一種優(yōu)化的用雙抗體夾心ELISA法檢測β?內酰胺酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種優(yōu)化的用雙抗體夾心ELISA法檢測β?內酰胺酶的方法，β?內酰胺酶抗原40U/mL包被酶標板，0.8mg/ml的Rabbit Anti?LACTB按體積比1:800稀釋，包被，體積分數(shù)5％BSA封閉酶標板，加待測樣品，設陰性對照，100ug/ml的β?lactamase?Antibody按體積比1:3000稀釋，孵育；1mg/ml羊抗鼠lgG?HRP體積比1:5000稀釋加入，孵育；TMB單組份顯色液顯色；終止反應，測OD450nm，通過待測樣品平均OD值與陰性對照組OD值比判定樣品中β?內酰胺酶濃度陰性或陽性。該方法具有檢測速度快、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點。
【專利說明】
一種優(yōu)化的用雙抗體夾心EL ISA法檢測β-內酰胺酶的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及β-內酰胺酶的檢測方法，具體是一種優(yōu)化的用雙抗體夾心ELISA法檢 測內酰胺酶的方法。
【背景技術】
[0002] β-內酰胺酶可以裂解牛奶中青霉素、頭孢菌素類抗生素，使這些類抗生素在牛奶 中減少或者去除，所以又被稱為"解抗劑"。青霉素、頭孢菌素類抗生素等被內酰胺酶裂解 后生成青霉噻唑酸等，青霉素噻唑酸與蛋白質結合成青霉噻唑蛋白，它是引起青霉素過敏 的主要物質之一，從而使有過敏體質的人出現(xiàn)皮膚瘙癢、呼吸困難等癥狀。2009年，我國衛(wèi) 生部公布了《食品中可能違法添加的非食品用物質和易濫用的食品添加劑品種名單(第二 批)》，其中就含有β-內酰胺酶。
[0003] 目前，國內外對β-內酰胺酶的檢測方法研究還處于初始階段，牛乳中β-內酰胺酶 的檢測方法有:杯碟法、碘量法、酸度定量法、高效液相色譜法等，但這些方法存在耗時長， 假陰性和假陽性現(xiàn)象，成本高等缺點，而雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法可以有效的檢測抗原，具有 檢測速度快、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點。因此，本實驗利用1^131^丨411^-1^(^8和0-lactamase-Antibody(8A5.A10)建立雙抗體夾心ELISA檢測方法，為β-內酰胺酶的檢測及有 管部門提供了快速有效的方法。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)化的用雙抗體夾心ELISA法檢測β-內酰胺酶的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：
[0006] 雙抗體夾心法具體操作是一種基于抗原抗體反應檢測抗原的技術，將特異性抗體 結合到固相載體上形成固相抗體，然后加入待測抗原結合形成免疫復合物，洗滌后再加酶 標記抗體，與免疫復合物中抗原結合形成酶標抗體-抗原-固相抗體復合物，加底物顯色，通 過酶標儀測定0D值從而判斷抗原的含量。具體步驟為：
[0007] 1)包被β-內酰胺酶抗原:β-內酰胺酶抗原包被于酶標板上，每孔100yL，4°C過夜， 次日洗板；
[0008] 2)包被多克隆抗體：將濃度為0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti-LACTB:碳酸鹽緩沖液體積比1:800的比例進行稀釋，稀釋后的溶液100μL7孔包被酶標板，4 °(：孵育過夜，次日洗板；
[0009] 3)封閉：用封閉液封閉酶標板，每孔200yL，37°C孵育2h，洗板；
[0010] 4)加樣:加入待測樣品，同時設陰性對照，每孔100yL，每份樣品至少加雙孔，37°C 孵育lh，洗板；
[0011] 5)加單克隆抗體：濃度為 100ug/ml 的0-lactamase-Antibod}^$0-lactamase-Antibody: PBS緩沖液體積比1: 3000的比例進行稀釋，稀釋后的溶液加入酶標版，每孔100μ 1，37°(：孵育111，洗板；
