一種抗英夫利西抗體elisa檢測試劑盒和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗英夫利西抗體ELISA檢測試劑盒和檢測方法。包括英夫利西抗體包被的ELISA板、HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體、HRP標(biāo)記的抗F(ab’)2段的IgG抗體、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、H2SO4和輔助試劑組成；所述的英夫利西抗體包被的ELISA板是通過以下方法制備的：用TNF?α包被ELISA板，然后加入英夫利西單克隆抗體，使英夫利西單克隆抗體與TNF?α結(jié)合固定于ELISA板上作為固定抗原，由此得到英夫利西抗體包被的ELISA板。本發(fā)明操作簡便，普通實驗室均可開展，測量結(jié)果靈敏性高，特異性強(qiáng)，能夠廣泛應(yīng)用臨床。
【專利說明】
一種抗英夫利西抗體EL ISA檢測試劑盒和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種抗英夫利西抗體ELISA檢測試劑盒和檢 測方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 英夫利西單克隆抗體（inf liximab，IFX)是由75%人源性]^611〇輕鏈的恒定區(qū)和 25%鼠源性的多變區(qū)組成的嵌合型單克隆抗體，能夠特異性結(jié)合游離和膜連的腫瘤壞死因 子α(TNF-α)，進(jìn)而阻斷TNF-α激活的NF-κΒ促炎通路，促發(fā)過度活化的淋巴細(xì)胞凋亡，最終抑 制免疫紊亂引起的組織損傷，是目前廣泛應(yīng)用于治療風(fēng)濕性疾病和炎癥性腸病的生物制劑 藥物（Koji Sono，Cytokine 59,2012;Matteo Bosani，Biologics:Targets&Therapy 2009; Gert Van 4%(*6,6此，2012)。其中尤其對于炎癥性腸病的治療，相比傳統(tǒng)藥物如5-氨基水 楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑(硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤)等，IFX能夠迅速誘導(dǎo)并長期維持黏 膜愈合，而后者對于延長炎癥性腸病的無激素緩解期、減少并發(fā)癥、減少住院率及手術(shù)率， 最終延緩疾病的自然病程發(fā)展具有重要意義（2012ECC0)<JFX能夠發(fā)揮促進(jìn)腸道粘膜愈合 的效應(yīng)主要取決于藥物進(jìn)入患者體內(nèi)后達(dá)到并維持足夠的治療窗濃度，目前研究表明IBD 患者維持病情緩解需要IFX濃度維持在3-7yg/mL(Niels Vande Casteele Gastroenterology 2015)，當(dāng)IBD患者IFX測定濃度低于3yg/mL，采用加大IFX劑量輸注或縮 短給藥間隔的用藥方案調(diào)整能夠顯著提升患者的粘膜愈合率，反之，若患者IFX測定濃度高 于7yg/mL，適當(dāng)減量能夠在不影響患者的粘膜愈合率前提下節(jié)約患者花費。因此，準(zhǔn)確評估 英夫利西的體內(nèi)濃度對于患者獲得更佳療效及臨床醫(yī)生治療決策具有極其重要的意義。
[0003] 英夫利西作為不屬于人體自身的蛋白，其具有一定的免疫原性，即能刺激體內(nèi)的 免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對英夫利西的抗體(anti-infliximab antibody，ATI)和致敏T淋巴細(xì)胞的 特異性免疫反應(yīng)。ATI能夠結(jié)合英夫利西加快其清除，導(dǎo)致體內(nèi)IFX濃度不足和療效不佳，同 時增加輸液反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(M· Svenson，Rheumatology，2007)。因此測定血清IFX和ATI濃 度對于臨床醫(yī)生及早發(fā)現(xiàn)可能發(fā)生IFX失應(yīng)答的患者，明確IFX失應(yīng)答的可能原因，以及指 導(dǎo)臨床治療策略調(diào)整使患者持續(xù)維持病情緩解具有相當(dāng)重要價值(Ben-Horin S，Nature Reviews Gastroenterology&Hepatology，2014)〇
