丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，包括：第一抗HCV核心抗原單抗、第一HCV重組嵌合抗原、第一樣品稀釋液、第二樣品稀釋液、第一酶標(biāo)記的第二抗HCV核心抗原單抗、第一配體標(biāo)記的第二HCV重組嵌合抗原、第二酶標(biāo)記的第二配體、顯色劑和終止液；第一樣品稀釋液包括還原劑、第一表面活性劑和第一變性劑；第二樣品稀釋液包括第二表面活性劑和第二變性劑。這種丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒原劑通過(guò)第一樣品稀釋液中打開包被抗原以及樣品中抗原抗體復(fù)合物中錯(cuò)配的二硫鍵，第二樣品稀釋液破壞HCV核心抗原和HCV抗體復(fù)合物，釋放更多抗原，從而提高檢測(cè)的靈敏度。
【專利說(shuō)明】
丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)引起的肝臟急慢性炎 癥，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)表明，目前世界上約有2億人感染丙型肝炎病毒，約占全球人口的3%，中國(guó)約 有4000萬(wàn)~6000萬(wàn)。丙型肝炎較乙型肝炎更易出現(xiàn)肝硬化、纖維化，導(dǎo)致肝癌，有預(yù)測(cè)顯示， 在不久的將來(lái)丙型肝炎將取代乙型肝炎成為繼艾滋病病毒后威脅人類健康的又一大病毒 殺手。丙型肝炎病毒雖然對(duì)人類健康危害甚大，目前也尚無(wú)疫苗可以預(yù)防，HCV早期診斷和 傳染源篩查對(duì)臨床治療和疾病控制有指導(dǎo)作用。因此，尋找操作簡(jiǎn)單、靈敏快速、價(jià)格低廉、 測(cè)試準(zhǔn)確的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)HCV的檢測(cè)，對(duì)全球、尤其是發(fā)展中國(guó)家來(lái)說(shuō)，都有重大的意義。
[0003] HCV為有包膜呈球形的正單鏈RNA病毒，屬于黃病毒家族，全長(zhǎng)約9500堿基。HCV基 因組兩側(cè)分別為5'和3'非編碼區(qū)，中間為開放讀碼框(0RF)，分為結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)。結(jié)構(gòu) 區(qū)包括核心蛋白區(qū)（C)和兩個(gè)包膜蛋白區(qū)（E1、E2)，分別編碼核心蛋白和包膜蛋白。非結(jié)構(gòu) 蛋白區(qū)包括NS2、NS3、NS4和NS5區(qū)，編碼功能蛋白，如蛋白酶（NS2、NS3和NS4A區(qū)），螺旋酶 (NS3)以及依賴RNA的RNA多聚酶(NS5B區(qū)）。丙肝病毒核心蛋白約含190aa，在病毒復(fù)制中起 到非常重要的作用。通常采用基因工程表達(dá)上述結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白作為包被抗原，來(lái)建立 抗-HCV檢測(cè)的ELISA方法。HCV基因組具有顯著的異質(zhì)性，同一基因組不同區(qū)段變異程度有 顯著差別。5 '非編碼區(qū)最為保守，已成為HCV分子診斷研究的焦點(diǎn)。
[0004] 傳統(tǒng)的丙型肝炎病毒檢測(cè)技術(shù)主要有：（1)PCR法檢測(cè)丙型肝炎病毒RNA;(2)免疫 學(xué)方法檢測(cè)丙型肝炎病毒抗原或者抗體。PCR法檢測(cè)主要用于抗病毒治療的選擇與療效監(jiān) 測(cè)，但它需嚴(yán)格按照PCR操作規(guī)程操作，檢測(cè)人員需經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)并取得相應(yīng)資質(zhì)，且樣本 的質(zhì)量控制要求高，必須是采血后2小時(shí)內(nèi)低溫條件送檢，無(wú)菌抽提RNA，容易因?yàn)椴僮?、設(shè) 備及環(huán)境等因素造成誤差，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性。丙肝免疫學(xué)方法檢測(cè)又分抗體檢測(cè) 和抗原檢測(cè)。