一種檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及一種檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙，屬于試紙檢測分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是20世紀(jì)70年代研發(fā)成功的一類仿生殺蟲劑，具有性質(zhì)穩(wěn)定、環(huán)境相容性好、殺蟲能力強(qiáng)、殘效時間長、安全系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)。且隨著高毒有機(jī)磷農(nóng)藥被禁止使用后，目前溴氰菊酯等擬除蟲菊酯類殺蟲劑便具有了更廣泛的使用空間。
[0003]擬除蟲菊酯類農(nóng)藥用量大，該化合物對光、熱穩(wěn)定，能附著作物表面不易被雨水沖刷，故殘效期長，進(jìn)入環(huán)境不易分解，容易造成環(huán)境污染，且我國的農(nóng)藥的使用情況十分復(fù)雜，長期不合理、超劑量使用化學(xué)農(nóng)藥，使得害蟲抗藥性逐年增強(qiáng)，抗藥性的增強(qiáng)又迫使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者不斷加大農(nóng)藥的用量和使用次數(shù)，農(nóng)藥的濃度越用越大，農(nóng)產(chǎn)品的殘留嚴(yán)重超標(biāo)，大大降低了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量。自20世紀(jì)90年代以來，國外大量檢測結(jié)果表明，菊酯類農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題已成為影響中國進(jìn)出口貿(mào)易的重要限制因素。農(nóng)藥的不合理使用給人類及生態(tài)環(huán)境造成了越來越嚴(yán)重的不良后果，農(nóng)藥的污染問題已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。
[0004]目前聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯殘留檢測常采用氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用法，由于這些方法需要較昂貴的儀器并且樣品前處理過程復(fù)雜，因而難以滿足實(shí)際檢測的需要。免疫分析方法具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行現(xiàn)場測定，近年已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測。美國B.D Hammock實(shí)驗(yàn)室針對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥相關(guān)主要免疫試劑盒已經(jīng)研發(fā)成功。但是聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯為小分子化合物，本身不具有免疫原性。因此，制備抗體需要通過與大分子蛋白質(zhì)交聯(lián)才能成為免疫原，過程繁瑣，且抗體的質(zhì)量受抗原影響很大。同時制備出的抗體針對結(jié)構(gòu)相似的抗原交叉反應(yīng)率高。
[0005]核酸適體是一種比抗體具有更高特異性的配基，其體外篩選、體外制備的特點(diǎn)能夠有效克服抗體制備周期長、生產(chǎn)成本高、技術(shù)難度大、批間差異大、克隆株不易有效保存的缺點(diǎn)，并且核酸適體開發(fā)周期短、生產(chǎn)成本低、使用方便在檢測分析領(lǐng)域中的應(yīng)用已經(jīng)被廣泛認(rèn)可，因此，核酸適體在聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯的快速檢測中具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了使得聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯殘留能夠被快速的定量檢測分析，本實(shí)用新型提供了一種能同時檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙。
[0007]本實(shí)用新型采用如下技術(shù)方案:一種檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙，包括底板，所述底板上依次順序粘貼有樣品吸液層、適體熒光微球結(jié)合墊、層析膜和吸水墊，所述層析膜上依次設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線包括第一檢測線和第二檢測線。
[0008]所述的第一檢測線為聯(lián)苯菊酯檢測線，第二檢測線為溴氰菊酯檢測線；第一檢測線與第二檢測線之間距離為0.45cm，第二檢測線與質(zhì)控線之間距離為0.45cm。
[0009]所述的適體熒光微球結(jié)合墊是由聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯兩者適體組裝的納米熒光微球結(jié)合墊，適體熒光微球結(jié)合墊上含有鏈接有聯(lián)苯菊酯適體的納米熒光微球和溴氰菊酯適體的納米熒光微球。
[0010]所述第一檢測線與第二檢測線上分別噴涂有聯(lián)苯菊酯適體互補(bǔ)序列和溴氰菊酯適體互補(bǔ)序列。
