辨率。
[0040]基于上述原由，本實(shí)用新型實(shí)施例提供了如圖1所示的一種隨機(jī)掃描的系統(tǒng)，包括色散預(yù)補(bǔ)償單元1、隨機(jī)掃描單元2和成像單元3 ；
[0041 ]色散預(yù)補(bǔ)償單元I用于對(duì)入射光進(jìn)行色散預(yù)補(bǔ)償和光路調(diào)整后，垂直入射至隨機(jī)掃描單元2用以實(shí)現(xiàn)任意區(qū)域的掃描；
[0042]隨機(jī)掃描單元2，還用于收集進(jìn)行任意區(qū)域掃描后產(chǎn)生的熒光信號(hào)，并對(duì)所述熒光信號(hào)進(jìn)行處理后入射至成像單元3進(jìn)行成像。
[0043]下面結(jié)合圖2對(duì)本實(shí)用新型實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的解釋:
[0044]色散預(yù)補(bǔ)償單元I包括第一菱鏡Prism1、第二菱鏡Prism 2、第一反光鏡組、第二反光鏡組，所述第一反光鏡組包括反光鏡M2、反光鏡Ml，所述第二反光鏡組包括反光鏡M5、反光鏡M4。
[0045]隨機(jī)掃描單元2包括:
[0046]第一二維聲光偏轉(zhuǎn)器2D-A0D 1、與所述第一二維聲光偏轉(zhuǎn)器2D-A0D I相連接的第一數(shù)據(jù)采集卡DAQl;
[0047]第二二維聲光偏轉(zhuǎn)器2A-A0D 2、與所述第二二維聲光偏轉(zhuǎn)器2D-A0D 2相連接的第二數(shù)據(jù)采集卡DAQ2;
[0048]反光鏡M3、第一雙色鏡DMl、第二雙色鏡DM2和物鏡；
[0049 ]成像單元3包括:分束鏡BS、光電倍增管PMT、圖像傳感器CXD和成像模塊;成像模塊在本實(shí)施例中為一計(jì)算機(jī)。
[0050]下面對(duì)各部件進(jìn)行性詳細(xì)的闡述:
[0051 ] STED超分辨顯微成像中基于AOD的隨機(jī)掃描系統(tǒng)，包括:
[0052]第一菱鏡(PrismI )，主要是對(duì)STED損耗光的色散進(jìn)行預(yù)補(bǔ)償，目的是抵消后面AOD產(chǎn)生的色散，注意這里的菱鏡要在水平方向傾斜約45°放置；
[0053]第二菱鏡(Prism2)，主要是對(duì)激發(fā)光的色散進(jìn)行預(yù)補(bǔ)償，目的是抵消后面AOD產(chǎn)生的色散，注意這里的菱鏡要在水平方向傾斜約45°放置；
[0054]第一二維聲光偏轉(zhuǎn)器(2D-A0D I )，用于實(shí)現(xiàn)對(duì)紅色的STED損耗光隨機(jī)任意選區(qū)掃描；
[0055]第二二維聲光偏轉(zhuǎn)器(2D-A0D2)，用于實(shí)現(xiàn)對(duì)綠色的激發(fā)光隨機(jī)任意選區(qū)掃描；
[0056]第一反光鏡Ml和第二反光鏡M2，主要用于調(diào)整經(jīng)過菱鏡后的STED損耗光，確保其垂直進(jìn)入2D-A0D I；
[0057]反光鏡M3，用于對(duì)經(jīng)過2D-A0DI的(I，I)衍射光進(jìn)行反射改向，并在實(shí)驗(yàn)過程中有微調(diào)的作用；
[0058]第四反光鏡M4和第五反光鏡M5，主要用于調(diào)整經(jīng)過菱鏡后的激發(fā)光，確保其垂直進(jìn)入2D-A0D 2；
[0059]第一雙色鏡(DMl)，用于透射780nm的STED損耗光，反射約680nm的熒光；
[0060]第二雙色鏡(DM2)，用于反射633nm的激發(fā)光，透射約680nm的熒光。