HCV抗體檢測(cè)是目前最常用的檢測(cè)方法，但其致命缺點(diǎn)是存在"窗口期"，即HCV 感染后至HCV抗體產(chǎn)生中間有40-70天的時(shí)間，獻(xiàn)血員已經(jīng)被感染并具有傳染性，但是用目 前的抗體檢測(cè)試劑沒(méi)法檢出，該階段稱為感染后血清陽(yáng)轉(zhuǎn)前的窗口期(Perseroconversion Window Phase，PWP)。窗口期的存在是輸血感染的主要原因。目前丙型肝炎的輸血后感染占 肝炎病例的70 %，而在丙型肝炎病毒感染者中更有80-90 %是屬于輸血后感染;而丙肝抗原 的檢測(cè)可使檢測(cè)的窗口期平均提前50天左右，縮短窗口期HCV感染的風(fēng)險(xiǎn)。在HCV核酸出現(xiàn) 后的1 -2天內(nèi)，感染者體內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)HCV核心抗原，而且與HCV核酸的水平具有一定的相關(guān) 性，可以作為HCV檢測(cè)的標(biāo)志物。
[0005] 丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑是同時(shí)對(duì)HCV核心抗原和HCV抗體進(jìn)行檢測(cè)， 不但可以縮短檢測(cè)的窗口期，還可以區(qū)分是HCV現(xiàn)癥感染還是既往感染，可用于HCV的早期 檢測(cè)及治療評(píng)價(jià)，為指導(dǎo)臨床提供重要的參考；同時(shí)，該試劑還能用于血源篩查，可有效提 高用血及輸血安全，抗原抗體同時(shí)檢測(cè)也提高了工作效率，節(jié)約了成本。
[0006] 然而，由于患者在感染丙型肝炎病毒約一段時(shí)間后(平均49天)會(huì)產(chǎn)生抗體，形成 抗原抗體免疫復(fù)合物，當(dāng)產(chǎn)生抗原抗體免疫復(fù)合物后，因游離的抗原減少，使HCV抗原的檢 出率大大降低。一般檢測(cè)HCV抗原都會(huì)在樣品稀釋液里加去垢劑和變性劑，破壞復(fù)合物，釋 放抗原，但這種去垢劑和變性劑同時(shí)也破壞樣品中的HCV抗體，導(dǎo)致聯(lián)檢試劑中無(wú)法檢測(cè)到 HCV抗體，造成對(duì)抗體的漏檢。
[0007] 目前市面上的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒都是盡量采用溫和的去垢 劑和變性劑，盡量減少對(duì)待測(cè)樣品中HCV抗體的影響，但如果去垢劑和變性劑強(qiáng)度不強(qiáng)或者 濃度不夠的話，待測(cè)標(biāo)本中的免疫復(fù)合物破壞的就不完全，HCV核心抗原不能完全釋放出 來(lái)，待測(cè)樣品中的HCV核心抗原含量就少，針對(duì)HCV核心抗原和HCV抗體的檢測(cè)靈敏度較低， 容易造成漏檢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 基于此，有必要提供一種能提高針對(duì)HCV核心抗原和HCV抗體的檢測(cè)靈敏度的聯(lián)合 檢測(cè)試劑盒。
[0009] -種丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)樣品中是否含有丙型肝炎 病毒或丙型肝炎病毒抗體，包括:第一抗HCV核心抗原單抗、第一 HCV重組嵌合抗原、第一樣 品稀釋液、第二樣品稀釋液、第一酶標(biāo)記的第二抗HCV核心抗原單抗、第一配體標(biāo)記的第二 HCV重組嵌合抗原、第二酶標(biāo)記的第二配體、顯色劑和終止液；
[00?0]所述第一抗HCV核心抗原單抗、所述第一酶標(biāo)記的第二抗HCV核心抗原單抗、所述 第一 HCV重組嵌合抗原和所述第一配體標(biāo)記的第二HCV重組嵌合抗原相互間不發(fā)生交叉反 應(yīng)，所述第一配體可以與所述第二配體結(jié)合；
[0011] 所述第一樣品稀釋液按照質(zhì)量百分濃度包括〇 . 05 %~5 %的還原劑、0.005 %~ 0.1 %的第一表面活性劑和0.005 %~0.5 %的第一變性劑；
[0012] 所述第二樣品稀釋液包括第二表面活性劑和第二變性劑；
[0013] 所述第二樣品稀釋液中，所述第二表面活性劑的質(zhì)量百分濃度為0.5%~10%，所 述第二變性劑的濃度為〇.5mol/L~10mol/L。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述還原劑選自二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸、β-巰 基乙醇和還原型谷胱甘肽中的至少一種；