[0012] 6)加酶標二抗:加入羊抗鼠 lgG-HRP，每孔lOOyL，37 °C孵育lh，洗板；
[0013] 7)顯色：向酶標板中加入TMB單組份顯色液，每孔100yL，室溫下避光顯色約15min;
[0014] 8)終止反應:每孔加入終止液50yL終止反應，于終止反應后20min內測定實驗結 果。
[00?5] 9)測定OD45〇nm:用酶標儀測定450nm的0D值當P/N^： 2.1時，判定樣品為陽性，當P/N < 2.1時，判定樣品為陰性，其中P為待測樣品平均0D值，N為陰性對照組0D值，P/N = 2.1時β-內酰胺酶濃度為25U/ml。
[0016] 上述洗板為:棄去酶標板中剩余液體，用洗滌液250μLν孔洗滌酶標板，每孔洗滌3 次，每次3-5min，在濾紙上拍干；
[0017] 所述封閉液為體積分數(shù)5%BSA、體積分數(shù)7.5%BSA、體積分數(shù)2.5%BSA、質量分數(shù) 5%脫脂奶粉、體積分數(shù)1%BSA、質量分數(shù)1%脫脂奶粉中的一種或二種以上，所述洗滌液為 ρΗ7·4,，0·15Μ的PBS;所述終止液為2M H2SO4。
[0018] 所述β-內酰胺酶抗原包被濃度為40U/mL，為用0.01M pH9.6碳酸鹽緩沖液將β-內 酰胺酶從200U/mL稀釋到40U/mL所得。
[0019] 所述的酶標二抗為將lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用PBS緩沖液按羊抗鼠 lgG-HRP:PBS 緩沖液體積比1:5000稀釋所得。
[0020] 所述的封閉液優(yōu)選為體積分數(shù)5%BSA。
[0021] 所述TMB單組份顯色液主要成分是3，3 '，5，5 ' -四甲基聯(lián)苯胺。
[0022]本發(fā)明對雙抗體夾心ELISA法進行優(yōu)化，分別對多克隆抗體的包被時間和稀釋倍 數(shù)，單克隆抗體稀釋倍數(shù)，酶標抗體孵育時間與稀釋濃度的確定，封閉液條件，底物作用時 間等進行選擇，根據(jù)實驗條件選擇最佳條件。
[0023]實驗得出抗體包被時間不能太短，時間太短抗體與酶標板結合會不是很穩(wěn)固，影 響實驗結果，所以本實驗采用4°C過夜，pH9.6、0.01M碳酸鹽緩沖液作為包被液，加強結合能 力。而且單克隆抗體和酶標二抗進行稀釋倍數(shù)優(yōu)化，選擇最佳的稀釋倍數(shù)用于試驗，排除由 于單克隆抗體和酶標二抗?jié)舛炔贿m造成的不確定因素。還需要對封閉時間和底物作用時間 進行測定，從而確定最佳反應條件，經(jīng)重復性評價，證明本發(fā)明提供的方法重復性良好，本 方法檢測最低濃度為25U/mL，因此本發(fā)明建立了穩(wěn)定的雙抗體夾心ELISA檢測方法。
【附圖說明】
[0024]圖1抗原最佳濃度的曲線；
[0025]圖2多克隆抗體和單克隆抗體工作濃度的選擇；
[0026]圖3酶標抗體工作條件的選擇；
[0027]圖4封閉液的選擇；
[0028] 圖5封閉時間的選擇；
[0029] 圖6底物作用時間的選擇；
【具體實施方式】
[0030] 下面結合附圖對本發(fā)明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發(fā)明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋 在本發(fā)明的保護范圍中。
[0031] 實施例1最佳工作條件的確定：
[0032] (1 )β_內酰胺酶抗原最佳包被濃度的確定：
[0033] 采用棋盤方陣的方法，按圖1所示組合進行試驗：
[0034] 1)包被β-內酰胺酶抗原：用0.01Μ ρΗ9.6碳酸鹽緩沖液將β-內酰胺酶從200U/mL稀 釋包被于酶標板上（稀釋濃度梯度為30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL)，每孔1 OOyL，4°C過 夜，次日洗板；
[0035] 2)包被多克隆抗體：將濃度為0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti- LACTB:碳酸鹽緩沖液體積比1:800的比例進行稀釋，稀釋后的溶液100μL7孔包被酶標板，4 °(：孵育過夜，次日洗板；
