肌鈣蛋白i、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶定量聯(lián)檢試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于免疫檢測領(lǐng)域，具體涉及一種高靈敏度肌鈣蛋白1、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶定量聯(lián)檢試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]心肌肌I丐蛋白I (Cardiac troponin I，cTnl)是分子量22.5kD的心肌蛋白，和肌鈣蛋白T(TnT)，肌鈣蛋白C(TnC) —起，形成肌鈣蛋白復(fù)合體，從而對細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號的傳遞和肌動-肌球蛋白的相互作用起著極其主要的作用。急性心肌梗塞(AMI)發(fā)作后肌鈣蛋白復(fù)合體分解，cTnl快速地釋放入血液循環(huán)。盡管骨髂肌中也有肌鈣蛋白I，但其氨基酸組成和cTnl不同，造成二者的免疫活性不同，進(jìn)而保證了 cTnl測試的準(zhǔn)確性。AMI癥狀發(fā)作后4-6小時cTnl才達(dá)到正常值上限，12-24小時后達(dá)到最高濃度，有時能維持6_10天。正常血清cTnl低于0.06ng/ml，有些AMI患者cTnl可高達(dá)I, 300ng/mlo與CK-MB相比，cTnl對心肌損傷的診斷敏感性更高，特導(dǎo)性更強，持續(xù)時間更長。因此cTnl測定對再發(fā)AMI的診斷尤其有幫助，還可診斷微小心梗，故對不穩(wěn)定性心絞痛(UA)和非ST抬高的AMI的鑒別有極大幫助。
[0003]肌紅蛋白(Myoglobin，ΜΥ0)是一種氧結(jié)合血紅素蛋白，其分子量為16.7KD，主要分布于心肌和骨骼肌組織，呈緊密球形。因為腎衰時也可增高，其特異性就不很高(76%)。但由于分子量小，容易釋放入外周血，在心肌損傷時能很快釋放出來，是即時的最易檢出的心肌壞死時的生化標(biāo)志物，即在出現(xiàn)癥狀后的1-3小時就可見于血清中(敏感性60% )，其高峰為AMI后的3-6小時(敏感性90% )。由于其半衰期很短，故在較晚(6-8小時后)對AMI的診斷價值就很小。
[0004]肌酸激酶(Creatinekinase，CK)舊稱為肌酸磷酸激酶(Creatinephosphokinase，CPK)。CK分子量為81000，由兩個亞基組成。通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個與細(xì)胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)。CK在ATP參與下催化肌酸磷酸化，生成ATP和磷酸肌酸。肌酸激酶有四種同功酶形式:肌肉型(CK-MM)、腦型(CK-BB)、雜化型(CK-MB)和線粒體型(CK-MiMi)。CK-MM型主要存在于各種肌肉細(xì)胞中，CK-BB型主要存在于腦細(xì)胞中，CK-MB型主要存在于心肌細(xì)胞中，CK-MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌線粒體中。
[0005]CK-MB在傳統(tǒng)心肌酶學(xué)中曾作為診斷AMI的金標(biāo)準(zhǔn)，然而25% -50%的AMI患者在發(fā)病4小時內(nèi)處于正常水平，造成約10%的患者被漏診。CK-MB的心肌特異性較高，胸痛發(fā)生后4-6小時開始升高，但亦存在于骨骼肌中，骨骼肌損傷時增高。另正常人血中也存在，正常存在與病理性增加之間有交叉，敏感性不高，不能診斷微小心肌梗死。
[0006]綜上所述，cTnl、ΜΥ0、CK-MB幾種心肌標(biāo)志物的臨床診斷價值各不相同，如果單一檢測某一項指標(biāo)對AMI的檢測是不夠的。研究認(rèn)為對cTnl、ΜΥ0、CK-MB這三種標(biāo)志物聯(lián)合檢測，進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，有助于防止漏診。在胸痛發(fā)作l_3h內(nèi)MYO的檢測優(yōu)于cTnl，但在4-6h這三種標(biāo)志物均具有較高的敏感性，因此對胸痛的患者進(jìn)行cTnl、MYO和CK-MB三項指標(biāo)的聯(lián)合檢測，對于AMI的早期發(fā)現(xiàn)有重要價值。研究結(jié)果顯示，cTn1、MYO、CK-MB三合一聯(lián)合檢測的敏感性為96.6 %，特異性為95-8 %，提高了單一指標(biāo)診斷AMI的敏感性和特異性。三者有效結(jié)合，對AMI的早期診斷和排除提供了更確鑿的指標(biāo)支持，提高了診斷的窗口期，為胸痛發(fā)作或臨床可疑為AMI的病人作出正確和及時的診斷，進(jìn)而為臨床醫(yī)師及時搶救和診治病人提供了快捷有效的依據(jù)。
[0007]目前國內(nèi)市場上檢測產(chǎn)品并不多，均采用膠體金法，但檢測靈敏度有一定的不足。
[0008]膠體金法:
[0009]該檢測應(yīng)用了膠體金技術(shù)，包括膠體金標(biāo)記的單克隆抗體和非特異性的抗抗體。當(dāng)患者的標(biāo)本(如:血清)加入標(biāo)本孔，金標(biāo)單克隆抗體與標(biāo)本中的cTnl/MYO/CK-MB結(jié)合，形成金標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物。該復(fù)合物在反應(yīng)膜上移動，與固定在膜上的抗抗體結(jié)合形成更大的復(fù)合物，復(fù)合物顏色深淺與cTnl/MYO/CK-MB的濃度成正比。
[0010]生物素-親和素系統(tǒng)(b1tinavidin system，BAS)，是一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。將該系統(tǒng)應(yīng)用于免疫組化，酶聯(lián)免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測技術(shù)中，可顯著地提高以上技術(shù)方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，使方法更簡便，有助于臨床快速診斷，并利于進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，成為研究免疫反應(yīng)的有力工具。由于BAS檢測系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)快速，又無放射物質(zhì)污染，不需復(fù)雜儀器，充分顯示了此系統(tǒng)的巨大潛力和應(yīng)用的可能性。