[0015] 所述第一樣品稀釋液中，所述還原劑的質(zhì)量百分濃度為0.3%~1%。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述第一表面活性劑選自十二烷基二甲基胺乙內(nèi)酯、十二烷基 氨基丙酸、十二烷基肌氨酸鈉、十二烷基磺酸鈉和溴化十六烷基三甲基銨中的至少一種；
[0017] 所述第一樣品稀釋液中，所述第一表面活性劑的質(zhì)量百分濃度為0.01 %~ 0.08%〇
[0018]在一個(gè)實(shí)施例中，所述第一變性劑選自鹽酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯 基醚中的至少一種；
[0019]所述第一樣品稀釋液中，所述第一變性劑的質(zhì)量百分濃度為0.01 %~0.1 %。
[0020]在一個(gè)實(shí)施例中，所述第二表面活性劑選自十二烷基二甲基胺乙內(nèi)酯、十二烷基 氨基丙酸、十二烷基肌氨酸鈉、十二烷基磺酸鈉和溴化十六烷基三甲基銨中的至少一種；
[0021]所述第二樣品稀釋液中，所述第二表面活性劑的質(zhì)量百分濃度為1%~5%。
[0022]在一個(gè)實(shí)施例中，所述第二變性劑選自鹽酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯 基醚中的至少一種；
[0023]所述第二樣品稀釋液中，所述第二變性劑的濃度為lmol/L~5mol/L。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述第一樣品稀釋液的溶劑為磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液， 所述第二樣品稀釋液的溶劑為磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述樣品、所述第一樣品稀釋液和所述第二樣品稀釋液的使用 比例為1~10:1~18:1~18。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述第一酶為辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶，所述第二酶為辣根 過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶，所述第一配體為生物素或親和素，所述第二配體為生物素或親和 素。
[0027] 這種丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒通過(guò)第一樣品稀釋液中的還原劑打 開包被抗原內(nèi)部或者抗原之間錯(cuò)配的二硫鍵，同時(shí)打開樣品中抗原抗體復(fù)合物中錯(cuò)配二硫 鍵，從而使表位更好的暴露在外，便于免疫結(jié)合反應(yīng)，第一樣品稀釋液中的第一變性劑可以 復(fù)性抗原，提高抗原的特異性識(shí)別能力，同時(shí)還能降低抗體的非特異性結(jié)合，第二樣品稀釋 液中的第二表面活性劑和第二變性劑可以破壞HCV核心抗原和HCV抗體復(fù)合物，釋放更多抗 原，從而提高抗原檢測(cè)的靈敏度。相對(duì)于目前商業(yè)化的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試 劑盒，這種丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒針對(duì)HCV核心抗原和HCV抗體的檢測(cè)靈敏 度較高。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為樣品檢測(cè)過(guò)程中加第一樣品稀釋液處理后的原理示意圖，其中，
t為第一抗 HCV核心抗原單抗：
為第一HCV重組嵌合抗原（錯(cuò)配二硫鍵結(jié)合），
為第一HCV重組嵌 合抗原，
為樣品中的HCV核心抗原與HCV抗體結(jié)合物(錯(cuò)配二硫鍵結(jié)合）：
為樣品中的
游離HCV核心抗原：
為樣品中的游離HCV抗體；