[0004] 目前測量血清ATI濃度的方法較多，傳統(tǒng)方法為雙抗原夾心法（double-antigen (DA)enzyme-1 inked immunosorbent assay(ELISA))和放射免疫檢測法（Ainsworth MA,Am J Gastroenterol.2008;Wolbink GJ,Arthritis Rheum.2006)，，雙抗原夾心法將IFX同時 作為捕獲ATI的抗原以及檢測ATI的抗體，存在相當(dāng)?shù)募夹g(shù)限制，如單價的IgG4型ATI只有1 個抗原決定簇，只能結(jié)合于包被的IFX，而作為檢測抗體的IFX則無法與之結(jié)合，而約36 %的 ATI就會因?qū)儆贗gG4(M. Svenson，Rheumatology ,2007)而發(fā)生漏診；另一方面，體內(nèi)類風(fēng)濕 因子能夠針對IgG FC片段上抗原表位結(jié)合，因而也能結(jié)合于包被抗原IFX導(dǎo)致檢測結(jié)果假 陽性(Ben-Horin S，Gut，2010)。此外，血清中的IFX可與作為檢測抗體的IFX競爭性結(jié)合 ATI，妨礙血清ATI的檢測（Colombel JF，N Engl J Med.2010;Seow CH，Gut.2010)。另一種 測量ATI濃度的方法是放射免疫檢測法（Ainsworth MA,Am J Gastroenterol .2008; Wolbink GJ,Arthritis Rheum.2006),由于使用了放射性原料，該方法需經(jīng)過福射防護(hù)專 業(yè)培訓(xùn)的人員及特殊設(shè)備方能開展，臨床上難以廣泛普及使用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種可避免血清中IFX對ATI檢測的干擾，準(zhǔn)確性大大提高， 同時操作方便，靈敏度高，特異性強(qiáng)的抗英夫利西抗體ELISA檢測試劑盒和檢測方法。
[0006] 當(dāng)前ATI的ELISA檢測技術(shù)關(guān)鍵問題在于尋找能夠高度特異結(jié)合ATI且容易制備的 檢測抗體，基于上述背景以及人體抗體結(jié)構(gòu)特征：即抗體分子是由2條較長、相對分子量較 大的相同的重鏈和2條較短、相對分子質(zhì)量較小的相同的輕鏈經(jīng)二硫鍵和非共價鍵聯(lián)結(jié)形 成一個由4條多肽鏈構(gòu)成的單體分子，輕鏈有Kappa (κ)鏈和lambda (λ)鏈兩種同種型，正常 人類血清中κ:λ的比例為2:l(Lam CW，Clin Biochem 1991)，IFX的輕鏈全部是由κ鏈組成 的，無 λ鏈，而ATI的輕鏈主要是由λ鏈組成(M · Svenson，Rheumatology，2007)，因此本發(fā)明人 開展了 anti-XELISA法間接檢測血清ATI的濃度，該法使用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗λ 鏈抗體作為檢測抗體，可避免血清中IFX對ATI檢測的干擾，準(zhǔn)確性大大提高，同時新方法操 作簡便，普通實驗室均可開展，測量結(jié)果靈敏性高，特異性強(qiáng)，能夠廣泛應(yīng)用臨床，從而實現(xiàn) 了本發(fā)明的目的。
[0007] 本發(fā)明的抗英夫利西抗體(ATI)的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0008] 首先用TNF-α包被ELISA板，然后加入英夫利西單克隆抗體（IFX)，使英夫利西單克 隆抗體（IFX)與TNF-a結(jié)合固定于ELISA板上作為固定抗原，將ELISA板上固定有英夫利西單 克隆抗體的孔分成待測樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線孔；
[0009] 標(biāo)準(zhǔn)曲線孔中加入含B S A的P B S溶液，然后再加入倍比稀釋的已知濃度的抗F (ab'）2段的IgG抗體(Ben-Horin 3,6此，2010)，而后加入底物了1?，在冊？的催化下變?yōu)樗{(lán) 色，后在酸的作用下變?yōu)辄S色，最后測定其吸光度值，通過已知濃度的抗F(ab'） 2段的IgG抗 體的吸光度值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0010] 在待測樣本孔處加入待測血清，使血清中的ATI與IFX結(jié)合從而固定下來，然后再 加入HRP標(biāo)記的針對ATI的抗λ鏈的IgG抗體，該抗體僅與ATI結(jié)合，不與IFX結(jié)合，而后加入底 物TMB，在HRP的催化下變?yōu)樗{(lán)色，后在酸的作用下變?yōu)辄S色，最后測定其吸光度值，根據(jù)待 測血清的吸光度值與上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出血清中ATI的濃度。
[0011] 所述的含BSA的PBS溶液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液。
[0012]所述的測定吸光度值是在酶標(biāo)儀讀取450nm的吸光度值。
[0013] 本發(fā)明的第二個目的是提供抗英夫利西抗體ELISA檢測試劑盒，其特征在于，包括 抗英夫利西抗體包被的ELI SA板、HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體、HRP標(biāo)記的抗F(ab '）2段的IgG 抗體、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、H2S〇4和輔助試劑組成；
[0014] 所述的抗英夫利西抗體包被的ELISA板是通過以下方法制備的：用TNF-α包被 ELISA板，然后加入英夫利西單克隆抗體（IFX)，使英夫利西單克隆抗體（IFX)與TNF-a結(jié)合 固定于ELISA板上作為固定抗體，由此得到抗英夫利西抗體包被的ELISA板。
