專利名稱：一種中藥定量指紋圖譜的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
G06K數(shù)據(jù)識別；數(shù)據(jù)表示；記錄載體；記錄載體的處理背景技術(shù) 中藥成分復(fù)雜，許多成分不夠明確，而不同中藥又有含有相同成分的現(xiàn)象。因此，運用現(xiàn)代分析技術(shù)對中藥化學(xué)信息以圖形(圖象)的方式進行表征并加以描述，即運用中藥指紋圖譜技術(shù)對中藥進行質(zhì)量控制是目前較公認的方法。高效液相儀色譜儀以其分離度好、靈敏度高、重現(xiàn)性強的特點成為研究中藥指紋圖譜的最主要的手段。美國Food and Drag Administration(FDA)允許草藥保健品申報資料可以提供色譜指紋圖，World Health Organization(WHO)在1996年草藥評價指導(dǎo)原則中規(guī)定，在植物藥的制劑及成品的章節(jié)中均提到，如果草藥的活性成分不明，可以提供色譜圖譜以證明產(chǎn)品的質(zhì)量一致。2000年8月15日，我國藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《中藥注射劑指紋圖譜研究技術(shù)要求》(暫行)。
目前，高效液相儀在中藥質(zhì)量控制方面的應(yīng)用，僅限于有效成分的含量測定和指紋圖譜的定性鑒別，尚未有一套完備的方法能在樣品選擇、提取檢測方法恰當(dāng)而做出峰形較好、分離度較高的高效液相儀圖譜后，對能代表總體的多個樣品圖譜數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計總體的共有指紋特征，對每個共有指紋特征峰參數(shù)如保留時間、峰面積、峰高、峰寬(實際導(dǎo)出的為半峰寬)、起始時間、終止時間、分離度、相對保留時間等進行統(tǒng)計，計算其均值、標(biāo)準(zhǔn)差、相對標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計出總體的數(shù)字共同指紋特征，作為可定性定量的指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，以之為參照，以相對保留時間作為定性指標(biāo)，以峰面積或峰高作為定量指標(biāo)進行其他樣品的識別和質(zhì)量評定。同時能依據(jù)高效液相儀導(dǎo)出的數(shù)據(jù)模擬樣品圖譜，包括偏態(tài)峰形和分離度過小的峰形，對成分明確的物質(zhì)進行含量測定的數(shù)據(jù)處理。

發(fā)明內(nèi)容
1建立中藥定量指紋圖譜的方法步驟包括(1)數(shù)據(jù)導(dǎo)出，(2)數(shù)據(jù)的導(dǎo)入，(3)數(shù)據(jù)類型的改變，(4)參照峰的選取、識別與其保留時間的讀出，(5)分離度和相對保留時間的添加，(6)樣本表指紋特征峰的讀出，(7)單個物質(zhì)峰表的匯成，(8)共有指紋特征峰標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫表的匯成，(9)指紋圖譜曲線圖的模擬，(10)指紋圖譜中明確成分的含量測定，(11)識別和評價其他被檢測樣品。
2消除相對保留時間波動的參照峰處理方法選取兩個標(biāo)志性強的峰，作為參照峰，保留時間為s1、s2(s1＜s2)，其它峰的保留時間為tn，相對保留時間為rt，由于高效液相儀存在死體積，則存在死時間α，即tn＝tn+αs1＝s1+αs2＝s2+α故rt=(tn+α)-(s1+α)(s1+α)-(s2+α)]]>=tn-s1s2-s1]]>可以消除不同儀器的死體積不同而引起的誤差。
3利用高效液相儀導(dǎo)出的數(shù)據(jù)模擬分離度小的峰和偏態(tài)峰的方法高效液相儀物質(zhì)峰曲線可抽象為正態(tài)分布曲線其公式如下y＝f(t)f(t)=h·e-(t-tr)22·u2]]>
h=au·2×3.1415925]]>其中y為曲線縱坐標(biāo)值，代表吸光度，h為峰高，a為峰面積，u為曲線標(biāo)準(zhǔn)差，t為橫坐標(biāo)值，代表時間，tr為保留時間，3.1415925為圓周率。
半峰寬w＝2.355·u峰寬w＝4·uw＝1.699·w當(dāng)t＝tr時，e的指數(shù)為零，此時y最大，用ymax表示ymax=h=au·2×3.1415925]]>a＝1.065·h·w定理1對等高的兩正態(tài)分布曲線，如果兩曲線的標(biāo)準(zhǔn)差u和起始積分時間與終止積分時間差1(或半峰寬或峰寬)之比相等，那么積分面積b與全積分面積a之比相等。