[0029] 圖2為樣品檢測(cè)過(guò)程中加第二樣品稀釋液處理后的原理示意圖，其中，樣品中 HCV核心抗原與HCV抗體結(jié)合物(非特異性結(jié)合）。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實(shí) 施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說(shuō)明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于 充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來(lái)實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施 的限制。
[0031] 一實(shí)施方式的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)樣品中是否含有 丙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒抗體，包括：第一抗HCV核心抗原單抗、第一 HCV重組嵌合抗 原、第一樣品稀釋液、第二樣品稀釋液、第一酶標(biāo)記的第二抗HCV核心抗原單抗、第一配體標(biāo) 記的第二HCV重組嵌合抗原、第二酶標(biāo)記的第二配體、顯色劑和終止液。
[0032]第一抗HCV核心抗原單抗、第一酶標(biāo)記的第二抗HCV核心抗原單抗、第一 HCV重組嵌 合抗原和第一配體標(biāo)記的第二HCV重組嵌合抗原相互間不發(fā)生交叉反應(yīng)，并且第一配體可 以與第二配體結(jié)合。
[0033]第一酶標(biāo)記的第二抗HCV核心抗原單抗、第一配體標(biāo)記的第二HCV重組嵌合抗原和 第二酶標(biāo)記的第二配體可以自行制備，也可以直接購(gòu)買。
[0034]本申請(qǐng)中，第一抗HCV核心抗原單抗、第一 HCV重組嵌合抗原、第二抗HCV核心抗原 單抗和第二HCV重組嵌合抗原均購(gòu)自Meridian Life Science公司；第二酶標(biāo)記的第二配體 購(gòu)自南京盤古基因生物工程股份有限公司；第一酶標(biāo)記的第二抗HCV核心抗原單抗和第一 配體標(biāo)記的第二HCV重組嵌合抗原都為自行制備。
[0035]優(yōu)選的，第一酶為辣根過(guò)氧化酶（HRP)或堿性磷酸酶，第二酶為辣根過(guò)氧化酶 (HRP)或堿性磷酸酶，第一配體為生物素或親和素，第二配體為生物素或親和素。
[0036] 第一樣品稀釋液按照質(zhì)量百分濃度包括0.05 %~5 %的還原劑、0.005 %~0.1 % 的第一表面活性劑和0.005%~0.5%的第一變性劑。
[0037] 第一樣品稀釋液的溶劑可以為磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液。
[0038] 結(jié)合圖1，第一樣品稀釋液含有還原劑和第一變性劑，還原劑主要是為了打開包被 抗原內(nèi)部或者之間錯(cuò)配的二硫鍵，同時(shí)打開待測(cè)標(biāo)本中抗原抗體復(fù)合物的錯(cuò)配二硫鍵，從 而使表位更好的暴露在外，便于免疫反應(yīng);第一變性劑主要功能是復(fù)性抗原，提高抗原的特 異性識(shí)別能力，同時(shí)還能降低抗體的非特異性結(jié)合。
[0039]還原劑選自二硫蘇糖醇(DTT)、三（2-羧乙基)膦(TCEP)、半胱氨酸、β-巰基乙醇和 還原型谷胱甘肽中的至少一種。
[0040] 優(yōu)選的，第一樣品稀釋液中，還原劑的質(zhì)量百分濃度為0.3%~1%。
[0041] 特別優(yōu)選的，第一樣品稀釋液中，還原劑為β-巰基乙醇，β-巰基乙醇的質(zhì)量百分濃 度為0.5%。
[0042]第一表面活性劑選自十二烷基二甲基胺乙內(nèi)酯、十二烷基氨基丙酸、十二烷基肌 氨酸鈉(NLS)、十二烷基磺酸鈉和溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)中的至少一種。
[0043]優(yōu)選的，第一樣品稀釋液中，第一表面活性劑的質(zhì)量百分濃度為0.01 %~0.08%。 [0044]特別優(yōu)選的，第一樣品稀釋液中，第一表面活性劑為十二烷基磺酸鈉，十二烷基磺 酸鈉的質(zhì)量百分濃度為〇. 05%。
