基于生物標(biāo)志物的腎損傷早期檢測(cè)試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型設(shè)及生命健康技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于生物標(biāo)志物的腎損傷早期 檢測(cè)試紙條。
【背景技術(shù)】
[000^ 微量白蛋白（又名微量尿白蛋白，Micora化uminuria, mA化)是指尿中出現(xiàn)的微量 白蛋白。微量白蛋白的非正常出現(xiàn)，通常被認(rèn)為是腎功能衰竭、糖尿病和屯、血管疾病并發(fā)癥 等重要臨床標(biāo)志之一。因此，尿液中白蛋白存在水平的檢測(cè)對(duì)腎病、糖尿病和屯、血管病的早 期診斷、早期治療和減小風(fēng)險(xiǎn)由重要的參考價(jià)值和臨床意義。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì) 運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associatedlipocalin, NGAL)是 1993 年在中性粒細(xì) 胞內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)的，與炎癥、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、趨化作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)W及多種腫瘤的發(fā)生 于發(fā)展等過(guò)程相關(guān)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，NGAL蛋白在多種疾病發(fā)生過(guò)程中具有特異性 表達(dá)變化的特點(diǎn)，使得NGAL成為檢測(cè)疾病的生物標(biāo)志物。近年美國(guó)臨床化學(xué)協(xié)會(huì)(AACC)年 度會(huì)議的研究結(jié)果發(fā)表得知檢測(cè)尿中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白可能有助于臨床醫(yī) 生檢測(cè)屯、臟移植患者環(huán)抱霉素誘導(dǎo)的毒性，W及調(diào)節(jié)環(huán)抱霉素劑量W預(yù)防其對(duì)腎臟造成的 不可逆?zhèn)?。中?guó)專利CN101163971研究在急性腎衰竭(ARF)、急性腎小管壞死(ATN)和急 性腎小管間質(zhì)性腎病(ATIN)發(fā)病的早期，尿液和血液中NGAL水平顯著增加，因此NGAL是 早期檢測(cè)腎臟對(duì)缺血性損傷的標(biāo)志物。mA化和NGAL是新近發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)性能良好的腎功能 良好的生物標(biāo)志物，特別是在急性或腎功能損傷早期就有明顯的變化，因而受到臨床檢測(cè) 人員的歡迎，如果將兩種標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，則能更準(zhǔn)確全面地反映腎功能性能。目前市場(chǎng)上 腎損傷的早期診斷僅僅單獨(dú)依靠單一的腎功能標(biāo)志物的檢測(cè)，常常因?yàn)閱我坏臋z驗(yàn)周期 長(zhǎng)，靈敏度低，從而無(wú)法確保腎損傷的診斷率W及甚至?xí)绊懩I損傷患者后續(xù)的治療和生 命健康。 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0003] 實(shí)用新型的主要目的在于提供一種基于生物標(biāo)志物的腎損傷早期檢測(cè)試紙條，同 時(shí)檢測(cè)mA化和NGAL，對(duì)于腎損傷發(fā)生的診斷起到協(xié)同互補(bǔ)作用，可W根據(jù)實(shí)際檢測(cè)結(jié)果，為 腎損傷早期提供輔助診斷，縮短檢測(cè)周期，增加了檢測(cè)的靈敏度，方便了用戶使用。
[0004] 本方案中的一種基于生物標(biāo)志物的腎損傷早期檢測(cè)試紙條，所述試紙條包括底襯 W及設(shè)置于所述底襯上的包被膜，所述包被膜上依次設(shè)置有樣品墊、包被線區(qū)和吸水紙;所 述包被線區(qū)依次設(shè)置有標(biāo)記線、質(zhì)控線、mA化檢測(cè)線和NGAL檢測(cè)線;所述標(biāo)記線包括被巧光 膠乳標(biāo)記的第二mA化單克隆抗體、第二NGAL單克隆抗體和兔IgG抗體;所述質(zhì)控線包括羊抗 兔IgG抗體;所述mA化檢測(cè)線包括能與待檢測(cè)抗原mA化特異性結(jié)合的第一 mA化單克隆抗體； 所述NGAL檢測(cè)線包括能與待檢測(cè)抗原NGAL特異性結(jié)合的第一 NGAL單克隆抗體。
[0005] 進(jìn)一步，所述待檢測(cè)抗原mA化為人源mAlb，所述待檢測(cè)抗原NGAL為人源NGAL。
[0006] 進(jìn)一步，所述標(biāo)記線、質(zhì)控線、mA化檢測(cè)線和NGAL檢測(cè)線之間的間隔距離分別設(shè)置 為3mm ~5mm ο
[0007] 本實(shí)用新型的有益效果是:通過(guò)mA化與NGAL兩項(xiàng)聯(lián)檢，對(duì)于腎損傷發(fā)生的診斷起 到協(xié)同互補(bǔ)作用，可W根據(jù)實(shí)際檢測(cè)結(jié)果，為腎損傷早期提供輔助判斷，縮短檢測(cè)周期，增 加了檢測(cè)的靈敏度，方便了用戶使用。