如果u1l1=u2l2]]>那么b1a1=b2a2]]>推論1對等高的兩正態(tài)分布曲線，如果積分面積b與全積分面積a之比相等，那么兩曲線標(biāo)準(zhǔn)差(或半峰寬或峰寬)的比值、兩曲線的起始積分時間與終止積分時間差的比值、兩曲線積分面積的比值及兩曲線全積分面積的比值相等。
當(dāng)h1＝h2如果u1l1=u2l2,b1a1=b2a2]]>又因為a＝1.065·h·w即a1a2=w11/2w21/2=u1u2]]>那么u1u2=l1l2=b1b2=a1a2]]>(1)對偏態(tài)峰的模擬可將偏態(tài)峰分割為兩個等高的，不等標(biāo)準(zhǔn)差的正態(tài)分布曲線，模擬曲線時分別取兩曲線的前半部分和后半部分即可。
高效液相儀導(dǎo)出數(shù)據(jù)包含每個峰的保留時間tr、峰高h、峰面積a、半峰寬w1/2、起始時間s、終止時間e等。
由推論1知tr-se-tr=w11/2w21/2]]>因w1+w2＝w
u=w1/22.335]]>則u1=tr-se-su]]>u2=e-tre-su]]>則y1=h·e(t-tr)22u12(s<t<tr)]]>y2=h·e(t-tr)22u22(tr<t<e)]]>以上模擬曲線圖形的峰高、峰寬與原圖等同，而峰面積近似。
由推論1知tr-se-tr=a1a2]]>因a1+a2＝au=ah·2×3.1415925]]>則u1=tr-se-su]]>u2=e-tre-su]]>則y1=h·e(t-tr)22u12(s<t<tr)]]>y2=h·e(t-tr)22u22(tr<t<e)]]>以上模擬曲線圖形的峰高、峰面積與原圖等同，而峰寬近似。
(2)對分離度小的兩峰曲線模擬如果兩物質(zhì)峰不能分開，則相互掩避，且吸光度相加而反映在光譜曲線上。因此，高效液相儀沒有給定準(zhǔn)確的前峰終止時間和后峰起始時間，當(dāng)另行處理，以給定峰面積代替真實峰面積，模擬為正態(tài)峰。
w1/2=a1.065h]]>u=w1/22.335]]>則y=h·e-(t-tr)22u2(s<t<e)]]>由于不能模擬重疊部分的吸光度的相加，該模擬曲線重疊區(qū)的吸光度均低于原圖。
具體實施例方式
(1)數(shù)據(jù)導(dǎo)出Agilent高效液相儀工作站，在offline窗口打開數(shù)據(jù)包，經(jīng)點擊Integration圖標(biāo)，點擊Integration Events設(shè)定積分基線(slope sensitivity)和峰高Height Reject、峰面積Area Reject、峰寬Peak Width的選擇后再擊File，左點Export選擇CSV File，出現(xiàn)一個窗口，在該窗口下記下導(dǎo)出數(shù)據(jù)儲存位置，點擊OK，再次出現(xiàn)窗口，再次點擊OK。從My cumputer(我的電腦)中找到導(dǎo)出數(shù)據(jù)包，用copy(復(fù)制)到一個新建文件夾，重命名，重復(fù)以上步驟，導(dǎo)出其它樣本數(shù)據(jù)。
(2)數(shù)據(jù)的導(dǎo)入先建成立同名表，字段為峰號、保留時間、類型、峰面積、峰高、峰寬、起始時間、終止時間。由導(dǎo)出的CVS類型的同名文件導(dǎo)入該表(3)數(shù)據(jù)類型的改變，即將表文件記錄除類型之外由字符型改變?yōu)閿?shù)字型(4)參照峰的選擇、識別與其保留時間的讀出選擇兩個標(biāo)志性強的峰為參照峰，用峰高(或峰面積)或保留時間，或兩者結(jié)合作為識別特征。
(5)分離度和相對保留時間的添加分離度r=2(tn-tn-1)wn-wn-1,]]>tn、tn-1為兩峰的保留時間，wn、wn-1為兩峰的峰寬。
相對保留時間rt=tn-sls2-s1(-∞<rt<+∞)]]>s1、s2(s1＜s2)為參照峰的保留時間，tn為其它峰的保留時間，rt為相對保留時間，以上(2)、(3)、(4)、(5)可用一個主程序，四個子程序用循環(huán)結(jié)構(gòu)一次完成，也可分次完成，使每一個樣本數(shù)據(jù)形成一個樣本表，打印，人工校正，如果不正確，應(yīng)修改人工設(shè)定的識別窗口，正確后進行下一步。
(6)樣本表指紋特征峰的讀出根據(jù)樣本表指紋特征峰的識別特征，人工設(shè)定識別窗口(物質(zhì)峰的相對保留時間的波動范圍)，在每個樣本表抽取指紋特征峰的信息(峰號、保留時間、峰面積、峰高、峰寬、起始時間、終止時間、分離度、相對保留時間)，匯成一個指紋特征峰表，打印，人工校正，如果不正確，應(yīng)修改人工設(shè)定的識別窗口，正確后進行下一步。