[0045] 第一變性劑選自鹽酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯基醚中的至少一種。 [0046]優(yōu)選的，第一樣品稀釋液中，第一變性劑的質(zhì)量百分濃度為0.01 %~0.1 %。
[0047]特別優(yōu)選的，第一樣品稀釋液中，第一變性劑為Tween-20，TWeen-20的質(zhì)量百分濃 度為0.03%。
[0048] 第二樣品稀釋液包括第二表面活性劑和第二變性劑。第二樣品稀釋液中，第二表 面活性劑的質(zhì)量百分濃度為0.5%~10%，第二變性劑的濃度為0.5mol/L~10m 〇l/L。
[0049] 第二樣品稀釋液的溶劑可以為磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液。
[0050] 結(jié)合圖2,第二樣品稀釋液中含有第二表面活性劑和第二變性劑，第二表面活性劑 和第二變性劑是為了破壞HCV核心抗原和HCV抗體復(fù)合物，釋放更多抗原，從而提高抗原檢 測(cè)的靈敏度。
[0051] 第二表面活性劑選自十二烷基二甲基胺乙內(nèi)酯、十二烷基氨基丙酸、十二烷基肌 氨酸鈉、十二烷基磺酸鈉和溴化十六烷基三甲基銨中的至少一種。
[0052] 優(yōu)選的，第二樣品稀釋液中，第二表面活性劑的質(zhì)量百分濃度為1 %~5%。
[0053]特別優(yōu)選的，第二樣品稀釋液中，第二表面活性劑為十二烷基肌氨酸鈉，十二烷基 肌氨酸鈉的質(zhì)量百分濃度為3%。
[0054] 第二變性劑選自鹽酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯基醚中的至少一種。 [0055]優(yōu)選的，第二樣品稀釋液中，第二變性劑的濃度為lmol/L~5mol/L。
[0056]特別優(yōu)選的，第二樣品稀釋液中，第二變性劑為尿素，尿素的濃度為3mol/L。
[0057]第一樣品稀釋液、第二樣品稀釋液均用于樣品的稀釋，樣品、第一樣品稀釋液和第 二樣品稀釋液的使用比例為1~10:1~18:1~18。
[0058] 優(yōu)選的，樣品、第一樣品稀釋液和第二樣品稀釋液的使用比例為7~10:3~10:3~ 10。
[0059] 特別優(yōu)選的，樣品、第一樣品稀釋液和第二樣品稀釋液的使用比例為10:5:5。
[0060] 顯色劑和終止液選擇常規(guī)試劑即可。
[0061] 這種丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒通過(guò)第一樣品稀釋液中的還原劑打 開包被抗原內(nèi)部或者之間錯(cuò)配的二硫鍵，同時(shí)打開樣品中抗原抗體復(fù)合物的錯(cuò)配二硫鍵， 從而使表位更好的暴露在外，便于免疫反應(yīng)，第一樣品稀釋液中的第一變性劑可以復(fù)性抗 原，提高抗原的特異性識(shí)別能力，同時(shí)還能降低抗體的非特異性結(jié)合，第二樣品稀釋液中的 第二表面活性劑和第二變性劑可以破壞HCV核心抗原和HCV抗體復(fù)合物，釋放更多抗原，從 而提高抗原檢測(cè)的靈敏度。相對(duì)于目前商業(yè)化的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒， 這種丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)靈敏度較高。
[0062] 這種丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，能夠保證待測(cè)樣品里的抗原抗體復(fù) 合物打開，釋放HCV核心抗原，又能不破壞待測(cè)樣品里的HCV抗體，極大的提高了抗原和抗體 檢測(cè)的靈敏度。
[0063] 下面對(duì)上述丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的使用方法進(jìn)行簡(jiǎn)單說(shuō)明。
[0064] 上述丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的使用方法與目前商業(yè)化的丙型肝 炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒相似，區(qū)別僅在于加入第一樣品稀釋液后孵育30min~ 50min，不洗板再加入第二樣品稀釋液孵育。
