倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型屬于微觀組織及結(jié)構(gòu)觀測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種倒置激光共聚焦顯 微鏡動(dòng)植物活體觀測裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 激光掃描共聚焦顯微鏡是二十世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高 科技產(chǎn)品，它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理， 把光學(xué)成像的分辨率提高了 309^40%，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組 織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。激光掃描共聚焦顯微鏡在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca 2+、pH值， 膜電位等生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué) 等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。
[0003] 從一個(gè)點(diǎn)光源發(fā)射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點(diǎn) 上，那么反射光通過原透鏡應(yīng)當(dāng)匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦，簡稱共焦。共焦 顯微鏡[ConfocalLaserScanningMicroscope (CLSM 或 LSCM)]在反射光的光路上加上 了一塊半反半透鏡（BeamSplitter)，將已經(jīng)通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點(diǎn) 上有一個(gè)帶有針孔（Pinhole)的擋板，小孔就位于焦點(diǎn)處，擋板后面是一個(gè)光電倍增管 (pHotomultipliertube，PMT)。可以想像，探測光焦點(diǎn)前后的反射光通過這一套共焦系統(tǒng)， 必不能聚焦到小孔上，會(huì)被擋板擋住。于是光度計(jì)測量的就是焦點(diǎn)處的反射光強(qiáng)度。其意 義是：通過移動(dòng)透鏡系統(tǒng)可以對一個(gè)半透明的物體進(jìn)行三維掃描。
[0004] 激光共聚焦成像系統(tǒng)能夠用于觀察各種染色、非染色和熒光標(biāo)記的組織和細(xì)胞 等，觀察研究組織切片，細(xì)胞活體的生長發(fā)育特征，研究測定細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和能量轉(zhuǎn)換。 能夠進(jìn)行活體細(xì)胞中離子和PH值變化研究（RATIO)，神經(jīng)遞質(zhì)研究，微分干涉及熒光的斷 層掃描，多重?zé)晒獾臄鄬訏呙杓爸丿B，熒光光譜分析熒光各項(xiàng)指標(biāo)定量分析熒光樣品的時(shí) 間延遲掃描及動(dòng)態(tài)構(gòu)件組織與細(xì)胞的三維動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)件，熒光共振能量的轉(zhuǎn)移的分析，熒 光原位雜交研究（FISH)，細(xì)胞骨架研究，基因定位研究，原位實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物分析，熒光漂白 恢復(fù)研究（FRAP)，胞間通訊研究，蛋白質(zhì)間研究，膜電位與膜流動(dòng)性等研究，完成圖像分析 和三維重建等分析。
[0005] 但是共聚焦顯微鏡對樣品要求較高，常規(guī)只能進(jìn)行玻片和培養(yǎng)皿的觀察，并且高 倍的活細(xì)胞觀察只能在特制的培養(yǎng)皿中完成，無法進(jìn)行動(dòng)植物活體成像，使得其本身具有 的多通道熒光同時(shí)檢測，以及多色熒光視頻錄制的功能在需要活體觀察的領(lǐng)域使用范圍受 到了局限。近期我們移植的轉(zhuǎn)染GFP的干細(xì)胞的成活和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，只能通過殺死動(dòng)物后制 作玻片進(jìn)行檢測，必須在顯微鏡觀察之前對樣品進(jìn)行固定切片等一系列操作，得到的結(jié)果 因?yàn)椴僮鞑襟E多，與動(dòng)植物活體時(shí)的狀態(tài)有較大差異。在藥物效果監(jiān)測方面的病理切片會(huì) 受到藥物體內(nèi)代謝，動(dòng)物體本身差異等影響導(dǎo)致檢測結(jié)果可靠性較差。當(dāng)我們獲得了一個(gè) 比較理想的切片結(jié)果，需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，原實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已經(jīng)處死，無法執(zhí)行，新的 動(dòng)物模型必然與原實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有差異，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性和結(jié)果可靠性較差。