[0036] 3)封閉：用5 % BSA封閉液封閉酶標板，每孔200yL，37 °C孵育2h，洗板；
[0037] 4)加樣：用0.01M pH9.6碳酸鹽緩沖液將β-內酰胺酶稀釋到200U/mL替代實施例1 中的待測樣品，同時設陰性對照(磷酸鹽緩沖液），每孔l〇〇yL，每份樣品加5孔，37°C孵育lh， 洗板；
[0038] 5)加單克隆抗體：濃度為 100ug/ml 的0-lactamase-Antibod}^$0-lactamase-Ant ibody: PBS 緩沖液體積比 1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500的比例 進行稀釋，稀釋后的溶液加入酶標版，每孔l〇〇yL，37°C孵育lh，洗板；
[0039] 6)加酶標二抗:將lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用PBS緩沖液按羊抗鼠 lgG-HRP: PBS緩 沖液體積比1:5000稀釋，每孔100yL，37 °C孵育lh，洗板；
[0040] 7)顯色：向酶標板中加入TMB單組份顯色液，每孔100yL，室溫下避光顯色約15min;
[0041 ] 8)終止反應:每孔加入2M H2S〇4終止液50yL終止反應，于終止反應后20min內測定 實驗結果。
[0042] 9)測定OD45〇nm:用酶標儀測定450nm的0D值，選擇接近1，對照陰性值小于0 · 2，P/N 值最大時的抗原為最佳濃度。其中P為待測樣品0D值，N為陰性對照組0D值。
[0043]單克隆抗體分別做 1: 500、1:1000、1:1500、1: 2000、1:2500、1: 3000、1: 3500稀釋、 1:5000稀釋酶標二抗，然后通過酶標儀測定0D450nm值和P/N值。選擇接近1，對照陰性值小 于0.2，P/N值最大時的抗原為最佳濃度。
[0044]如圖1所示，抗原包被濃度最佳為40U/mL。
[0045] (2)單克隆抗體和多克隆抗體最佳工作濃度的確定：
[0046] 采用棋盤方陣的方法，按照圖2所示組合進行試驗：
[0047] 1)包被β-內酰胺酶抗原：用0.01M pH9.6碳酸鹽緩沖液將β-內酰胺酶從200U/mL稀 釋到40U/mL包被于酶標板上，每孔100yL，4 °C過夜，次日洗板；
[0048] 2)包被多克隆抗體：將濃度為0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti- LACTB:碳酸鹽緩沖液體積比1:500、1:600、1:700、1:800、1:900的比例進行稀釋，稀釋后的 溶液1 〇〇μLν孔包被酶標板，4 °C孵育過夜，次日洗板；
[0049] 3)封閉：用5 % BSA封閉液封閉酶標板，每孔200yL，37 °C孵育2h，洗板；
[0050] 4)加樣：用0.01M pH9.6碳酸鹽緩沖液將β-內酰胺酶稀釋到200U/mL替代實施例1 中的待測樣品，同時設陰性對照(磷酸鹽緩沖液），每孔l〇〇yL，每份樣品加5孔，37°C孵育lh， 洗板；
[0051 ] 5)加單克隆抗體：濃度為 lOOug/ml 的0-lactamase-Antibod}^$0-lactamase- Ant ibody: PBS 緩沖液體積比 1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500的比例 進行稀釋，稀釋后的溶液加入酶標版，每孔l〇〇yL，37°C孵育lh，洗板；
[0052] 6)加酶標二抗:將lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用PBS緩沖液按羊抗鼠 lgG-HRP: PBS緩 沖液體積比1:5000稀釋，每孔100yL，37 °C孵育lh，洗板；
[0053] 7)顯色：向酶標板中加入TMB單組份顯色液，每孔100yL，室溫下避光顯色約15min;
[0054] 8)終止反應:每孔加入2M H2S〇4終止液50yL終止反應，于終止反應后20min內測定 實驗結果。
[0055] 9)測定OD45〇nm:用酶標儀測定450nm的0D值，選擇接近1，對照陰性值小于0 · 2，P/N 值最大時的抗原為最佳濃度。其中P為待測樣品0D值，N為陰性對照組0D值。