[0065]具體過(guò)程如下：配制第一抗HCV核心抗原單抗和第一HCV重組嵌合抗原的混合溶 液，加入到微孔板上，經(jīng)吸附、洗滌、封閉、干燥后完成包被，接著加樣品和第一樣品稀釋液， 孵育30min~50min后不洗板再加入第二樣品稀釋液，孵育30min后洗板，接著加入第一酶標(biāo) 記的第二抗HCV核心抗原單抗、第一配體標(biāo)記的第二HCV嵌合抗原和第二酶標(biāo)記的第二配體 的混合溶液，孵育30min后洗板，加顯色液充分反應(yīng)后加終止液，最后測(cè)量0D值。
[0066]以下為具體實(shí)施例，實(shí)施例中出現(xiàn)的各種儀器和試劑如果沒(méi)有特別說(shuō)明，均采用 本領(lǐng)域常規(guī)儀器或試劑。
[0067] 實(shí)施例中采用的第一抗HCV核心抗原單抗記為AB1，AB1購(gòu)自美國(guó)meridian life science公司（貨號(hào)：C8A216M);第二抗HCV核心抗原單抗記為AB2，AB2購(gòu)自美國(guó)meridian life science公司（貨號(hào)：C8A017M);第一HCV重組嵌合抗原記為AG1，AG1購(gòu)自美國(guó)meridian life science公司（貨號(hào)：R01599);第二HCV重組嵌合抗原記為AG2，AG2購(gòu)自美國(guó)meridian life science公司（貨號(hào):R01600);HRP標(biāo)記的親和素購(gòu)自南京盤古基因生物工程股份有限 公司，貨號(hào):TRP_10005。
[0068] AB1、AB2、AG1、AG2彼此間不發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0069] AB2采用HRP標(biāo)記，HRP標(biāo)記的AB2采用過(guò)碘酸鈉標(biāo)記法制備，具體過(guò)程如下：（1)稱 取5mgHRP溶解于lmL蒸餾水中；（2)于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaI〇4溶液，室溫下避光 攪拌20分鐘。（3)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)ImM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過(guò)夜。 (4)加20yL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的PH升高到9.0~9.5，然后立即加入 10mg AB2到lmLO.OlM碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)。（5)加0. lmL新配的4mg/mL NaBH4液，混勻，再置4 °C 2小時(shí)。（6)將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4PBS透析，4 °C過(guò) 夜。（7)3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15M PH7.4的PBS中。（8)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去 除銨離子后（用萘氏試劑檢測(cè)），l〇,〇〇〇rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物；（9) 加入等量甘油，分裝后，冰凍保存。
[0070] AG2采用生物素標(biāo)記，生物素標(biāo)記的AG2的制備過(guò)程如下：
[0071] (1)PH 7.4 20mmro緩沖液4度透析抗原2小時(shí)。（2)按照AG2:BI0(1:5)質(zhì)量比例混 合后在4度放置1.5小時(shí)。（3)PH 7.4 20mmPB緩沖液4度透析AG2和BI0混合物3小時(shí)。分裝后， 冰凍保存。
[0072]選取10份陽(yáng)性標(biāo)本和10份陰性標(biāo)本進(jìn)行抗原抗體聯(lián)檢測(cè)試，陽(yáng)性標(biāo)本和陰性標(biāo)本 都是經(jīng)過(guò)藥監(jiān)局認(rèn)定的試劑盒確認(rèn)的，具體信息如下：
[0073]

[0075] 實(shí)施例1
[0076] 采用磷酸鹽緩沖液配制第一樣品稀釋液和第二樣品稀釋液，具體成分如下。