[0011]所述的質(zhì)控線是生物素質(zhì)控線。
[0012]所述底板為長方形的平板。
[0013]本實(shí)用新型的有益效果如下:
[0014]1、特異性強(qiáng)、靈敏度高。該聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯快速檢測試紙以高親和力的適體為基礎(chǔ)制備而成，最低檢出限可以達(dá)到0.0lmg/kgo
[0015]2、操作簡單，檢測速度快且準(zhǔn)確。使用該試紙檢測只需將試紙插入樣品液中，5分鐘左右就能顯示結(jié)果。顯示結(jié)果更加準(zhǔn)確，以熒光條帶為檢測結(jié)果。進(jìn)一步研究可發(fā)現(xiàn)配用專門的熒光檢測儀樣品中聯(lián)苯菊酯/溴氰菊酯的含量與檢測線的熒光值呈反相關(guān)，樣品中聯(lián)苯菊酯/溴氰菊酯含量越高，檢測線的熒光值越低。
[0016]3、成本低。適體的篩選過程避免了動物免疫，篩選過程簡便，后期制備只需要化學(xué)合成，不需要培養(yǎng)細(xì)胞等步驟，制作周期和成本都遠(yuǎn)低于抗體。且試紙條的成本更低于檢測試劑盒。
【附圖說明】
[0017]圖1是本實(shí)用新型的整體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018]圖2是檢測結(jié)果為陰性示意圖。
[0019]圖3是檢測結(jié)果為聯(lián)苯菊酯陽性示意圖。
[0020]圖4是檢測結(jié)果為溴氰菊酯陽性示意圖。
[0021]圖5是檢測結(jié)果為聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯全陽性示意圖。
[0022]其中:1-底板、2-吸水墊、3-層析膜、4-適體熒光微球結(jié)合墊、5-樣品吸液層、6-檢測線、61-聯(lián)苯菊酯檢測線、62-溴氰菊酯檢測線、7質(zhì)控線。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本實(shí)用新型進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0024]如圖1所示，一種檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙，其包括底板1，以及依次順序粘貼在底板1上的樣品吸液層(5 )、適體熒光微球結(jié)合墊(4 )、層析膜(3 )和吸水墊(2);所述層析膜上依次設(shè)有檢測線(6)和質(zhì)控線(7)，所述檢測線(6)包括第一檢測線(61)和第二檢測線(62)。
[0025]本實(shí)用新型中，第一檢測線(61)為聯(lián)苯菊酯檢測線，第二檢測線(62)為溴氰菊酯檢測線，第一檢測線(61)與第二檢測線(62)上分別噴涂有聯(lián)苯菊酯適體互補(bǔ)序列和溴氰菊酯適體互補(bǔ)序列；并且第一檢測線(61)與第二檢測線(62)之間距離為0.45cm，第二檢測線與所述質(zhì)控線(7)之間距離為0.45cm。適體熒光微球結(jié)合墊(4)是由聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯兩者適體組裝的納米熒光微球結(jié)合墊，適體熒光微球結(jié)合墊(4)上含有鏈接有聯(lián)苯菊酯適體的納米熒光微球和溴氰菊酯適體的納米熒光微球。質(zhì)控線(7)是生物素質(zhì)控線。
[0026]具體檢測時，把試紙的樣品吸液層端插入果汁、蔬菜浸出液中，由于毛細(xì)作用進(jìn)行側(cè)向?qū)游觯?-10min觀察結(jié)果。當(dāng)樣品中超量存在聯(lián)苯菊酯時，聯(lián)苯菊酯適體將不能與相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，則在第一檢測線61處不顯示熒光條帶；當(dāng)樣品中超量存在溴氰菊酯時，溴氰菊酯適體將不能與互補(bǔ)序列結(jié)合，則在第二檢測線處62處不顯示熒光條帶。隨著農(nóng)藥濃度的降低，熒光量逐漸升高，而不存在聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯時，三條線(檢測線和質(zhì)控線)都顯示強(qiáng)烈熒光條帶，達(dá)到檢測的目的。
[0027]要制成檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯殘留的適體熒光微球試紙首先需要篩選聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯的適體，合成檢測線上的互補(bǔ)序列，制備熒光微球用于結(jié)合適體；整個制備過程中都不需要對聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯農(nóng)藥進(jìn)行改造和修飾，相比于免疫膠體金層析技術(shù)極大地簡化了制備過程。以下是相關(guān)材料的制備方法:
[0028]1、運(yùn)用SELEX技術(shù)篩選針對聯(lián)苯菊酯適體和針對溴氰菊酯的適體。
[0029]本實(shí)用新型中用熒光素(FAM)將隨機(jī)寡聚核苷酸庫進(jìn)行標(biāo)記，每輪篩選的PCR擴(kuò)增用FAM標(biāo)記的上游引物進(jìn)行，通過比較篩選時投入樣品和洗脫樣品的熒光強(qiáng)度來判斷篩選效率。
[0030]SELEX具體過程參見專利CN203569071U。
[0031]2、適體焚光微球結(jié)合墊的制備。
[0032](1)熒光微球的制備:常規(guī)方法制備包裹熒光物質(zhì)的直徑為10 μ m的二氧化硅熒光微球；