(7)單個物質(zhì)峰表的匯成將每樣本指紋特征峰表的信息讀出，貯存在數(shù)組中，將每個樣本指紋特征峰表中每個物質(zhì)的數(shù)據(jù)匯成單個物質(zhì)峰表，并在表尾添加峰號、保留時間、峰面積、峰高、峰寬(實際導(dǎo)出的為半峰寬)、起始時間、終止時間、分離度、相對保留時間的均值、標(biāo)準(zhǔn)差、相對標(biāo)準(zhǔn)差。打印，人工校正，如果不正確，應(yīng)修改人工設(shè)定識別窗口，正確后進行下一步。
(8)指紋特征峰標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫表的匯成將每張單個物質(zhì)峰表尾的峰號、保留時間、峰面積、峰高、峰寬、起始時間、終止時間、分離度、相對保留時間的均值、標(biāo)準(zhǔn)差、相對標(biāo)準(zhǔn)差，讀出匯成一個指紋特征峰標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫表。
以上(6)、(7)、(8)均可用循環(huán)結(jié)構(gòu)編程。
(9)指紋圖譜曲線圖的模擬在表單上建立坐標(biāo)，打開要模擬的表文件，循環(huán)讀取每個物質(zhì)峰的保留時間tr、峰高h、峰面積a、半峰寬w1/2、起始時間s、終止時間e，分離度r，以分離度r，判斷兩峰是否分開(r＞1.5為分開，否則為分不開)，如果分開，則對函數(shù)y1=h·e(t-tr)22u12(s<t<tr),y2=h·e(t-tr)22u22(tr<t<e)]]>描點繪圖，完成對偏態(tài)峰的模擬；如果分不開，則以給定峰面積代替真實峰面積，對函數(shù)y=h·e-(t-tr)22u2(s<t<e)]]>描點繪圖，完成對分離度小的兩峰曲線的模擬。
(10)指紋圖譜中明確成分的含量測定建立“樣品中明確成分的含量表”表中的字段分別為表名c(2)，樣品號n(2)，產(chǎn)地c(10)，加工方法c(8)，明確成分峰面積n(10，5)，明確成分含量n(6，4)，相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)含量分數(shù)n(6，4)。
其中表名為高效液相儀數(shù)據(jù)導(dǎo)出后的文件名，亦為程序?qū)牒蠼ǔ闪⒌耐砻?，需要人工輸入?br> 樣品號、產(chǎn)地、加工方法為樣本(樣品)的采集信息，需要人工輸入。
明確成分含量根據(jù)明確成分標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和明確成分峰面積由計算機計算并追加。
相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)含量分數(shù)是由(6)、(7)、(8)程序處理后的標(biāo)準(zhǔn)表中讀出明確成分標(biāo)準(zhǔn)峰面積，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出明確成分標(biāo)準(zhǔn)含量，相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)含量分數(shù)為樣品明確成分含量與明確成分標(biāo)準(zhǔn)含量的比值。
(11)識別和評價其他被檢測樣品被檢測樣品經(jīng)高效液相儀處理和數(shù)據(jù)導(dǎo)出，經(jīng)(2)、(3)、(4)、(5)程序處理成樣本表，讀取該樣本表數(shù)據(jù)，并模擬出該樣品的高效液相儀圖譜。根據(jù)(6)中人工設(shè)定的識別窗口，從該樣本表中識別出指紋特征峰個數(shù)，并將它們分別匯成一個指紋特征峰表。添加標(biāo)準(zhǔn)表的峰面積，計算每個指紋特征峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰面積比值，并添加相對標(biāo)準(zhǔn)峰分數(shù)，計算所有指紋特征峰面積和與指紋特征標(biāo)準(zhǔn)峰總面積比值，并添加在表中，作為報告，打印。
程序模塊化整體設(shè)計如說明書附圖4例1廣西熏硫紅腺忍冬指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)庫的建立與被檢測樣品的識別。