[0077] 第一樣品稀釋液:0 · 5wt %的β-巰基乙醇、0 · 05wt %的十二烷基磺酸鈉、0 · 03wt % 的Tween-20。
[0078]第二樣品稀釋液:3wt%的十二烷基肌氨酸鈉和3mol/L的尿素。
[0079]用碳酸鹽緩沖液稀釋AB1至濃度為3yg/mL，用碳酸鹽緩沖液稀釋AG1至濃度為6yg/ mL，將二者按照體積比為1:1混合，得到包被液。
[0080]然后將包被液加入聚苯乙烯微孔板內(nèi)，經(jīng)吸附、洗滌、封閉、干燥后完成包被。
[0081 ] 每孔加100yL樣品/陽(yáng)性對(duì)照/陰性對(duì)照和50yL第一樣品稀釋液，37°C孵育30min后 不洗板每孔再加入50yL第二樣品稀釋液，37°C孵育30min后洗板6次。
[0082] 加入200yL HRP標(biāo)記的AB2、生物素標(biāo)記的AG2及HRP標(biāo)記的親和素混合溶液，37°C 孵育30min后洗板6次。
[0083] 每孔100yL顯色液A液和100yL顯色液B液，37°C避光反應(yīng)30min后每孔加50yL終止 液，l〇min后，在450nm和630nm雙波長(zhǎng)測(cè)0D值。
[0084] 實(shí)施例2
[0085] 采用磷酸鹽緩沖液配制第一樣品稀釋液和第二樣品稀釋液，具體成分如下。
[0086] 第一樣品稀釋液:0· 3wt%的二硫蘇糖醇、0 .Olwt%的十二烷基磺酸鈉、O.Olwt% 的鹽酸胍。
[0087] 第二樣品稀釋液：1 wt %的十二烷基二甲基胺乙內(nèi)酯和5mo 1/L的尿素。
[0088]用碳酸鹽緩沖液稀釋AB1至濃度為3yg/mL，用碳酸鹽緩沖液稀釋AG1至濃度為6yg/ mL，將二者按照體積比為1:1混合，得到包被液。
[0089]然后將包被液加入聚苯乙烯微孔板內(nèi)，經(jīng)吸附、洗滌、封閉、干燥后完成包被。
[0090] 每孔加100yL樣品/陽(yáng)性對(duì)照/陰性對(duì)照和50yL第一樣品稀釋液，37°C孵育30min后 不洗板每孔再加入50yL第二樣品稀釋液，37°C孵育30min后洗板6次。
[0091] 加入200yL HRP標(biāo)記的AB2、生物素標(biāo)記的AG2的混合溶液及HRP標(biāo)記的親和素，37 °C孵育30min后洗板6次。
[0092] 每孔100yL顯色液A液和100yL顯色液B液，37°C避光反應(yīng)30min后每孔加50yL終止 液，l〇min后，在450nm和630nm雙波長(zhǎng)測(cè)0D值。
[0093] 實(shí)施例3
[0094]采用磷酸鹽緩沖液配制第一樣品稀釋液和第二樣品稀釋液，具體成分如下。
[0095] 第一樣品稀釋液：lwt %的半胱氨酸、0.08wt %的十二烷基磺酸鈉、0. lwt%的鹽酸 狐。
[0096] 第二樣品稀釋液:5wt%的十二烷基二甲基胺乙內(nèi)酯和lmol/L的聚乙二醇辛基苯 基醚。
[0097]用碳酸鹽緩沖液稀釋AB1至濃度為3yg/mL，用碳酸鹽緩沖液稀釋AG1至濃度為6yg/ mL，將二者按照體積比為1:1混合，得到包被液。
[0098]然后將包被液加入聚苯乙烯微孔板內(nèi)，經(jīng)吸附、洗滌、封閉、干燥后完成包被。
[0099] 每孔加100yL樣品/陽(yáng)性對(duì)照/陰性對(duì)照和50yL第一樣品稀釋液，37°C孵育30min后 不洗板每孔再加入50yL第二樣品稀釋液，37°C孵育30min后洗板6次。
[0100] 加入200yL HRP標(biāo)記的AB2和生物素標(biāo)記的AG2的混合溶液，37°C孵育30min后洗板 6次。
[0101] 每孔100yL顯色液A液和100yL顯色液B液，37°C避光反應(yīng)30min后每孔加50yL終止 液，l〇min后，在450nm和630nm雙波長(zhǎng)測(cè)0D值。
[0102]根據(jù)實(shí)施例1~3,得到下表1。
[0103] 表1:實(shí)施例1~3中在450nm和630nm雙波長(zhǎng)下的0D值。
[0106] 由表1可以看出，實(shí)施例1~3都能夠?qū)崿F(xiàn)HCV抗原抗體的檢測(cè)，并且實(shí)施例1中第一 樣品稀釋液和第二樣品稀釋液的組分比例不管是檢測(cè)HCV核心抗原還是HCV抗體效果都是 最佳的。
