三開孔(19)之間設(shè)有與所述第一通道(11)對應的第二通道(20)。8.如權(quán)利要求7所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測芯片，其特征在于:所述底板(I )、頂板(2)和上下層檢測板均為形狀大小一致的PMMA板。9.如權(quán)利要求7所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測芯片，其特征在于:所述注液孔(5)和所述排液孔(12)的孔徑均為1.8mm，所述進樣孔(7)和所述廢液排出孔(8)的孔徑均為10mm，所述注液孔(5)與進樣孔(7)同心設(shè)置，所述排液孔(12)與所述廢液排出孔(8)同心設(shè)置。10.如權(quán)利要求1所述的一種尿液外泌體分離、富集及檢測的集成檢測芯片，其特征在于:構(gòu)成所述底板(I)、頂板(2 )以及上下層檢測板的PMMA板的長度為40mm，寬度為20mm，所述集成檢測芯片的厚度為6mm。
【文檔編號】G01N33/574GK106093392SQ201610386872
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月5日 公開號201610386872.5, CN 106093392 A, CN 106093392A, CN 201610386872, CN-A-106093392, CN106093392 A, CN106093392A, CN201610386872, CN201610386872.5
【發(fā)明人】梁利國, 孔夢奇, 盛葉峰, 王書崎
【申請人】浙江大學