[0015] 所述的輔助試劑包括PH9.6的碳酸氫鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BSA的ros溶液、質(zhì)量 分?jǐn)?shù)0.1 % BSA的PBS溶液、體積分?jǐn)?shù)0.05 % PBST溶液和蒸餾水。
[0016] 所述的PH9.6的碳酸氫鹽緩沖液每升是這樣配制的：將Na2C〇3 1.59g和NaHC〇3 2.93g加入1L的蒸餾水中，調(diào)pH達(dá)到9.6，得到碳酸氫鹽緩沖液；
[0017] 所述的用TNF-α包被ELISA板是用含500ng/ml TNF-α的碳酸氫鹽緩沖液包被ELISA 板。
[0018] 所述的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BSA的ros溶液是在PH7.4的PBS溶液（磷酸鹽緩沖液）中加入 BSA使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %，由此得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液；
[0019]所述的質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 1 % BSA的PBS溶液是在pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入BSA，使 其濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 1 %，由此得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液。
[0020] 所述的體積分?jǐn)?shù)0.05 % TOST溶液是指含體積分?jǐn)?shù)0.05 % Tween-20的ros溶液，其 是在pH7.4PBS溶液(磷酸鹽緩沖液）中加入Tween-20，使其體積分?jǐn)?shù)為0.05 %，由此得到體 積分?jǐn)?shù)〇.〇5%PBST溶液。
[0021] 本發(fā)明在ATI測定時，選用HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的抗λ鏈抗體作為檢測抗體， 該抗體僅與ATI結(jié)合，不與IFX結(jié)合，可使ATI的檢測結(jié)果不受血清中IFX的影響，同時由于不 存在ATI的標(biāo)準(zhǔn)品，所以我們選用已知濃度的可以與IFX結(jié)合的抗F(ab'） 2段的IgG抗體進(jìn)行 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使結(jié)果可信，準(zhǔn)確性大大提高。同時新方法操作簡便，普通實驗室均可開展， 測量結(jié)果靈敏性高，特異性強(qiáng)，能夠廣泛應(yīng)用臨床。
【附圖說明】：
[0022] 圖1是ATI標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
【具體實施方式】：
[0023]以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0024]實施例1:血清ATI濃度測定：
[0025] -、試劑準(zhǔn)備：
[0026] (l)TNF-a:l〇〇yg TNF-α中加入lml無菌去離子水，在室溫下靜置2小時，加入4ml質(zhì) 量分?jǐn)?shù)0.1%BSA-roS溶液，分裝到250μ1的EP管中，-20°C低溫保存，避免反復(fù)凍融，工作濃 度為含500ng/ml TNF-a的碳酸氫鹽緩沖液，使用時，用下面的碳酸氫鹽緩沖液(PH9.6)稀 釋。
[0027] (2)碳酸氫鹽緩沖液:將Na2C03 1.59g和NaHC03 2.93g加入1L的蒸餾水，調(diào)pH達(dá)到 9.6,4°C保存不能超過1個月，使用前需恢復(fù)至室溫
[0028] (3) IFX標(biāo)準(zhǔn)品：用BCA法測量標(biāo)準(zhǔn)品的IFX濃度，并分裝到250μ1的EP管保存于-20 °C，可凍融2次。
[0029] (4)HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體：分裝到250μ1 EP管，-20 °C保存。使用時在495μ 11 %BSA-roS溶液中加入5μ1的HRP標(biāo)記的抗λ鏈單抗，吸取40μ1上述溶液，加入lml 1 % BSA-PBS溶液中，作為工作溶液；
[0030] (5)HRP標(biāo)記的抗F(ab '）2段的IgG抗體:分裝到的250μ 1 EP管，-80°C低溫保存。為 了中期存儲，可與保護(hù)性過氧化物酶溶液按1:100稀釋，4°C可保存超過6個月。工作濃度為 600ng/ml，2yl 加入 lml 1%BSA-PBS 溶液即可；
[0031] (6) TMB: 4 °C保存，使用前需恢復(fù)至室溫
[0032] (7)2M H2S〇4:4°C保存，使用前需恢復(fù)至室溫
[0033] 所述的l%BSA-roS是指質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BSA的PBS溶液，其是在pH7.4磷酸鹽緩沖液 (PBS)中加入BSA使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %，由此得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液；