[0006] 因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前微觀組織及結(jié)構(gòu)觀測技術(shù)領(lǐng)域亟需解決的 問題。 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0007] 本實(shí)用新型的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種倒置激光共聚焦顯微鏡 動(dòng)植物活體觀測裝置，本實(shí)用新型將傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)放到動(dòng)植物活體上來進(jìn)行，并 可用激光共聚焦顯微鏡觀察動(dòng)植物活體局部器官組織內(nèi)部的高精度顯微圖像，結(jié)果更加可 〇
[0008] 本實(shí)用新型采用的技術(shù)方案如下：
[0009] 倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測裝置，包括共聚焦樣品平臺、負(fù)壓產(chǎn)生裝 置和倒置式顯微鏡；
[0010] 所述的負(fù)壓產(chǎn)生裝置包括電機(jī)、負(fù)壓泵和廢液罐；所述電機(jī)用于驅(qū)動(dòng)負(fù)壓泵，所述 負(fù)壓泵的進(jìn)氣口通過第一耐壓軟管與廢液罐的出氣口相連通，負(fù)壓泵的出口連通大氣； [0011] 廢液罐的進(jìn)氣口通過第二耐壓軟管與鋼管相連通，所述的共聚焦樣品平臺中間設(shè) 有凹槽，凹槽底部設(shè)有通孔，通孔處設(shè)有玻片，玻片通過凡士林與通孔密封連接；
[0012] 所述的鋼管與凹槽相連通；倒置式顯微鏡位于共聚焦樣品平臺的正下方。
[0013] 進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的鋼管通過環(huán)氧樹脂固定與共聚焦樣品平臺固定連接。
[0014] 進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的鋼管的彎折部分采用圓角折彎，保持內(nèi)部暢通。鋼管的作 用為導(dǎo)流氣體及廢液。
[0015] 進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的凹槽為倒置的圓臺形。
[0016] 用上述倒置激光共聚焦顯微鏡動(dòng)植物活體觀測裝置進(jìn)行動(dòng)植物活體觀測方法，包 括如下步驟：
[0017] 步驟（1)，確認(rèn)熒光指示劑標(biāo)記方案并進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)記；
[0018] 步驟（2)，小動(dòng)物按照體重比例由血管注入相應(yīng)計(jì)量麻醉劑，全身麻醉，并作觀測 部位相應(yīng)手術(shù)，使觀測部位暴漏出來，并進(jìn)行相應(yīng)的止血工作；
[0019] 步驟（3)，小動(dòng)物肢體終端穩(wěn)定固定在共聚焦樣品平臺上，通過觀測部位實(shí)施手術(shù) 的創(chuàng)口，將觀測器官置于觀測平臺玻片部位，排除氣泡；
[0020] 步驟（4)，觀測部位血管顯微鏡初檢，確認(rèn)血液流通良好，然后進(jìn)行預(yù)掃描；
[0021] 步驟（5)，根據(jù)預(yù)掃描結(jié)果對觀測部位進(jìn)行牽拉壓迫固定，但不能影響到血液流 通，直至觀測畫面穩(wěn)定；
[0022] 步驟（6)，共聚焦timelapse掃描，對觀測動(dòng)物進(jìn)行熒光指示劑標(biāo)記和給藥，獲取 實(shí)時(shí)的共聚焦圖片；
[0023] 步驟（7 )，數(shù)據(jù)分型，并形成相應(yīng)視頻文件。
[0024] 本實(shí)用新型的共聚焦樣品平臺可適合作為組織高倍放大觀察的倒置式顯微鏡觀 測平臺，使得共聚焦能夠獲取活體內(nèi)部組織細(xì)胞圖像，并可記錄視頻圖像，此平臺利用負(fù)壓 使觀測組織緊密貼在觀測平面上并排出組織積液。
[0025] 負(fù)壓產(chǎn)生裝置，包括電機(jī)、負(fù)壓泵和廢液罐。負(fù)壓泵產(chǎn)生負(fù)壓。廢液罐也兼作負(fù)壓 罐，不僅用來維持壓力穩(wěn)定，還用來儲(chǔ)存組織積液。
[0026] 本實(shí)用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：
[0027] 利用本實(shí)用新型技術(shù)方案，共聚焦可以用于觀察動(dòng)植物活體內(nèi)部局部組織的高精 度顯微圖像。所有已進(jìn)行的細(xì)胞層面的實(shí)驗(yàn)，可以擴(kuò)展到細(xì)胞與組織層面，甚至來反映活體 整體的狀況。同時(shí)，利用本實(shí)用新型技術(shù)方案可以將細(xì)胞層面的實(shí)驗(yàn)放到動(dòng)植物活體上來 進(jìn)行，觀察動(dòng)植物活體局部組織內(nèi)部的高精度顯微圖像，同時(shí)獲取多個(gè)指標(biāo)，觀察動(dòng)植物組 織細(xì)胞和組織層面動(dòng)態(tài)變化在動(dòng)植物活體上的效果。
[0028] 共聚焦顯微鏡傳統(tǒng)的用途主要是：觀察研究組織切片，細(xì)胞活體的生長發(fā)育特征， 研究測定細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和能量轉(zhuǎn)換，細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，熒光原位雜交研究，基因定位研究 及三維重建分析，這些都是細(xì)胞或者更細(xì)微層面的研究。本實(shí)用新型保持共聚焦的原有優(yōu) 勢，并將這些優(yōu)勢擴(kuò)展到動(dòng)植物活體的層面。
[0029] 將傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)放到動(dòng)植物活體上來進(jìn)行，并可用激光共聚焦顯微鏡觀 察動(dòng)植物活體局部器官組織內(nèi)部的高精度顯微圖像，結(jié)果更加可靠。同時(shí)獲取多個(gè)指標(biāo)，