一種脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮復(fù)合免疫親和柱的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮復(fù)合免疫親和柱。
【背景技術(shù)】
[0002]脫氧雪腐鐮刀烯醇(嘔吐毒素，DON)和玉米赤霉烯酮同屬鐮刀霉毒素，主要是由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生，常見于小麥，玉米等谷物中?？蓪?duì)人、畜產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)，如食欲降低、體重減輕、代謝紊亂等。脫氧雪腐鐮刀烯醇污染谷物的狀況非常普遍，是檢出率和檢出量最高的真菌毒素之一，人畜攝入了被脫氧雪腐鐮刀烯醇污染的食物后，會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)和反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡，但不同的動(dòng)物對(duì)脫氧雪腐鐮刀烯醇的敏感程度不一，豬最敏感。另外脫氧雪腐鐮刀烯醇對(duì)免疫系統(tǒng)有影響，有明顯胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遺傳毒性，但無(wú)致癌、致突變作用。
[0003]玉米赤霉烯酮是一種酚的二羥基苯酸的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生，粉紅鐮刀菌、竄珠鐮刀菌、三線鐮刀菌等多種鐮刀菌也能產(chǎn)生，首先由赤霉病玉米中分離得出。玉米赤霉烯酮具有雌激素樣作用，具有較強(qiáng)的生殖毒性和致畸作用，可引起動(dòng)物發(fā)生雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致動(dòng)物流產(chǎn)、死胎、返情等生殖異?，F(xiàn)象，對(duì)家禽、豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。2003年止，據(jù)世界糧農(nóng)組織公布已有19個(gè)國(guó)家制定了食物中玉米赤霉烯酮的限量標(biāo)準(zhǔn)。
[0004]目前，真菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法，免疫分析法及精密儀器分析法。其中，免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫法和膠體金免疫層析法，可以對(duì)樣品中的真菌毒素進(jìn)行快速的定量、定性檢測(cè)；精密儀器分析法主要有高效液相色譜法、超高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法，可以對(duì)樣品中的真菌毒素進(jìn)行精確定性、定量分析，是真菌毒素檢測(cè)的確認(rèn)方法。但是，由于需要檢測(cè)樣品種類繁多，影響因素各種各樣，要想使這些檢測(cè)方法能夠達(dá)到理想的檢測(cè)效果，則需要將樣品進(jìn)行不同程度的前處理。
[0005]免疫親和柱是利用抗原抗體反應(yīng)的高特異性和高親和力，用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑻禺愋缘目贵w結(jié)合到固相載體上，以便有效的分離、純化目標(biāo)物質(zhì)，具有選擇性高、富集能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，用于真菌毒素檢測(cè)的樣本前處理，可以更好的消除影響因素，減小基質(zhì)效應(yīng)，減少假陽(yáng)性和假陰性的出現(xiàn)。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0006]本實(shí)用新型的目的在于提供一種脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮復(fù)合免疫親和柱，用于樣品中脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮檢測(cè)的樣品前處理方法。
[0007]本實(shí)用新型所述的免疫親和柱由柱管、瓊脂糖凝膠、篩板、上下帽組成；瓊脂糖凝膠上偶聯(lián)了抗脫氧雪腐鐮刀烯醇單克隆抗體和抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，由上下各一塊篩板固定在柱管底部；柱管的兩端分別蓋有上帽和下帽。其所用瓊脂糖凝膠為CNBr-Sepharose 4B，每根親和柱含量為0.3ml_0.5ml ;每根親和柱所含抗脫氧雪腐鐮刀稀醇單克隆抗體和抗玉米赤霉稀酮單克隆抗體分別為0.8 mg -2.5mg和0.5 mg -2mg ;柱管為3ml或Iml的柱管。
[0008]本實(shí)用新型所述的免疫親和柱的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行:
[0009](I)抗體預(yù)處理:將純化好的抗脫氧雪腐鐮刀稀醇單克隆抗體及抗玉米赤霉稀酮單克隆抗體置于PH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHC03緩沖液中透析12h ；
[0010](2)凝膠活化:稱取適量的CNBr-S印harose 4B干粉，用ImM鹽酸浸泡使其充分溶脹后，在砂心漏斗中用ρΗ8.3含有0.5Μ NaCl的0.1M NaHC03緩沖液快速抽洗3次；
[0011](3)偶聯(lián):將活化好的凝膠加入到透析好的抗體溶液中，迅速混勻，室溫下震蕩充分反應(yīng)2h，在砂心漏斗抽濾中用5倍體積的0.1M NaHC03緩沖液抽洗；
[0012](4)封閉:將凝膠轉(zhuǎn)入5倍體積ρΗ8.0含0.5Μ NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液中，室溫下震蕩充分反應(yīng)2h ；
[0013](5)洗滌:用5—10倍凝膠體積的pH4.0含0.5M NaCl的0.1M醋酸鹽緩沖液和5—10倍凝膠體積的pH8.0含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液交替抽洗三次，然后用5—10倍凝膠體積的ρΗ7.3含0.5Μ NaCl的0.05Μ PBS緩沖液抽洗三次；