[0056] 上述洗板為:棄去酶標板中剩余液體，用pH7.4,，0.15MPBS洗滌液250yL/孔洗滌酶 標板，每孔洗滌3次，每次3min，在濾紙上拍干；
[0057] 從圖2中可以看出，當多克隆抗體稀釋到1:800,單克隆抗體稀釋到1:3000時，P/N 值最高，靈敏度最高。因此，選取多克隆抗體1:800，單克隆抗體1:3000作為工作濃度。
[0058] (3)酶標抗體孵育時間與稀釋濃度的確定：
[0059] 步驟為按照棋盤方陣的方法，按照圖3所示組合進行試驗，確定酶標抗體孵育時間 與稀釋濃度：
[0060] 1)包被β-內酰胺酶抗原：用0.01M pH9.6碳酸鹽緩沖液將β-內酰胺酶從200U/mL稀 釋到40U/mL包被于酶標板上，每孔100yL，4 °C過夜，次日洗板；
[0061 ] 2)包被多克隆抗體：將濃度為0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti- LACTB:碳酸鹽緩沖液體積比1:800的比例進行稀釋，稀釋后的溶液100μL7孔包被酶標板，4 °(：孵育過夜，次日洗板；
[0062] 3)封閉：用5 % BSA封閉液封閉酶標板，每孔200yL，37 °C孵育2h，洗板；
[0063] 4)加樣:加入待測樣品，同時設陰性對照(磷酸鹽緩沖液），每孔100yL，每份樣品加 5孔，37°C孵育lh，洗板；
[0064] 5)加單克隆抗體：濃度為 100ug/ml 的0-lactamase-Antibod}^$0-lactamase-Antibody: PBS緩沖液體積比1: 3000的比例進行稀釋，稀釋后的溶液加入酶標版，每孔100μ 1，37°(：孵育111，洗板；
[0065] 6)加酶標二抗：lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用roS緩沖液按羊抗鼠 lgG-HRP: roS緩沖 液體積比1: 3000、1:4000、1: 5000、1:6000、1: 7000稀釋，每孔100yL，孵育時間分別為37°C 30min、37°Clh、37°C2h，洗板；
[0066] 7)顯色：向酶標板中加入TMB單組份顯色液，每孔100yL，室溫下避光顯色約15min;
[0067] 8)終止反應:每孔加入2M H2S〇4終止液50yL終止反應，于終止反應后20min內測定 實驗結果。
[0068] 9)測定OD45〇nm:用酶標儀測定450nm的0D值。
[0069] 上述洗板為:棄去酶標板中剩余液體，用pH7.4,，0.15MPBS洗滌液250yL/孔洗滌酶 標板，每孔洗滌3次，每次3min，在濾紙上拍干；
[0070]從圖3中可以看出，當多克隆抗體稀釋為1:800,單克隆抗體稀釋為1:3000，其他條 件不變的情況下，酶標抗體以1:5000，37°C lh時P/N值最高，估選擇此條件為最適稀釋濃度 和反應時間。
[0071] (4)封閉液種類的確定：
[0072] 步驟為按照棋盤方陣的方法，按圖4所示組合方式，確定封閉液種類?？乖?、多克隆 抗體、單克隆抗體、酶標二抗均選擇上述實驗確定的最佳濃度和反應時間等條件，將封閉液 分別選擇質量分數(shù)1%脫脂奶粉、質量分數(shù)5%脫脂奶粉、體積分數(shù)體積分數(shù)1%BSA、體積分 數(shù)2.5 % BSA、體積分數(shù)5 % BSA、體積分數(shù)7.5 %BSA進行封閉，每孔200yL，37 °C孵育2h，其他 步驟和條件同（3)，通過酶標儀測定0D45Q值，根據(jù)P/N值分析選出最佳工作濃度。
[0073] 從圖4中可以看出，當多克隆抗體稀釋為1:800,單克隆抗體稀釋為1:3000，酶標抗 體以1:5000，其他條件不變的情況下，結果顯示5%83厶(？/^)>7.5%83厶(？/^)>2.5%83厶(卩/ N)>5%脫脂奶粉(P/N)>1%BSA(P/N)>1%脫脂奶粉(P/N)，因此，選擇5%BSA為封閉液。 [0074] (5)封閉時間的確定：
[0075]步驟為按照棋盤方陣的方法，按圖5所示組合方式，確定封閉液時間。在上述(4)基 礎上，用最佳封閉液封閉，并在37 °C下分別孵育lh、1.5h、2h、2.5h、3h，其他步驟和條件同 (4)，通過酶標儀測定0D45Q值，根據(jù)P/N值分析選出最佳工作濃度。