[0107] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)樣品中是否含有丙型肝炎病 毒或丙型肝炎病毒抗體，其特征在于，包括:第一抗HCV核心抗原單抗、第一 HCV重組嵌合抗 原、第一樣品稀釋液、第二樣品稀釋液、第一酶標(biāo)記的第二抗HCV核心抗原單抗、第一配體標(biāo) 記的第二HCV重組嵌合抗原、第二酶標(biāo)記的第二配體、顯色劑和終止液； 所述第一抗HCV核心抗原單抗、所述第一酶標(biāo)記的第二抗HCV核心抗原單抗、所述第一 HCV重組嵌合抗原和所述第一配體標(biāo)記的第二HCV重組嵌合抗原相互間不發(fā)生交叉反應(yīng)，所 述第一配體可以與所述第二配體結(jié)合； 所述第一樣品稀釋液按照質(zhì)量百分濃度包括〇. 05 %~5 %的還原劑、0.005 %~0.1 % 的第一表面活性劑和0.005 %~0.5 %的第一變性劑； 所述第二樣品稀釋液包括第二表面活性劑和第二變性劑； 所述第二樣品稀釋液中，所述第二表面活性劑的質(zhì)量百分濃度為0.5%~10%，所述第 二變性劑的濃度為〇. 5mol/L~10mol/L。2. 如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述還原 劑選自二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸、β-巰基乙醇和還原型谷胱甘肽中的至少一 種； 所述第一樣品稀釋液中，所述還原劑的質(zhì)量百分濃度為0.3%~1%。3. 如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一 表面活性劑選自十二烷基二甲基胺乙內(nèi)酯、十二烷基氨基丙酸、十二烷基肌氨酸鈉、十二烷 基磺酸鈉和溴化十六烷基三甲基銨中的至少一種； 所述第一樣品稀釋液中，所述第一表面活性劑的質(zhì)量百分濃度為0.01%~0.08%。4. 如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一 變性劑選自鹽酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯基醚中的至少一種； 所述第一樣品稀釋液中，所述第一變性劑的質(zhì)量百分濃度為〇.01 %~〇. 1 %。5. 如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第二 表面活性劑選自十二烷基二甲基胺乙內(nèi)酯、十二烷基氨基丙酸、十二烷基肌氨酸鈉、十二烷 基磺酸鈉和溴化十六烷基三甲基銨中的至少一種； 所述第二樣品稀釋液中，所述第二表面活性劑的質(zhì)量百分濃度為1 %~5%。6. 如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第二 變性劑選自鹽酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯基醚中的至少一種； 所述第二樣品稀釋液中，所述第二變性劑的濃度為lmol/L~5mol/L。7. 如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一 樣品稀釋液的溶劑為磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液，所述第二樣品稀釋液的溶劑為磷酸鹽 緩沖液或碳酸鹽緩沖液。8. 如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述樣 品、所述第一樣品稀釋液和所述第二樣品稀釋液的使用比例為1~1 〇: 1~18:1~18。9. 如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一 酶為辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶，所述第二酶為辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶，所述第一配 體為生物素或親和素，所述第二配體為生物素或親和素。
【文檔編號(hào)】G01N33/576GK106093402SQ201610378119
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】胡道奇, 毛金武, 周詠武, 李光
【申請(qǐng)人】湖南康潤(rùn)藥業(yè)有限公司