[0014](6)裝柱:將偶聯(lián)好的凝膠分裝入Iml或者3ml的空柱中，用篩板將凝膠固定在柱的底部，并用PH7.3含0.5M NaCl的0.05M PBS緩沖液平衡，蓋上上下帽，4°C保存。
[0015]本實(shí)用新型親和柱具有如下有益效果:
[0016](I)特異性好。本實(shí)用新型親和柱使用的是分別針對(duì)脫氧雪腐鐮刀烯醇和玉米赤霉烯酮的單克隆抗體，只特異性純化、富集脫氧雪腐鐮刀烯醇和玉米赤霉烯酮。
[0017](2)減少了樣品前處理過(guò)程中有機(jī)化合物的使用。
[0018](3)可以對(duì)樣品中的脫氧雪腐鐮刀烯醇和玉米赤霉烯酮同時(shí)進(jìn)行純化、富集。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1:親和柱結(jié)構(gòu)示意圖。I為上帽，2為柱管，3、5為篩板，4為凝膠，6為下帽。
[0020]圖2:親和柱樣本純化流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]1、脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮復(fù)合免疫親和柱的制備
[0022](I)抗體預(yù)處理:將純化好的抗脫氧雪腐鐮刀稀醇單克隆抗體及抗玉米赤霉稀酮單克隆抗體置于PH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHC03緩沖液中透析12h ；
[0023](2)凝膠活化:稱取適量的CNBr-S印harose 4B干粉，用ImM鹽酸浸泡使其充分溶脹后，在砂心漏斗中用ρΗ8.3含有0.5Μ NaCl的0.1M NaHC03緩沖液快速抽洗3次；
[0024](3)偶聯(lián):將活化好的凝膠加入到透析好的抗體溶液中，迅速混勻，室溫下震蕩充分反應(yīng)2h，在砂心漏斗抽濾中用5倍體積的0.1M NaHC03緩沖液抽洗；
[0025](4)封閉:將凝膠轉(zhuǎn)入5倍體積ρΗ8.0含0.5Μ NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液中，室溫下震蕩充分反應(yīng)2h ；
[0026](5)洗滌:用5—10倍凝膠體積的pH4.0含0.5M NaCl的0.1M醋酸鹽緩沖液和5—10倍凝膠體積的pH8.0含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液交替抽洗三次，然后用5—10倍凝膠體積的ρΗ7.3含0.5Μ NaCl的0.05Μ PBS緩沖液抽洗三次；
[0027](6)裝柱:將偶聯(lián)好的凝膠分裝入Iml或者3ml的空柱中，用篩板將凝膠固定在柱的底部，并用PH7.3含0.5M NaCl的0.05M PBS緩沖液平衡，蓋上上下帽，4°C保存。
[0028]2、脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮復(fù)合免疫親和柱的使用方法
[0029](I)取25g粉碎的樣品與10ml甲醇-水(7:3)溶液混合；
[0030](2)加入5.0g氯化鈉以均質(zhì)器高速攪拌，提取2分鐘；
[0031](3) 4000r/min離心5min或用定性濾紙過(guò)濾；
[0032](4)取1ml濾液并加入40ml水稀釋，用玻璃微纖維濾紙過(guò)濾；
[0033](5)取20ml (4)步濾液，以約6ml/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱；
[0034](6)以10.0ml水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2ml~3ml空氣通過(guò)柱體；
[0035](7)準(zhǔn)確加入1.0ml色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為I ml/min ~2ml/min,收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮的復(fù)合免疫親和柱，由柱管、瓊脂糖凝膠、篩板、上下帽組成；瓊脂糖凝膠上偶聯(lián)了抗脫氧雪腐鐮刀烯醇單克隆抗體和抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，由上下各一塊篩板固定在柱管底部；柱管的兩端分別蓋有上帽和下帽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫親和柱，其特征在于所述的瓊脂糖凝膠為CNBr-Sepharose4B。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫親和柱，其特征在于每根親和柱所含抗脫氧雪腐鐮刀烯醇單克隆抗體和抗玉米赤霉稀酮單克隆抗體分別為0.8 mg -2.5mg和0.5 mg -2mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫親和柱，其特征在于每根親和柱所含瓊脂糖凝膠為0.3ml_0.5ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫親和柱，其特征在于所述的柱管為3ml或Iml的柱管。
【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種脫氧雪腐鐮刀烯醇、玉米赤霉烯酮的復(fù)合免疫親和柱，由柱管、瓊脂糖凝膠、篩板、上下帽組成，瓊脂糖凝膠上偶聯(lián)了抗脫氧雪腐鐮刀烯醇單克隆抗體和抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，由上下各一塊篩板固定在柱管底部，柱管的兩端分別蓋有上帽和下帽。本實(shí)用新型能夠與脫氧雪腐鐮刀烯醇和玉米赤霉烯酮特異結(jié)合，可用于飼料、食品等樣本中脫氧雪腐鐮刀烯醇和玉米赤霉烯酮污染檢測(cè)的樣本前處理，起到凈化、富集作用。
【IPC分類】G01N33-577
【公開號(hào)】CN204556644
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201520250082
【發(fā)明人】張波, 王松雪, 謝剛
【申請(qǐng)人】北京康源泰博生物科技有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年4月23日