[0076] 從圖5中可以看出，當多克隆抗體稀釋為1:800,單克隆抗體稀釋為1:3000，封閉液 為5%BSA，酶標抗體以1:5000，其他條件不變的情況下，封閉時間371€211(?/^)>37 1€311(?/ N)>37°C2.5h(P/N)>37°C1.5h(P/N)>37°Clh(P/N)。估選擇 37°C 封閉 2h 為最佳的封閉時間。 [0077] (6)底物作用時間的確定：
[0078]步驟為按照棋盤方陣的方法，按圖6所示組合方式，確定底物作用時間。采用上述 (1 )-(5)選出的最佳反應條件，避光情況下底物顯色時間分別選取lOmin、15min、20min、 25min、30min，底物顯色后在向每孔中加入50yL的2M H2S〇4終止液，然后用酶標儀測定OD450 值，其他步驟和條件同（5 )，確定出最適的底物作用時間。
[0079] 從圖6中可以看出，當多克隆抗體稀釋為1:800,單克隆抗體稀釋為1:3000，封閉液 為5%BSA，封閉2h，酶標抗體以1:5000，其他條件不變的情況下，當?shù)孜镒饔?511^11時?/^值 最大，因此，室溫15min是最適顯色時間。
[0080] 實施例2
[0081 ] 1)包被內酰胺酶抗原:內酰胺酶抗原包被于酶標板上，每孔l〇〇yL，4°C過夜， 次日洗板；
[0082] 2)包被多克隆抗體：將濃度為0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti-LACTB:碳酸鹽緩沖液體積比1:800的比例進行稀釋，稀釋后的溶液100μL7孔包被酶標板，4 °(：孵育過夜，次日洗板；
[0083] 3)封閉：用5 % BSA封閉液封閉酶標板，每孔200yL，37 °C孵育2h，洗板；
[0084] 4)加樣:加入待測樣品，同時設陰性對照(磷酸鹽緩沖液），每孔100yL，每份樣品加 5孔，37°C孵育lh，洗板；
[0085] 5)加單克隆抗體：濃度為 100ug/ml 的0-lactamase-Antibod}^$0-lactamase-Antibody: PBS緩沖液體積比1: 3000的比例進行稀釋，稀釋后的溶液加入酶標版，每孔100μ 1，37°(：孵育111，洗板；
[0086] 6)加酶標二抗:加入將羊抗鼠 lgG-HRP，每孔100yL，37 °C孵育lh，洗板；
[0087] 7)顯色：向酶標板中加入TMB單組份顯色液，每孔100yL，室溫下避光顯色約15min;
[0088] 8)終止反應：每孔加入2M H2S〇4終止液50yL終止反應，于終止反應后20min內測定 實驗結果。
[0089] 9)測定OD45〇nm:用酶標儀測定450nm的0D值當Ρ/Ν>2· 1時，判定樣品為陽性，當P/N < 2.1時，判定樣品為陰性，其中P為待測樣品平均0D值，N為陰性對照組0D值，P/N = 2.1時β-內酰胺酶濃度為25U/ml。
[0090] 上述洗板為:棄去酶標板中剩余液體，用PH7.4,，0.15MPBS洗滌液250μLν孔洗滌酶 標板，每孔洗滌3次，每次3min，在濾紙上拍干;所述洗滌液為ρΗ7.4，，0.15Μ的roS;所述終止 液為2M H2SO4。
[0091] 實施例3
[0092]在實施例2的基礎上步驟1)中β-內酰胺酶抗原包被濃度為40U/mL，為用0.01M pH9.6碳酸鹽緩沖液將β-內酰胺酶從200U/mL稀釋到40U/mL所得。
[0093] 實施例4
[0094]在實施例3的基礎上，酶標二抗為將lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用roS緩沖液按羊抗 鼠 lgG-HRP: PBS緩沖液體積比1:5000稀釋所得。
[0095] 實施例5
[0096] 在實施例4的基礎上，封閉液優(yōu)選為體積分數(shù)5%BSA。
[0097] 實施例6重復性評價：
[0098] (1)重復性批內試驗
[0099] 選取同批已組裝好的酶標板，4份不同的待測樣品（陽性樣品和陰性樣品）按實施 例5步驟進行檢測，同一酶標板內每個樣品進行5次平行試驗，按照已建立好的ELISA操作程 序，進行ELISA測定，測0D 45Q值，進行統(tǒng)計分析結果，其變異系數(shù)在2.22%~7.14%，小于 10 %，變異程度很小，重復性好，表1。