[0061 ]分束鏡(BS)，用于將物鏡收集的信號(hào)分成兩部分(10%:90%)，10%的熒光信號(hào)進(jìn)入CCD用于調(diào)整光路，90%的熒光信號(hào)進(jìn)入PMT用于超分辨成像。
[0062]數(shù)據(jù)采集卡(DAQ1和DAQ2)，用于產(chǎn)生控制信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)兩對(duì)聲光偏轉(zhuǎn)器的實(shí)時(shí)控制，同時(shí)為了保持同步性，兩DAQ之間共用一個(gè)時(shí)鐘信號(hào)，這樣就可以用兩個(gè)DAQ實(shí)現(xiàn)兩套AOD同步產(chǎn)生不同的掃描頻率。
[0063]物鏡，用于聚焦激發(fā)光和STED損耗光，激發(fā)產(chǎn)生超越衍射極限的熒光，同時(shí)收集樣品產(chǎn)生的熒光信號(hào)；
[0064]光電倍增管(PMT)，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行放大，并將放大后的信號(hào)傳輸給計(jì)算機(jī)進(jìn)行成像。
[0065]圖像傳感器CCD，用于調(diào)整光路時(shí)收集熒光信號(hào)，并將信號(hào)傳輸給計(jì)算機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)顯不O
[0066]計(jì)算機(jī)(Computer)，用于控制數(shù)據(jù)采集卡和光電倍增管，同時(shí)對(duì)光電倍增管的信號(hào)進(jìn)行處理，最終形成一張完整的超分辨圖像。
[0067]本實(shí)用新型詳細(xì)過程如下:首先假定激發(fā)光和STED損耗光到達(dá)隨機(jī)掃描系統(tǒng)時(shí)都已經(jīng)調(diào)整好并滿足STED成像要求，已經(jīng)調(diào)整好的激發(fā)光首先通過菱鏡2進(jìn)行色散預(yù)補(bǔ)償，然后通過反射鏡(M4和M5)進(jìn)行光束的高度調(diào)整，接著進(jìn)入二維聲光偏轉(zhuǎn)器，此時(shí)在聲光偏轉(zhuǎn)器中產(chǎn)生的色散恰好與菱鏡補(bǔ)償?shù)纳⑾嗷サ窒?，?jīng)過聲光偏轉(zhuǎn)器出射的激發(fā)光應(yīng)為一個(gè)圓形光斑，然后經(jīng)過雙色鏡DM2反射，再通過物鏡聚焦。同樣已經(jīng)調(diào)整好的STED損耗光，經(jīng)過菱鏡預(yù)補(bǔ)償后，再通過反射鏡(Ml和M2)調(diào)整損耗光的高度，讓其水平入射二維聲光調(diào)制器，經(jīng)過聲光調(diào)制器后，通過菱鏡預(yù)補(bǔ)償?shù)纳?yīng)與聲光調(diào)制器產(chǎn)生的色散相互抵消，最后從聲光偏轉(zhuǎn)器出射的光，經(jīng)過物鏡聚焦后應(yīng)為一個(gè)圓環(huán)光斑。由于控制兩組AOD信號(hào)的數(shù)據(jù)采集卡DAQl和DAQ2共用一個(gè)時(shí)鐘。因此，激發(fā)光和STED損耗光是同步執(zhí)行掃描的。但是在脈沖時(shí)間間隔上激發(fā)光要比STED損耗光快約ISOps到達(dá)樣品，才能得到比較好的超分辨圖像。