廣西熏硫紅腺忍冬樣品15個，每樣品高效液相儀進樣2次得30個文件包，導(dǎo)出CVS類型文件30個，分別命名為WLP050801-30。導(dǎo)入VFP的內(nèi)部同名表文件WLP050801-30，并將表文件記錄除類型之外由字符型改變?yōu)閿?shù)字型。以保留時間＜29.and.保留時間＞27，保留時間＞59.and.保留時間＜61.的兩個峰為參照峰，添加字段分離度、相對保留時間分離度r=2(tn-tn-1)wn-wn-1,]]>tn、tn-1為兩峰的保留時間，wn、wn-1為兩峰的峰寬。相對保留時間rt=tn-s1s2-s1(-∞<rt<+∞)s1,s2(s1<s2)]]>為參照峰的保留時間，tn為其它峰的保留時間，rt為相對保留時間，追加分離度和相對保留時間的記錄。模擬WLP050805的圖譜，參見說明書附圖1。在每個表(如WLP050805)中尋找(相對保留時間＞-0.35.and.相對保留時間＜-0.34).or.；(相對保留時間＝0.0).or.；(相對保留時間＞0.1.and.相對保留時間＜0.11).or.；(相對保留時間＞0.11.and.相對保留時間＜0.12).or.；(相對保留時間＞0.27.and.相對保留時間＜0.29).or.；(相對保留時間＞0.57.and.相對保留時間＜0.59).or.；(相對保留時間＝1.0).or.；(相對保留時間＞1.03.and.相對保留時間＜1.08).or.；(相對保留時間＞1.18.and.相對保留時間＜1.20)的峰記錄，并將記錄追加到指紋特征峰表(如CWLP050805)中，以上將得到30個樣品的指紋特征峰表C WLP050801-30。循環(huán)打開指紋特征峰表，讀取相同相對保留時間(如相對保留時間＞0.1.and.相對保留時間＜0.11)的記錄30條，追加到物質(zhì)表(如WLPg3)中，對表中所有字段記錄求均值、標(biāo)準(zhǔn)差、相對標(biāo)準(zhǔn)差，并添加到表尾，將得到9個物質(zhì)峰表WLPg1-9。循環(huán)打開9個物質(zhì)峰表WLPg1-9，讀取最后三行記錄，添加到指紋特征峰標(biāo)準(zhǔn)表，取名為WLP。該表抽象了15個樣品30個表的信息。模擬WLP的圖譜如說明書附圖2，直觀明了。
建立“熏硫紅腺忍冬中綠原酸的含量表”字段分別為表名c(2)，樣品號n(2)，產(chǎn)地c(10)，加工方法c(8)，綠原酸峰面積n(10,5)，綠原酸含量n(6,4)，相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)含量分數(shù)n(6,4)。其中表名為高效液相儀數(shù)據(jù)導(dǎo)出后的文件名WLP050801-30，亦為程序?qū)牒蠼ǔ闪⒌耐砻鸚LP050801-30，需要人工輸入。樣品號、產(chǎn)地、加工方法為樣本(樣品)的采集信息，人工輸入。綠原酸含量根據(jù)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和綠原酸峰面積由計算機計算并追加。相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)含量分數(shù)是由指紋特征峰標(biāo)準(zhǔn)表WLP中讀出綠原酸標(biāo)準(zhǔn)峰面積，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出綠原酸標(biāo)準(zhǔn)含量，相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)含量分數(shù)為樣品綠原酸含量與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)含量比值。
被檢測樣品經(jīng)高效液相儀處理和數(shù)據(jù)導(dǎo)出，經(jīng)(2)、(3)、(4)、(5)程序處理成樣本表p123，讀取該樣本表數(shù)據(jù)，并模擬出該樣品的高效液相儀圖譜，如說明書附圖1。根據(jù)(6)中人工設(shè)定的識別窗口，從該樣本表中識別出指紋特征峰個數(shù)，并將它們分別匯成一個指紋特征峰表。添加與標(biāo)準(zhǔn)表對應(yīng)峰的峰面積，計算每個指紋特征峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰面積比值，并添加相對標(biāo)準(zhǔn)峰分數(shù)，計算所有指紋特征峰面積和與指紋特征標(biāo)準(zhǔn)峰總面積比值，并添加在表中，打印該表，被檢測樣品的檢測報告，如說明書附圖3。


圖1模擬高效液相儀圖譜的效果圖可以增加坐標(biāo)，并使模擬圖譜具有縮放功能。與原圖相比保留時間、峰面積、峰高、峰寬、起始時間、終止時間、分離度等峰形特征都得以模擬。
圖2廣西熏硫紅腺忍冬定量指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)表為基礎(chǔ)的模擬圖譜該圖直觀地反映了指紋特征標(biāo)準(zhǔn)峰的保留時間、峰面積、峰高、峰寬、起始時間、終止時間、分離度等峰形特征。