[0033](2)用熒光微球標(biāo)記聯(lián)苯菊酯適體和溴氰菊酯適體，并將其噴涂在玻璃纖維素膜上。
[0034]3、檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯殘留的適體試紙實(shí)施檢測原理。
[0035](1)把試紙的樣品吸液層端插入果汁、蔬菜浸出液中，由于毛細(xì)作用進(jìn)行側(cè)向?qū)游觯?min觀察；
[0036](2)熒光微球在燈源激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶；連接聯(lián)苯菊酯適體和溴氰菊酯適體的焚光微球的焚光吸收波長和發(fā)射波長不同，可以區(qū)分檢測；
[0037](3)如圖2至圖5所示，檢測聯(lián)苯菊酯濃度lmg/kg以上，層析膜上出現(xiàn)一條質(zhì)控線7的焚光條帶為陽性；0.ΟΙ-lmg/kg時，焚光強(qiáng)度隨著農(nóng)藥濃度降低而升高，0.0lmg/kg以下出現(xiàn)第一檢測線61和質(zhì)控線7雙熒光條帶為陰性。檢測溴氰菊酯濃度lmg/kg以上，層析膜上出現(xiàn)一條質(zhì)控線7的焚光條帶為陽性；0.ΟΙ-lmg/kg時，焚光強(qiáng)度隨著農(nóng)藥濃度降低而升高，0.0lmg/kg以下出現(xiàn)第二檢測線62和質(zhì)控線7雙焚光條帶為陰性。當(dāng)兩種農(nóng)藥濃度都低于0.0lmg/kg時出現(xiàn)三條強(qiáng)焚光帶。
[0038]對于所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，隨著技術(shù)的發(fā)展，本實(shí)用新型構(gòu)思可以不同方式實(shí)現(xiàn)。本實(shí)用新型的實(shí)施方式并不僅限于以上描述的實(shí)施例，而且可在權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行變化。
[0039]本實(shí)用新型未涉及部分均與現(xiàn)有技術(shù)相同或可采用現(xiàn)有技術(shù)加以實(shí)現(xiàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙，其特征在于:包括底板(1)，所述底板(1)上依次順序粘貼有樣品吸液層(5 )、適體熒光微球結(jié)合墊(4 )、層析膜(3 )和吸水墊(2)，所述層析膜上依次設(shè)有檢測線(6)和質(zhì)控線(7)，所述檢測線(6)包括第一檢測線(61)和第二檢測線(62)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙，其特征在于:所述的第一檢測線(61)為聯(lián)苯菊酯檢測線，第二檢測線(62)為溴氰菊酯檢測線；第一檢測線(61)與第二檢測線(62)之間距離為0.45cm，第二檢測線與所述質(zhì)控線(7)之間距離為0.45cm03.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙，其特征在于:所述的適體熒光微球結(jié)合墊(4)是由聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯兩者適體組裝的納米熒光微球結(jié)合墊，適體熒光微球結(jié)合墊(4)上含有鏈接有聯(lián)苯菊酯適體的納米熒光微球和溴氰菊酯適體的納米熒光微球。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙，其特征在于:所述第一檢測線(61)與第二檢測線(62)上分別噴涂有聯(lián)苯菊酯適體互補(bǔ)序列和溴氰菊酯適體互補(bǔ)序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙，其特征在于:所述的質(zhì)控線(7)是生物素質(zhì)控線。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙，其特征在于:所述底板(1)為長方形的平板。
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種檢測聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯多殘留的適體試紙，包括底板，所述底板上依次順序粘貼有樣品吸液層、適體熒光微球結(jié)合墊、層析膜和吸水墊，所述層析膜上依次設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，檢測線包括第一檢測線和第二檢測線，第一檢測線為聯(lián)苯菊酯檢測線，第二檢測線為溴氰菊酯檢測線，第一檢測線與第二檢測線上分別噴涂有聯(lián)苯菊酯適體互補(bǔ)序列和溴氰菊酯適體互補(bǔ)序列；所述的適體熒光微球結(jié)合墊是由聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯兩者適體組裝的納米熒光微球結(jié)合墊，適體熒光微球結(jié)合墊上含有鏈接有聯(lián)苯菊酯適體的納米熒光微球和溴氰菊酯適體的納米熒光微球。本實(shí)用新型靈敏度高、操作簡便快速、顯示結(jié)果形象準(zhǔn)確、成本低、易于推廣應(yīng)用。
【IPC分類】G01N33/558
【公開號】CN205003161
【申請?zhí)枴緾N201520640887
【發(fā)明人】王耘
【申請人】金陵科技學(xué)院
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年8月24日