[0068]實(shí)施過程中，需要先對(duì)AOD的掃描系統(tǒng)進(jìn)行微調(diào)，因?yàn)橛捎诓ㄩL(zhǎng)的不同AOD的衍射角度會(huì)有微小的變化，因此系統(tǒng)調(diào)好后在激發(fā)光和STED損耗光的光源出口處放置光譜儀，隨時(shí)監(jiān)控波長(zhǎng)的變化，將波長(zhǎng)對(duì)掃描系統(tǒng)的影響減到最小。在對(duì)系統(tǒng)的微調(diào)時(shí)，首先用為本實(shí)用新型設(shè)計(jì)的軟件Scan imaging控制數(shù)據(jù)采集卡(DAQ)讓兩束的光經(jīng)過AOD時(shí)AOD都固定在中心頻率(A0D的頻率范圍為6000Hz-9000Hz，中心頻率為7500Hz)。因此，此時(shí)的AOD就相當(dāng)于固定的光柵，兩束光分別經(jīng)過各自的AOD后在AOD出光口處會(huì)出現(xiàn)衍射光斑，在本實(shí)用新型中選取(_1，-1)點(diǎn)，然后在熒光光路上用CCD采集光斑進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，此時(shí)通過微調(diào)反光鏡和雙色鏡來確保兩束光的(-1，-1)點(diǎn)完全重合。然后再尋找每個(gè)像素坐標(biāo)與AOD掃描頻率的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，首先尋找激發(fā)光的像素點(diǎn)坐標(biāo)與AOD掃描頻率之間的關(guān)系，確定關(guān)系后再固定激發(fā)光光斑對(duì)應(yīng)像素點(diǎn)的坐標(biāo)位置，來反向?qū)ふ以谙嗤鴺?biāo)的位置上與之對(duì)應(yīng)的控制損耗光AOD頻率之間的關(guān)系，以確保在每個(gè)像素點(diǎn)上兩束光都能完全重合。
[0069]具體的，本實(shí)用新型實(shí)施例默認(rèn)進(jìn)入菱鏡的激發(fā)光和STED損耗光均已經(jīng)調(diào)整好，而本實(shí)用新型要做的工作是隨時(shí)保證激發(fā)光和STED損耗光的高度重疊，按照?qǐng)D2的方式搭建光路。首先搭建的是激發(fā)光光路，激發(fā)光保持水平，調(diào)整菱鏡的位置，保證激發(fā)光以約45°的方式入射，同時(shí)菱鏡自身要與水平面成約45°角放置，激發(fā)光經(jīng)過菱鏡色散預(yù)補(bǔ)償后，通過雙反射鏡組合，用以調(diào)整激發(fā)光的高度和方向。調(diào)整AOD的位置保持AOD到菱鏡的位置約35厘米左右，然后經(jīng)過AOD衍射(此時(shí)AOD工作的頻率為中間頻率)，將衍射點(diǎn)投射在紙屏上，在紙屏上可以看到四個(gè)衍射點(diǎn)(如圖3所示)，其中(-1，-1)級(jí)衍射點(diǎn)即為需要的光斑，觀察衍射斑點(diǎn)的形狀，如果為橢圓，可以通過微調(diào)菱鏡、AOD放置的傾斜角度或AOD到菱鏡的距離，來改變光斑的形狀，直到光斑為圓形為止，如圖3所示，為調(diào)制好后的衍射圖。同樣STED損耗光也進(jìn)行相同的操作。當(dāng)兩束光都調(diào)整好后，用反光性較好的物體作為樣品(本實(shí)施例中采用載玻片)進(jìn)行反射成像，首先開啟激發(fā)光，在CCD上可以看到一個(gè)圓形光斑，通過調(diào)節(jié)C⑶讓光斑位于CCD的正中心，然后關(guān)掉激發(fā)光開啟STED損耗光，在CXD上可以看到一個(gè)圓環(huán)形光斑，通過調(diào)節(jié)反光鏡M3使環(huán)形光斑位于CCD正中心，最后再開啟激發(fā)光，觀察兩束光的重合程度，通過微調(diào)反光鏡M3和雙色鏡DM2，確保兩束光完全重合，如圖4所示。
[0070]由于本實(shí)用新型是使用AOD執(zhí)行掃描，而每組AOD是有兩個(gè)單獨(dú)的