一種玉米細(xì)菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及了一種玉米細(xì)菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，可以實(shí)現(xiàn)玉米細(xì)菌性枯萎病菌的快速檢測(cè)，適用于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、進(jìn)出口糧食的快速檢測(cè)與應(yīng)急處理，屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米細(xì)菌性枯萎病(7 5.Bacterial Wilt of Cbr/?)是玉米上的一種毀滅性的病害，我國尚無該病害發(fā)生。玉米細(xì)菌性枯萎病菌(/^s)屬于腸桿菌科多源菌屬，是一種黃色、不運(yùn)動(dòng)、無內(nèi)生孢子、革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，可以引起玉米細(xì)菌性枯萎病。1897年首次發(fā)現(xiàn)于美國紐約長島，之后傳播到世界其他地區(qū)。目前已知發(fā)生地區(qū)有加拿大、墨西哥、巴西、秘魯、圭亞那、意大利、波蘭、羅馬尼亞、南斯拉夫、泰國、越南、馬來西亞等。玉米細(xì)菌性枯萎病菌可以通過帶菌種子遠(yuǎn)距離傳播(種傳)，在病區(qū)則以昆蟲傳播為主，如玉米跳甲等，玉米在生長的各個(gè)階段均能被玉米細(xì)菌性枯萎病菌進(jìn)行侵染。在國際貿(mào)易中，帶菌種子是該病遠(yuǎn)距離傳播的主要因素，是傳入無病區(qū)的主要侵染源。我國目前尚未發(fā)現(xiàn)玉米細(xì)菌性枯萎病的發(fā)生，但傳入風(fēng)險(xiǎn)很高，已經(jīng)列為我國進(jìn)境一類檢疫對(duì)象，只有證實(shí)未染菌的玉米產(chǎn)品才可以入境。在1992年農(nóng)業(yè)部頒布的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性病、蟲、雜草名錄》中，被列為一類危險(xiǎn)性有害生物。
[0003]對(duì)玉米細(xì)菌性枯萎病菌的檢測(cè)診斷方法包括野外觀察、生理生化鑒定、免疫學(xué)檢測(cè)和鑒定、以及PCR檢測(cè)技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)和生物傳感技術(shù)也被用來檢測(cè)玉米細(xì)菌性枯萎病菌。但生化檢測(cè)技術(shù)耗時(shí)過長，且檢測(cè)結(jié)果存在不可靠性。PCR檢測(cè)技術(shù)相比具有很好的靈敏性與準(zhǔn)確性，但由于依賴于昂貴的儀器和專業(yè)的檢測(cè)人員，不適用于大量產(chǎn)品的快速檢測(cè)。ELISA檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)靈敏度上雖然不如PCR方法，但是具有檢測(cè)快速、批量、便宜的優(yōu)勢(shì)。而膠體金試紙條具有操作簡單、穩(wěn)定性高、不需要借助專門儀器、適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。
[0004]由于玉米細(xì)菌性枯萎病菌會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)帶來巨大威脅與損失，因此快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法顯得尤為重要。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0005]本實(shí)用新型目的在于提供一種檢測(cè)玉米細(xì)菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，操作簡單，快速方便，靈敏度高，穩(wěn)定性好，成本低廉。
[0006]本實(shí)用新型適用于海關(guān)、糧倉、企業(yè)、檢驗(yàn)檢疫單位等，可實(shí)現(xiàn)大量糧食或種子樣本中玉米細(xì)菌性枯萎病菌的快速檢測(cè)。
[0007]本實(shí)用新型的技術(shù)方案，一種玉米細(xì)菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，包括PVC底板，在PVC底板兩端分別設(shè)有樣品墊和吸水墊；
[0008]在PVC底板中部設(shè)置有硝酸纖維素膜檢測(cè)層，在硝酸纖維素膜檢測(cè)層與樣品墊之間設(shè)置有金標(biāo)墊；所述金標(biāo)墊一端與樣品墊相連接疊放，金標(biāo)墊另一端疊放于硝酸纖維素膜檢測(cè)層上；
[0009]所述硝酸纖維素膜檢測(cè)層上依次設(shè)置有檢測(cè)線和質(zhì)控線。
[0010]所述金標(biāo)墊上包被有金標(biāo)標(biāo)記抗玉米細(xì)菌性枯萎病菌抗體(12B4)；
[0011]所述檢測(cè)線上包被有抗玉米細(xì)菌性枯萎病菌抗體(10B1)；
[0012]所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgG。
[0013]所述玉米細(xì)菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備方法，步驟如下:
[0014](I)玉米細(xì)菌性枯萎病菌單克隆抗體的制備