[0034] 所述的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %BSA-PBS是指質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %BSA的roS溶液，是在pH7.4磷酸 鹽緩沖液(PBS)中加入BSA，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %，由此得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %BSA的PBS溶液。 [0035]二、ATI 的測定
[0036] (1)用100μΙ含500ng/ml TNF-α的碳酸氫鹽緩沖液包被ELISA板，4°C過夜培育
[0037] (2)用 250μ1 0.05%PBST 洗板 2 次，洗去未附著于 ELISA 板上的 TNF-a，用 150μ1 1% BSA-PBS封閉1-2小時，由此得到TNF-a包被ELISA板；
[0038] (3)ELISA板上每孔加入100μΙ 100μg/ml IFX，通過與TNF-a特異性結(jié)合固定于 ELISA板上，作為捕獲ATI的抗原，室溫下孵育1小時，200rpm振動；
[0039] (4)用250μ1 0.05%PBST洗板3次，洗去未結(jié)合的IFX，由此得到抗英夫利西抗體包 被的ELISA板，將抗英夫利西抗體包被的ELISA板的孔分成待測樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線孔；
[0040] (5)在待測樣本孔處加入100μΙ用1%BSA-PBS稀釋的血清(一般稀釋倍數(shù)為100倍， 可根據(jù)結(jié)果減少或增加稀釋倍數(shù)），使血清中的ATI與IFX特異性結(jié)合，以及陰性對照(全陰 性血清，按1:100稀釋），空白對照（1 %BSA-PBS)，同時在標(biāo)準(zhǔn)曲線孔處加入100μΙ 1 %BSA- PBS，每個標(biāo)本設(shè)置1-2個副孔，室溫下孵育1小時，200rpm振動
[00411 (6)用250μ1 0.05%PBST洗板4次，洗去血清中未與IFX結(jié)合的成分
[0042] (7)在標(biāo)準(zhǔn)曲線孔處加入100μΙ HRP標(biāo)記的抗F(ab'）2段的IgG抗體，與結(jié)合于 ELISA板上的IFX結(jié)合，濃度從600ng/ml開始，連續(xù)倍比稀釋，得到7個濃度（600ng/ml， 300ng/ml，150ng/ml，75ng/ml，37 · 5ng/ml，18· 75ng/ml，9 · 375ng/ml)，最后一個孔僅加 1 % BSA-PBS，每個濃度設(shè)置1-2個副孔，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在待測樣本孔中，每孔加入100μΙ HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體，與結(jié)合于IFX上的ATI結(jié)合，不與IFX結(jié)合，室溫下孵育1小時， 200rpm振動
[0043] (8)用250μ1 0.05%roST洗板4次，洗去未結(jié)合的抗F(ab'）2段IgG抗體及抗λ鏈IgG 抗體；
[0044] (9)避光下，每孔加入100μΙ TMB，直到4分鐘后(通常在3-6分鐘變色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔 的顏色深淺決定是否終止反應(yīng))變成藍(lán)色后加入50μ1的2Μ H2S〇4終止反應(yīng)，變成黃色 [0045] (10)在30分鐘內(nèi)于酶標(biāo)儀上讀取450nm的吸光度值。繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出血清 中ATI的濃度。ATI標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
[0046]從圖1可以看出，其檢測范圍為0_600ng/ml，待測樣本的濃度計算方法為將待測樣 本的0D值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的公式，再乘以稀釋倍數(shù)即可。
[0047]選取28例既往未接受過英夫利西治療的克羅恩病或正常受試者作為陰性對照，測 量陰性對照組的血清ATI濃度，可得出血清ATI濃度的檢測下限為1.05±0.79μg/ml?？组g變 異系數(shù)為0.84%，板間變異系數(shù)為7.93%。
