一種孤獨(dú)癥血清糖蛋白標(biāo)記物的用圖
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種孤獨(dú)癥血清糖蛋白標(biāo)記物的用途，通過(guò)凝集素芯片聯(lián)合蛋白質(zhì)譜正向和凝集素/糖?抗體芯片反向同時(shí)驗(yàn)證了在ASD血清中高表達(dá)的糖蛋白Apolipoprotein D(APOD)，此蛋白可以作為孤獨(dú)癥診斷的血清糖蛋白標(biāo)記物。本發(fā)明填補(bǔ)了孤獨(dú)癥生化診斷的空白。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種孤獨(dú)癥血清糖蛋白標(biāo)記物的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于孤獨(dú)癥血清標(biāo)記物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種孤獨(dú)癥血清糖蛋白標(biāo)記物的應(yīng)用，具體涉及糖蛋白Apolipoprotein D(APOD)作為孤獨(dú)癥檢測(cè)標(biāo)記物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]孤獨(dú)癥(自閉癥)譜系障礙(Autism Spectrum Disorders，ASD)是一種先天腦部功能受損而引起的廣泛性發(fā)展障礙，以社會(huì)交往障礙、言語(yǔ)和非言語(yǔ)交流缺陷、興趣狹窄和行為刻板等為主要臨床特征。該障礙最早在1943年被報(bào)道，但將其歸為“精神分裂癥、兒童型”之中，直到1980年才將此障礙與兒童精神病分離開(kāi)來(lái)，并提出了廣泛發(fā)育障礙的概念和分類(lèi)，孤獨(dú)癥是其亞型之一，確定了兒童孤獨(dú)癥的分類(lèi)地位，由此兒童孤獨(dú)癥作為獨(dú)立疾病也越來(lái)越受到關(guān)注與研究。
[0003]目前，兒童孤獨(dú)癥發(fā)病率為1/100，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于癌癥(1/1500)、21三體綜合征(I/800)、糖尿病(1/500)。全世界至少有6700萬(wàn)孤獨(dú)癥患者，我國(guó)孤獨(dú)癥患兒約有60至180萬(wàn)，而且每年以10%到17%的比例增長(zhǎng)，并有上升趨勢(shì)。因此，早期診斷兒童孤獨(dú)癥對(duì)于及早干預(yù)治療，緩解兒童發(fā)育障礙，給患兒和家庭帶來(lái)希望有非?，F(xiàn)實(shí)的意義。
[0004]目前，孤獨(dú)癥診斷的主要依據(jù)是《孤獨(dú)癥診斷訪談(修訂版)》和《孤獨(dú)癥診斷觀察程序表》，以及必要的心理評(píng)估、軀體和神經(jīng)系統(tǒng)檢測(cè)，還有一些必要的輔助檢測(cè)。但這種診斷方式有一定的缺陷性:首先，需要臨床醫(yī)師能夠準(zhǔn)確掌握客觀的病史，充分了解患兒的精神心理發(fā)展情況，否則容易和其他精神疾病相混淆;其次，測(cè)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，從初診到最終確診需要一年時(shí)間；最后，問(wèn)卷調(diào)研對(duì)于小于3歲的兒童，存在困難。因此，急需一種在上述病史基礎(chǔ)上能夠輔助診斷孤獨(dú)癥的客觀指標(biāo)。
[0005]血清蛋白標(biāo)記物的檢測(cè)目前在腫瘤疾病中已得到廣泛應(yīng)用，如肺癌、胃癌及肝癌等。而孤獨(dú)癥診斷的輔助檢測(cè)目前只有腦電圖及CT、MR，還未見(jiàn)血清蛋白標(biāo)記物的報(bào)道。尋找具有診斷或聯(lián)合診斷價(jià)值的血清標(biāo)志物是當(dāng)務(wù)之急，也是ASD早發(fā)現(xiàn)早治療的關(guān)鍵。因此，提供在血清中能夠特異高表達(dá)的基因或蛋白質(zhì)具有重要的診斷和治療意義，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)可用于檢測(cè)或判斷ASD的血清特異標(biāo)志物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種孤獨(dú)癥血清糖蛋白標(biāo)記物的應(yīng)用。
[0007]該孤獨(dú)癥血清糖蛋白為凝集素1^卜11識(shí)別糖鏈5丨&€[2-36&1/6&1財(cái)(3酸化的Apolipoprotein D(APOD) C3APOD在孤獨(dú)癥(ASD)患兒血清中表達(dá)較正常兒童(TD)血清中的表達(dá)上調(diào)1.9倍，高表達(dá)α2-3唾液酸化APOD可以靈敏和特異地區(qū)分ASD(AUC是0.88)和正常人群。