圖3被檢測樣品的檢測報告列出了從被檢測樣品中找到的指紋特征峰的數(shù)字特征，如峰號、保留時間、峰面積、峰高、峰寬、起始時間、終止時間、分離度、相對保留時間。并列出對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)峰的峰面積、比值、總面積及比值(最后一行)。由圖可知樣品指紋特征峰總面積為42954.3426，標(biāo)準(zhǔn)峰總面積為46408.3240，兩者比值為0.92579。由此可得出該樣品質(zhì)量優(yōu)劣度相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)的0.92579。
圖4程序模塊化整體設(shè)計圖發(fā)明的優(yōu)點及積極效果 本方法提供了參照峰的選取、窗口的設(shè)定及處理數(shù)據(jù)程序方法思路，可輕松地處理大量數(shù)據(jù)，建立定量指紋圖譜數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)，使指紋圖譜不僅具有定性鑒別能力，還具有定量判斷被檢測樣品質(zhì)量優(yōu)劣的功用。同時可模擬圖譜，給予信息提示和表報告。提出了建立定量指紋圖譜的方法，解決了目前指紋圖譜僅用于定性鑒別，不能用于定量評價其他樣品質(zhì)量的問題。應(yīng)用計算機程序處理大量數(shù)據(jù)，處理結(jié)果以數(shù)字和圖形兩種形式表現(xiàn)，更直觀且準(zhǔn)確。
該定量指紋圖譜建立方法可推廣應(yīng)用于各種中藥材、中藥飲片及中成藥的質(zhì)量控制，適用于擁有普通中藥科研人員、一臺高效液相儀、一臺含有VFP程序的電腦的生產(chǎn)及科研單位?？煞奖愕亟⒆约寒a(chǎn)品的定量指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫。并對該產(chǎn)品的其他樣本進行真?zhèn)巫R別和優(yōu)劣評價，增強質(zhì)量控制環(huán)節(jié)，提高產(chǎn)品科學(xué)含量。
權(quán)利要求
1 建立中藥定量指紋圖譜的方法步驟包括(1)數(shù)據(jù)導(dǎo)出，(2)數(shù)據(jù)的導(dǎo)入，(3)數(shù)據(jù)類型的改變，(4)參照峰的選取、識別與其保留時間的讀出，(5)分離度和相對保留時間的添加，(6)樣本表指紋特征峰的讀出，(7)單個物質(zhì)峰表的匯成，(8)指紋特征峰標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫表的匯成，(9)指紋圖譜曲線圖的模擬，(10)指紋圖譜中明確成分的含量測定，(11)識別和評價其他被檢測樣品。
2 消除相對保留時間波動的參照峰處理方法選取兩個標(biāo)志性強的峰為參照峰，保留時間為s1、s2(s1＜s2)，其它峰的保留時間為tn，相對保留時間為rt，相對保留時間rt=tn-s1s2-s1(-∞<rt<+∞),]]>消除儀器不同死體積不同而引起的誤差。
3 利用高效液相儀導(dǎo)出的數(shù)據(jù)模擬分離度小的峰和偏態(tài)峰的方法。
全文摘要
提供方法和程序總體設(shè)計框架，對能代表總體的多個樣品圖譜數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計出總體的共同指紋特征，對每個共有指紋特征峰保留時間、峰面積等10項參數(shù)進行統(tǒng)計，計算其均值、標(biāo)準(zhǔn)差、相對標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計出總體的數(shù)字共同指紋特征，作為可定性定量的指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫。以之為參照，相對保留時間作為定性指標(biāo)，峰面積或峰高作為定量指標(biāo)進行其他樣品的識別和質(zhì)量評定。能依據(jù)高效液相導(dǎo)出的數(shù)據(jù)模擬圖譜，包括偏態(tài)峰形和分離度過小的峰形，對成分明確的物質(zhì)進行含量測定的數(shù)據(jù)處理。該方法可推廣應(yīng)用于各種中藥材、中藥飲片及中成藥的質(zhì)量控制。
文檔編號G06F19/00GK101051041SQ20061007682
公開日2007年10月10日 申請日期2006年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月6日
發(fā)明者辛寧, 張守平, 王柳萍 申請人:辛寧, 張守平, 王柳萍