[0015]單克隆抗體是采用玉米細(xì)菌性枯萎病菌(NCPPB 449，來自湖南省進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局)菌體經(jīng)過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進(jìn)行首免，I X 18Cfu玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第四周進(jìn)行二免，IX 18Cfu玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第六周進(jìn)行三免，I X 17 cfu玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第七周尾部采血測(cè)效價(jià)，分別挑選對(duì)玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體效價(jià)最高的老鼠；第九周進(jìn)行沖刺免疫，I X 17Cfu玉米細(xì)菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后分別眼眶采血后進(jìn)行融合、篩選，共篩選到5個(gè)細(xì)胞株；
[0016](2)單克隆抗體的配對(duì)篩選
[0017]將步驟(I)中純化后的5株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對(duì)，確定特異性免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條所需要的抗玉米細(xì)菌性枯萎病菌抗體；其中12B4為金標(biāo)抗體，1Bl為包被抗體；
[0018](3)玉米細(xì)菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備:
[0019]a、空白膠體金的制備:
[0020]采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200mL去離子水和2mL 1%氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4mL 1%朽1檬酸鈉,繼續(xù)加熱15~20min,至呈亮紅色,然后室溫中冷卻，4 C冷減保存；
[0021]b、膠體金標(biāo)記抗體的制備:
[0022]空白膠體金溶液用0.1M K2CO3調(diào)節(jié)pH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度步驟(2)制備的抗體，每mL膠體金加入30 μ g抗體12B4,繼續(xù)攪拌30 min,離心,吸取上清,用金標(biāo)抗體保存液(0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液)重旋；
[0023]C、金標(biāo)墊的制備:
[0024]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器(HM3055)，將lmg/mL標(biāo)記好膠體金的抗玉米細(xì)菌性枯萎病菌抗體(12B4)均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6μ L/cm，37°C烘干過夜，封袋備用;
[0025]d、包被膜的制備:
[0026]調(diào)試三維平面點(diǎn)膜噴金儀儀器(HM3055)，將lmg/mL抗玉米細(xì)菌性枯萎病菌抗體(10B1)均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測(cè)線；將羊抗鼠IgG抗體均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，噴液量均為0.6μ L /cm，37°C烘干過夜，封袋備用。
[0027]將PVC底板、樣品墊、金標(biāo)墊、涂有檢測(cè)線與質(zhì)控線的硝酸纖維素膜檢測(cè)層、和吸水墊組合，即得產(chǎn)品玉米細(xì)菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條。
[0028]其適用于海關(guān)、糧倉、企業(yè)、檢驗(yàn)檢疫單位等，可實(shí)現(xiàn)糧食或種子樣本中玉米細(xì)菌性枯萎病菌的快速檢測(cè)，最低檢測(cè)限為IX15 cfu/mL。
[0029]本實(shí)用新型試紙條的工作原理:采用膠體金免疫層析技術(shù)，選用玉米細(xì)菌性枯萎病菌特異性抗體作為固相物，利用雙抗體夾心法原理檢測(cè)樣品中是否含有玉米細(xì)菌性枯萎病菌。當(dāng)待檢樣品中含有玉米細(xì)菌性枯萎病菌時(shí)，抗原先和膠體金標(biāo)記的抗玉米細(xì)菌性枯萎病菌抗體(12B4)結(jié)合，由于層析作用復(fù)合物沿包被膜向前移動(dòng)，當(dāng)遇到檢測(cè)線上的抗玉米細(xì)菌性枯萎病菌抗體(1Bl)時(shí)，形成抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，在檢測(cè)線上富集，形成紅色沉淀線。
[0030]與其他檢測(cè)方法相比，免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):1、迅速；2、靈敏度高；3、成本低廉；4、安全簡便。
[0031]本實(shí)用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0032]1.檢測(cè)速度快，全過程只需要5 min即可，可以試驗(yàn)大批量樣品的快速檢測(cè)；
[0033]2.靈敏度高，最低檢測(cè)限為IXlO5 cfu/mL ；
[0034]3.操作簡便，無需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，易于推廣；
[0035]4.不需要儀器，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；
[0036]5.過程簡單,直接上樣檢測(cè),樣本量少。