[0011]生物素-親和素系統(tǒng)檢測原理:BAS是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結(jié)合常數(shù)高達(dá)K^M1)。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時的催化作用而呈色，達(dá)到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學(xué)特性的一種蛋白質(zhì)，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結(jié)合一個生物素，因幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親和素或鏈霉親合素結(jié)合。利用生物素-親和素系統(tǒng)研制肌鈣蛋白1、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶定量聯(lián)檢快速診斷試劑尚無報道。
【實用新型內(nèi)容】
[0012]本實用新型的目的，在于提供一種肌鈣蛋白1、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶定量聯(lián)檢試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側(cè)向?qū)游龊蜕锼?鏈霉親和素放大系統(tǒng)，提供高靈敏度肌鈣蛋白1、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶定量聯(lián)檢試紙條。使用本實用新型時，提高了檢測靈敏度和檢測穩(wěn)定性，降低了非特異性結(jié)合，聯(lián)合檢測大幅度提高檢測的準(zhǔn)確性和便利性，檢測時間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0013]本實用新型解決其技術(shù)問題的解決方案是:肌鈣蛋白1、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶定量聯(lián)檢試紙條，其包括底板，所述底板上依次設(shè)有樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標(biāo)記物結(jié)合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區(qū)，所述樣品墊交疊壓在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上固定有生物素標(biāo)記的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體、生物素標(biāo)記的肌紅蛋白單克隆抗體、生物素標(biāo)記的肌酸激酶同工酶單克隆抗體和鏈霉親和素標(biāo)記的熒光蛋白；所述檢測區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜上固定有識別心肌肌鈣蛋白I另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的第一檢測線、識別肌紅蛋白另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的第二檢測線、識別肌酸激酶同工酶另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的第三檢測線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。
[0014]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊包括層疊的第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊和第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0015]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊中插入樣品墊下方的一端設(shè)有定位條，所述樣品墊的下端面設(shè)有能容納定位條的定位槽。
[0016]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內(nèi)，所述卡殼殼面上對應(yīng)于硝酸纖維膜的位置設(shè)有觀察窗，卡殼殼面上對應(yīng)于樣品墊的位置設(shè)有加樣孔。
[0017]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述觀察窗為長方形孔。
[0018]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0019]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述樣品墊為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。
[0020]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述底板為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。
[0021]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0022]本實用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點:
[0023](I)本實用新型將熒光蛋白作為標(biāo)記物，此標(biāo)記物穩(wěn)定性良好，有利于提高檢測穩(wěn)定性。
[0024](2)本實用新型通過利用“鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)”，提高檢測靈敏度，降低非特異性結(jié)合，有利于提高試劑盒性能。
[0025](3)利用本實用新型進(jìn)行心肌肌鈣蛋白1、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶的檢測時間不大于10分鐘，心肌肌I丐蛋白I檢測線性范圍為0.10ng/ml?30.00ng/ml，肌紅蛋白檢測線性范圍為5.0ng/ml?500.0ng/ml，肌酸激酶同工酶檢測線性范圍為2.5ng/ml?200.0ng/ml，極大地提高了檢測效率。
[0026](4)本實用新型可通過熒光免疫分析儀對結(jié)果進(jìn)行判讀，可實現(xiàn)自動化，減少主觀因素的影響，提供便利、快速、可靠的診斷結(jié)果。
[0027](5)本實用新型卡殼設(shè)有樣品進(jìn)入的加樣孔和供觀測結(jié)果的觀察窗，根據(jù)分析儀器判定結(jié)果，準(zhǔn)確可靠。
[0028](6)本實用新型制作方便，體積小、便于攜帶。
[0029](7)本實用新型檢測成本較低。
[0030](8)本實用新型可批量生產(chǎn)，適用于臨床快速診斷和現(xiàn)場快速診斷；易于保存，有利于基層單位推廣。
[0031](9)本實用新型采用聯(lián)合檢測，一條檢測條同時檢測三項，相對于三條檢測條同時檢測更加方便