[0048]在63個IFX治療的⑶患者中，應(yīng)用本發(fā)明的檢測方法(抗λ鏈ELISA法)可檢測出22 個患者ATI陽性(34.9 % )，而雙抗原夾心法僅可測出18個⑶患者ATI陽性(28.5 % )，有4個患 者遺漏，且這4個患者血清中均可檢測出IFX。為進(jìn)一步驗證血清IFX的存在對ATI檢測的干 擾，選取檢測高濃度ATI且IFX檢測不出的血清作為研究對象，外源性的加入梯度濃度的IFX (2.5，5，7.5，10μg/ml)，室溫下孵育lh后分別用本發(fā)明的檢測方法(抗λ鏈ELISA法)和雙抗 原夾心法檢測ATI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入2.5μg/ml外源性的IFX后，抗λ鏈ELISA法檢測ATI的水平較 未加外源性IFX前下降76%，而隨后加入5,7.5,10μg/ml不再繼續(xù)影響ATI的測定。9份血清 中有3份血清的ATI用抗λ鏈ELISA法是可以檢測出來的，但用雙抗原夾心法完全檢測不出。 而且，該研究發(fā)現(xiàn)16個IFX+ATI +(即血清中可同時檢測出IFX和ATI)的患者隨訪一段時間 后，6個月時有6個患者(37.5%)發(fā)生IFX失應(yīng)答，12個月時有7個患者(43.8%)發(fā)生失應(yīng)答， 24個月時有10個患者(78.6 % )發(fā)生失應(yīng)答，說明抗λ鏈ELISA法在可檢測出IFX的血清中檢 測ATI的敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)的雙抗原夾心法。
[0049] 表1.抗λ鏈ELISA法和雙抗原夾心法檢測ATI
[0052] 所述的0 · 05 % TOST是指含體積分?jǐn)?shù)0 · 05 % Tween-20的PBS溶液，其是在pH 7 · 4的 磷酸鹽緩沖液中加入Tween-20，使其體積分?jǐn)?shù)為0.05 %，由此得到體積分?jǐn)?shù)0.05 % TOST溶 液。
【主權(quán)項】
1. 一種抗英夫利西抗體的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 首先用TNF-α包被ELISA板，然后加入英夫利西單克隆抗體，使英夫利西單克隆抗體與 TNF-a結(jié)合固定于ELISA板上作為固定抗原，將ELISA板上固定有英夫利西單克隆抗體的孔 分成待測樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線孔； 標(biāo)準(zhǔn)曲線孔中加入含BSA的PBS溶液，然后再加入倍比稀釋的已知濃度的抗F(ab'）2段的 IgG抗體，而后加入底物TMB，在HRP的催化下變?yōu)樗{(lán)色，后在酸的作用下變?yōu)辄S色，最后測定 其吸光度值，通過已知濃度的抗F(ab'） 2段的IgG抗體的吸光度值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線； 在待測樣本孔處加入待測血清，使血清中的抗英夫利西抗體(ATI)與IFX結(jié)合從而固定 下來，然后再加入針對ATI的HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體，而后加入底物TMB，在HRP的催化下 變?yōu)樗{(lán)色，后在酸的作用下變?yōu)辄S色，最后測定其吸光度值，根據(jù)待測血清的吸光度值與上 述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出血清中ATI的濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗英夫利西抗體的檢測方法，其特征在于，所述的含BSA的PBS 溶液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗英夫利西抗體的檢測方法，其特征在于，所述的測定吸光度 值是在酶標(biāo)儀讀取450nm的吸光度值。4. 一種抗英夫利西抗體ELISA檢測試劑盒，其特征在于，包括抗英夫利西抗體包被的 ELI SA板、HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體、HRP標(biāo)記的抗F(ab '）2段的IgG抗體、四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)、H2S〇4和輔助試劑組成； 所述的抗英夫利西抗體包被的ELI SA板是通過以下方法制備的：用TNF-α包被ELI SA板， 然后加入英夫利西單克隆抗體，使英夫利西單克隆抗體與TNF-a結(jié)合固定于ELISA板上作為 固定抗原，由此得到英夫利西抗體包被的ELISA板。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗英夫利西抗體ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述的輔助 試劑包括PH9.6的碳酸氫鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %BSA的roS溶 液、體積分?jǐn)?shù)〇. 05 % PBST溶液和蒸餾水。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗英夫利西抗體ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述的用 TNF-a包被ELISA板是用含500ng/ml TNF-a的碳酸氫鹽緩沖液包被ELISA板。
【文檔編號】G01N33/577GK106093413SQ201610571902
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月18日
【發(fā)明人】本·沙朗, 馮婷, 陳旻湖
【申請人】本·沙朗, 陳旻湖