[0008]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0009]本發(fā)明公開(kāi)了糖蛋白Apolipoprotein D可以作為血清檢測(cè)孤獨(dú)癥的診斷標(biāo)記物的用途。[00?0] 本發(fā)明公開(kāi)了糖蛋白Apolipoprotein D在制備血清檢測(cè)孤獨(dú)癥診斷試劑或診斷試劑盒中的用途。
[0011]所述糖蛋白Apolipoprotein D為載脂蛋白，在孤獨(dú)癥血清中高表達(dá)。
[0012]在糖蛋白Apolipoprotein D上具有能夠被凝集素MAL-1I識(shí)別的糖鏈Siaa 2-3Gal/GalNAco
[0013]能夠通過(guò)凝集素/糖-抗體芯片對(duì)血清中的糖蛋白Apolipoprotein D表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
[0014]糖蛋白Apolipoprotein D在孤獨(dú)癥患兒血清中表達(dá)較正常兒童血清中的表達(dá)上調(diào)1.9倍。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0016]本發(fā)明公開(kāi)了一種孤獨(dú)癥血清糖蛋白標(biāo)記物的用途，通過(guò)凝集素芯片聯(lián)合蛋白質(zhì)譜正向和凝集素/糖-抗體芯片反向同時(shí)驗(yàn)證了在A S D血清中高表達(dá)的糖蛋白Apolipoprotein D(APOD)，此蛋白可以作為孤獨(dú)癥診斷的血清糖蛋白標(biāo)記物。本發(fā)明填補(bǔ)了孤獨(dú)癥生化診斷的空白。
[0017]本發(fā)明通過(guò)制備凝集素芯片，將ASD血清與TD血清標(biāo)記cy3后與凝集素芯片雜交，鑒定出在ASD中高表凝集素MAL-1I;其次將血清樣本點(diǎn)在芯片上，cy3標(biāo)的MAL-1I與其雜交，反向驗(yàn)證ASD組的MAL-1I修飾蛋白表達(dá)明顯高于TD組;最后將MAL-1I與磁珠偶聯(lián)，偶聯(lián)磁珠的MAL-1I與血清樣本結(jié)合，將與MAL-1I連接糖鏈結(jié)合的蛋白洗脫、解離后，用蛋白質(zhì)譜鑒定洗脫蛋白，鑒定出在ASD血清中高表達(dá)的糖蛋白是APOD。該糖蛋白可以作為ASD血清標(biāo)記物在臨床診斷中予以應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1a為50例ASD患兒凝集素芯片雜交圖；
[0019]圖1b為50例TD兒童凝集素芯片雜交圖；
[0020]圖2為凝集素芯片反應(yīng)聚類(lèi)分析圖；
[0021 ]圖3為血清樣本中MAL-1I western blot檢測(cè)結(jié)果圖；
[0022]圖4a為血清樣本芯片；
[0023]圖4b為雜交信號(hào)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；
[0024]圖5為MAL-1I結(jié)合糖蛋白的分離與鑒定示意圖；
[0025]圖6為SDS-PAGE銀染分析分離出來(lái)的MAL-1I結(jié)合糖蛋白鑒定結(jié)果圖；
[0026]圖7a為糖蛋白抗體芯片；
[0027]圖7b為糖蛋白抗體反向驗(yàn)證結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0029]1、樣本的收集
[0030]分別自西安市兒童醫(yī)院、西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院及第二附屬醫(yī)院收集確診ASD 65例患兒血清及正常65例對(duì)照兒童血清。其中的50例用于凝集素芯片的檢測(cè)，15例用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。抽取的血液在室溫靜置25min后，1500g離心lOmin，收集上清，保存于-80°C冰箱至檢測(cè)時(shí)。
[0031]2、凝集素芯片檢測(cè)及樣品分析
[0032]將50例ASD和50例TD血清隨機(jī)按每10例一組，每組分為ASD-1，ASD-2，ASD-3，ASD-4，ASD-5及TD-1，TD-2，TD-3，TD-4，TD-5。每10例血清分別混合為混合樣本，用cy3標(biāo)記后與凝集素芯片進(jìn)行雜交。雜交信號(hào)掃描后，用Genepix 3.0軟件分析結(jié)果。
[0033]3、用血清芯片驗(yàn)證凝集素芯片結(jié)果
[0034]I)分別取15例ASD和TD血清樣本，制備為血清芯片。
[0035]2)用cy3 標(biāo)記 MAL-1I。
[0036]3)將標(biāo)記好的MAL-1I與血清芯片雜交。
[0037]4)雜交信號(hào)掃描后用Genepix 3.0軟件分析結(jié)果。
[0038]4、分離和鑒定差異表達(dá)糖蛋白
[0039]I)用磁珠偶聯(lián)MAL-1I凝集素；
[0040]2)將偶聯(lián)好磁珠的MAL-1I與兩組混合血清分別共孵育，之后洗脫MAL-1I結(jié)合蛋白；