【附圖說(shuō)明】
[0008] 圖1為本實(shí)用新型基于生物標(biāo)志物的腎損傷早期檢測(cè)試紙條較佳實(shí)施例的內(nèi)部 結(jié)構(gòu)示意圖；
[0009] 圖2為采用本實(shí)用新型基于生物標(biāo)志物的腎損傷早期檢測(cè)試紙條與羅氏E170化 學(xué)發(fā)光儀針對(duì)相同臨床樣本測(cè)量出的mA化的相關(guān)性圖；
[0010] 圖3為采用本實(shí)用新型基于生物標(biāo)志物的腎損傷早期檢測(cè)試紙條與羅氏E170化 學(xué)發(fā)光儀針對(duì)相同臨床樣本測(cè)量出的NGAL的相關(guān)性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本實(shí)用新型，并不用于限定本 實(shí)用新型。
[0012] 本實(shí)用新型的主要目的在于提供一種基于生物標(biāo)志物的腎損傷早期檢測(cè)試紙條， 同時(shí)檢測(cè)mMb和NGAL，對(duì)于腎損傷發(fā)生的判斷起到協(xié)同互補(bǔ)作用，可W根據(jù)實(shí)際檢測(cè)結(jié)果， 為腎損傷早期提供輔助判斷，縮短檢測(cè)周期，增加了檢測(cè)的靈敏度，方便了用戶使用。
[0013] 參照?qǐng)D1，所述基于生物標(biāo)志物的腎損傷早期檢測(cè)試紙條包括底襯及設(shè)置于所 述底襯1上的包被膜3,所述包被膜3上依次設(shè)置有樣品墊2、包被線區(qū)和吸水紙4,其中：所述 包被線區(qū)依次設(shè)置有標(biāo)記線5、質(zhì)控線6、mA化檢測(cè)線7和NGAL檢測(cè)線8;所述標(biāo)記線5包括被 巧光膠乳標(biāo)記的第二mA化單克隆抗體、第二NGAL單克隆抗體和兔IgG抗體;所述質(zhì)控線6包 括羊抗兔IgG抗體;所述mMb檢測(cè)線7包括能與待檢測(cè)抗原mA化特異性結(jié)合的第一 mA化單克 隆抗體;所述NGAL檢測(cè)線8包括能與待檢測(cè)抗原NGAL特異性結(jié)合的第一 NGAL單克隆抗體。所 述待檢測(cè)抗原mA化為人源mAlb，所述待檢測(cè)抗原NGAL為人源NGAL。所述標(biāo)記線、質(zhì)控線、 mA化檢測(cè)線和NGAL檢測(cè)線之間的間隔距離分別設(shè)置為3mm~5mm。
[0014] 本實(shí)用新型針對(duì)上述基于生物標(biāo)志物的腎損傷早期檢測(cè)試紙條采用如下制備方 法。
[0015] 所述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測(cè)試紙條的制備方法包含W下步驟：
[0016] 1. mA化和NGAL單克隆抗體巧光膠乳微球的制備
[0017] 將常規(guī)方法共價(jià)活化后的巧光膠乳超聲波200W-400W處理20-30秒后，按照50- 2(K)yg標(biāo)記抗體ΛΟΟμΙ巧光膠乳的比例加入第二mMb單克隆抗體(購(gòu)自武漢華美生物工程 有限公司）、第二NGAL單克隆抗體(購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司）和兔IgG抗體(購(gòu)自武 漢華美生物工程有限公司），混勻后室溫?cái)埌璺磻?yīng)2 h，離屯、洗涂3次，每次10000- 15000xg、離屯、10 min,沉淀用PBS-TBN溶解并超聲波100W處理30 S，用PBS-TBN恢復(fù) 離屯、前體積，4°C保存，備用。
[001引 2.樣品墊的封閉
[0019]2.1封閉液的制備：將含1%854,0.2%吐溫-20,2.5%薦糖，0.05%疊氮化鋼，0.0謹(jǐn)、 pH7.4的PBS,用0.22μ膜過(guò)濾，置于4°C備用，有效期3天。
[0020] 2.2樣品墊的封閉：按65 ul/cm2的量將封閉液均勻的加到樣品墊上，使得樣品墊 完全濕透。
[0021] 2.3樣品墊的干燥:將封閉好的樣品墊轉(zhuǎn)入鼓風(fēng)干燥箱干燥，干燥溫度控制在37± rC干燥時(shí)間為12-24小時(shí)。
[0022] 3.NC膜的包被
[0023] 3.1標(biāo)記線的制備:用包被緩沖液稀釋標(biāo)記有mA化單克隆抗體的巧光膠乳、標(biāo)記有 NGAL單克隆抗體的巧光膠乳和標(biāo)記有兔抗IgG抗體的巧光膠乳，將運(yùn)Ξ種標(biāo)記抗體的膠 乳混合，劃線于包被膜上形成標(biāo)記線;其中巧光膠乳標(biāo)記的mA化單克隆抗體和巧光膠乳標(biāo) 記的NGAL單克隆抗體的濃度均為0.5-1.0mg/ml，用量均為0.02-0.1μg/cm2;巧光膠乳 標(biāo)記的兔抗IgG抗體的濃度為1. Omg/ml，用量為0.001- 0.025yg/cm2 ;所述包被緩沖液中 含有 1%BSA，0. 吐溫-20，2.5% 薦糖，0.05%疊氮化鋼，0.01M、pH7.4 的PBS);
[0024] 3.2質(zhì)控線和檢測(cè)線的制備：用0.01M、抑7.4的PBS緩沖液稀釋羊抗兔IgG抗體、 能與待檢抗原mAlb特異結(jié)合的不同于步驟3.1的mAlb單克隆抗體的另一株mA化單克隆 抗體、W及能與待檢抗原NGAL特異結(jié)合的不同于步驟3.1的NGAL單克隆抗體的另一株 NGAL單克隆抗體，并將稀釋后的Ξ種抗體分別依次平行地劃線于包被膜上形成質(zhì)控線、 mA化檢測(cè)線