[0100] 表1組內重復性試驗
[0101]
[0102] (2)重復性批間試驗
[0103] 選用5個不同時間制定的包被平板，在相同的條件下對4份不同的待測樣品（陽性 樣品和陰性樣品）按實施例1步驟進行檢測，按照已建立好的ELISA操作程序，進行ELISA測 定，計算同一份檢測樣本0D450值的變異系數(shù)，統(tǒng)計分析結果，變異系數(shù)在2.01%~8.03%， 小于10 %。說明重復性好，可進行試驗，表2。
[0104] 表2組間重復性試驗
[0106] 四、敏感性評價
[0107] 從β-內酰胺酶標準溶液200U/mL進行稀釋，稀釋成不同的濃度（150、100、75、50、 25、2〇1]/1111)，用所建立的雙抗體夾心機154法測定〇〇45〇值，？/^=2.1時0-內酰胺酶濃度為 25U/ml，檢測最低濃度為25U/mL，當P/N彡2.1時，判定樣品為陽性，當P/N<2.1時，判定樣品 為陽性。
【主權項】
1. 一種優(yōu)化的用雙抗體夾心ELISA法檢測β-內酰胺酶的方法，其步驟如下： 1) 包被β-內酰胺酶抗原:β-內酰胺酶抗原包被于酶標板上，每孔l〇〇yL，4 °C過夜，次日 洗板； 2) 包被多克隆抗體:將濃度為0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti-LACTB: 碳酸鹽緩沖液體積比1:800的比例進行稀釋，稀釋后的溶液100μL孔包被酶標板，4°C孵育 過夜，次日洗板； 3) 封閉：用封閉液封閉酶標板，每孔200yL，37°C孵育2h，洗板； 4) 加樣:加入待測樣品，同時設陰性對照，每孔100yL，每份樣品至少加雙孔，37°C孵育 lh，洗板； 5) 加單克隆抗體：濃度為 100ug/ml 的β-lac tamase-Ant ibody 按β-lac tamase-Antibody: PBS緩沖液體積比1: 3000的比例進行稀釋，稀釋后的溶液加入酶標版，每孔100μ 1，37°(：孵育111，洗板； 6) 加酶標二抗:加入羊抗鼠1 gG-HRP，每孔100yL，37 °C孵育lh，洗板； 7) 顯色：向酶標板中加入TMB單組份顯色液，每孔100yL，室溫下避光顯色約15min; 8) 終止反應:每孔加入終止液50yL終止反應，于終止反應后20min內測定實驗結果； 9) 測定OD45〇nm:用酶標儀測定450nm的0D值，當P/N》2.1時，判定樣品為陽性，當P/N< 2.1時，判定樣品為陰性，其中P為待測樣品平均0D值，N為陰性對照組0D值，P/N=2.1時β-內 酰胺酶濃度為25U/ml，為本方法最低檢測濃度； 上述洗板為:棄去酶標板中剩余液體，用洗滌液250μ!7孔洗滌酶標板，每孔洗滌3次，每 次3_5min，在濾紙上拍干。2. 按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述封閉液為體積分數(shù)5%BSA、體積分數(shù) 7.5 % BSA、體積分數(shù)2.5 % BSA、質量分數(shù)5 %脫脂奶粉、體積分數(shù)1 % BSA、質量分數(shù)1 %脫脂 奶粉中的一種或二種以上，所述洗滌液為PH7.4，，0.15M的PBS;所述終止液為2M H2S〇4。3. 按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述β-內酰胺酶抗原包被濃度為40U/mL。4. 按照權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的酶標二抗即羊抗鼠 lgG-HRP為將 lmg/ml的羊抗鼠 lgG-HRP用roS緩沖液按羊抗鼠 lgG-HRP: roS緩沖液體積比1: 5000稀釋所 得。5. 按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的封閉液為體積分數(shù)5 %BSA。
【文檔編號】G01N33/577GK106093403SQ201610356629
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】于國萍, 邵美麗, 岳崇慧, 吳昊, 藏小丹, 范美婧, 陳媛, 陳超, 王艷菲
【申請人】東北農業(yè)大學