[0041]3)洗脫后的MAL-1I結(jié)合蛋白用胰蛋白酶和糖苷酶消化后，收集糖蛋白混合物；
[0042]4)用蛋白質(zhì)譜鑒定糖蛋白。
[0043]5、凝集素/糖-抗體芯片驗(yàn)證ASD患兒血清中APOD的高表達(dá)
[0044]I)將APOD抗體點(diǎn)到芯片上。
[0045]2)將血清樣品與芯片雜交。
[0046]3)洗脫、甩干后與cy 3標(biāo)記的MAL-1I雜交。
[0047]4)洗脫、用干后用Genepix 4000B掃描、Genepix Pro 3.0分析。
[0048]結(jié)果參見(jiàn)附圖，圖1a為50例ASD患兒凝集素芯片雜交圖，圖1b為50例TD兒童凝集素芯片雜交圖，可見(jiàn)ASD組與MAL-1I凝集素結(jié)合的糖鏈高表達(dá)。
[0049]參照?qǐng)D2，凝集素芯片反應(yīng)聚類(lèi)分析圖。將Genepix 3.0分析結(jié)果用Expander 6.0(http://acgt.cs.tau.ac.1l/expander/)分析，生成聚類(lèi)圖。
[0050]參照?qǐng)D3所示，血清樣本中MAL-1I western blot檢測(cè)。結(jié)果所示，在ASD組，MAL-1I凝集素結(jié)合糖蛋白明顯上調(diào)。
[0051 ] 血清樣本芯片與MAL-1I雜交圖參照?qǐng)D4a，為ASD組與TD組血清樣本各取15例點(diǎn)于芯片上，與MAL-1I雜交，結(jié)果顯示ASD組與MAL-1I結(jié)合的糖蛋白較正常組上調(diào)。圖4b為雜交信號(hào)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0052]糖蛋白的分離鑒定，參見(jiàn)圖5，為MAL-1I結(jié)合糖蛋白的分離與鑒定示意圖；圖6是SDS-PAGE銀染分析分離出來(lái)的MAL-1I結(jié)合糖蛋白^SD組洗脫出的蛋白量高于TD組。
[0053]糖蛋白抗體芯片反向驗(yàn)證，參見(jiàn)圖7a用凝集素/糖-抗體芯片檢測(cè)ASD和TD血清樣品中的APOD表達(dá)。即將APOD抗體點(diǎn)樣在芯片上，首先用ASD和TD血樣與芯片雜交，洗脫未結(jié)合蛋白后，與cy3標(biāo)記的MAL-1I雜交，之后用Genepix 4000B掃描雜交信號(hào)，Genepix Pro3.0軟件分析熒光信號(hào)值。結(jié)果顯示ASD組熒光值明顯高于TD組，與前述結(jié)果相符。圖7b為ROC曲線分析血清中α2-3唾液酸化APOD蛋白的相對(duì)量，AUC為0.88，ASD組相對(duì)于TD組其特異性和敏感性分別為86.7 %和80.6 %。
[0054]綜上所述，本發(fā)明通過(guò)凝集素芯片聯(lián)合蛋白質(zhì)譜正向和凝集素/糖-抗體芯片反向同時(shí)驗(yàn)證了在ASD血清中高表達(dá)的糖蛋白APOD，此蛋白可以作為孤獨(dú)癥診斷的血清糖蛋白標(biāo)記物，填補(bǔ)了孤獨(dú)癥生化診斷的空白。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.糖蛋白ApolipoproteinD在制備血清檢測(cè)孤獨(dú)癥診斷試劑或診斷試劑盒中的用途。2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述糖蛋白ApolipoproteinD為載脂蛋白，在孤獨(dú)癥血清中高表達(dá)。3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，在糖蛋白ApolipoproteinD上具有能夠被凝集素MAL-11 識(shí)別的糖鏈S i aa 2_3Ga I /Ga I NAc。4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，能夠通過(guò)凝集素/糖-抗體芯片對(duì)血清中的糖蛋白Apolipoprotein D表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，糖蛋白ApolipoproteinD在孤獨(dú)癥患兒血清中表達(dá)較正常兒童血清中的表達(dá)上調(diào)1.9倍。
【文檔編號(hào)】G01N33/96GK106093441SQ201610601323
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月27日 公開(kāi)號(hào)201610601323.5, CN 106093441 A, CN 106093441A, CN 201610601323, CN-A-106093441, CN106093441 A, CN106093441A, CN201610601323, CN201610601323.5
【發(fā)明人】黃辰, 秦棪楠, 劉利英, 陳艷妮
【申請(qǐng)人】西安交通大學(xué)