專利名稱：使用會(huì)聚比決定簇和分流比決定簇來(lái)分析新陳代謝通量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 一 種使用CRD(會(huì)聚比決定簇converging ratio determinant)和SRD(分流比決定簇，split ratio determinant)分析胞內(nèi)新陳
代謝通量的方法，具體涉及一種新陳代謝通量分析方法，其包括選擇 特定目標(biāo)生物體，基于生物化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建所選生物體的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模 型，確定新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型中特定新陳代謝通量之間的相關(guān)性，將該相 關(guān)性定義為CRD和SRD，通過(guò)13C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)確定新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型中特 定生物化學(xué)反應(yīng)的通量比，以確定的CRD、 SRD和人工代謝物修正化學(xué) 計(jì)算矩陣，并將修正的化學(xué)計(jì)算矩陣應(yīng)用到新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型以便進(jìn)行 線性編程。
背景技術(shù)：
通過(guò)使用與基因重組技術(shù)相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)引入新的生物化學(xué) 反應(yīng)或者除去、放大或修改現(xiàn)存新陳代謝途徑，新陳代謝工程提供了沿 著我們所需方向來(lái)改變細(xì)胞或者菌株的新陳代謝特性所需的信息。這種 新陳代謝工程包括生物工程的綜合程度，諸如現(xiàn)有新陳代謝產(chǎn)物的過(guò)量 生產(chǎn)，新的新陳代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，不需要的新陳代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的抑制， 以及廉價(jià)底物的利用。在與其一起新近發(fā)展的日益增加的生物信息的幫 助下，已經(jīng)能夠通過(guò)不同物質(zhì)的基因組信息構(gòu)建每個(gè)新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型。 通過(guò)將新陳代謝網(wǎng)絡(luò)信息和新陳代謝通量分析技術(shù)的組合，不同基本新 陳代謝產(chǎn)物和有用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)的工業(yè)化應(yīng)用可能性現(xiàn)在被顯示(Hong
9等人，Biotech. Bioeng， 83:854, 2003; US 2002/0168654; Price等人，Nat. Rev. Microbiol" 2:886, 2004)。
一般來(lái)說(shuō)，在用于分析細(xì)胞新陳代謝的新陳代謝通量分析技術(shù)中， 基于僅僅認(rèn)為簡(jiǎn)單生物化學(xué)方案的系數(shù)靜態(tài)模型的方法可以被廣義地分 成兩種方法基于線性編程的以約束為基礎(chǔ)的通量分析和基于非線性編 程的新陳代謝通量分析方法?；诰€性編程的以約束為基礎(chǔ)的通量分析 具有易獲得性和簡(jiǎn)單的計(jì)算步驟，但具有的問(wèn)題在于一些可使用的約束 很小，使其不能得到實(shí)際值。此外，基于非線性編程的方法可使用大量 的約束，因此可提供更精確的通量值，但具有的問(wèn)題在于其限制了新陳 代謝網(wǎng)絡(luò)模型的規(guī)模并需要復(fù)雜的計(jì)算步驟，實(shí)驗(yàn)過(guò)程困難，并且還需 要大量時(shí)間用于計(jì)算(Varma等人，Bio-Technol., 12:994, 1994; Nielsen 等人,Bioreaction Engineering Principles, Plenum Press, 1994; Lee等人, Metabolic Engineering, Marcel Dekker, 1999; K. Shimizu, Biotechnol. Bioprocess Eng., 7:237, 2002)。
新陳代謝通量分析是對(duì)生物體中新陳代謝通量進(jìn)行定量的技術(shù)。新 陳代謝通量分析以擬穩(wěn)態(tài)(pseudo-steady state)的假設(shè)為基礎(chǔ)。即，由 于由外部環(huán)境的變化引起的內(nèi)部代謝物濃度的變化是非常迅速的，這種 變化常常被忽略，并且假定內(nèi)部代謝物的濃度沒(méi)有發(fā)生變化。
如果所有的代謝產(chǎn)物、生物化學(xué)途徑和途徑中的化學(xué)計(jì)算矩陣(S/，
反應(yīng)j中的代謝產(chǎn)物i)都是己知的，新陳代謝通量向量(Vj，途徑j(luò)的
通量)可被計(jì)算，其中代謝產(chǎn)物X隨時(shí)間的變化可被表示為所有新陳代 謝通量之和。假定X隨時(shí)間的變化為常數(shù)，即在準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)(quasi-steady state) 假設(shè)的條件下，下列方程被定義但是，存在許多情況，其中僅僅途徑是已知的，并且對(duì)于每種新陳 代謝產(chǎn)物和途徑以及新陳代謝通量向量(Vj)的化學(xué)計(jì)算值部分已知，因 此，上述方程被展開為下列方程
上述方程被分成兩個(gè)矩陣；實(shí)驗(yàn)上已知的化學(xué)計(jì)算值(&(/xM)，其中 /=總代謝物數(shù)量，肘=總化學(xué)計(jì)算已知的反應(yīng)數(shù))次數(shù)通量(^(Mx/))的 限定矩陣和未知化學(xué)計(jì)算值(&(/xA/))次數(shù)通量(v"(MxT))的矩陣。在該關(guān) 系中，m為用于測(cè)定值的下標(biāo)，u為用于未測(cè)定值的下標(biāo)。
如果未知通量向量的列(Su)等于u (即如果變量數(shù)等于方程)，則 通量通過(guò)簡(jiǎn)單的矩陣計(jì)算就能被確定。但是，如果未知通量向量的列(Su) 大于u(即如果存在疊加方程)，為了更精確值的計(jì)算而進(jìn)行驗(yàn)證總方程 的一致性，新陳代謝通量的測(cè)定值的精確性和準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)的有效性的操作， 然后使用非線性編程諸如參數(shù)消耗近似方法等確定新陳代謝通量。
如果變量數(shù)大于方程，則使用特定對(duì)象函數(shù)和不同生理化學(xué)方程通 過(guò)線性編程來(lái)計(jì)算最佳新陳代謝通量分布，其中特定新陳代謝反應(yīng)的通 量值可被限制為特定范圍。這可通過(guò)下式來(lái)計(jì)算
最小化/最大化2=2>,巧
S.t. S、 = 0禾口 Ot肌",,S V; ^ Ot加叫/
其中。為加權(quán)值，并且v,為新陳代謝流。
一般來(lái)說(shuō)，生物量形成率(即特定生長(zhǎng)率)的最大化、典型代謝物 生產(chǎn)的最大化和副產(chǎn)品生產(chǎn)的最小化以及類似過(guò)程被用作目標(biāo)函數(shù)。
CWu，,和是每個(gè)新陳代謝通量可具有的約束值，它們可被附值為每個(gè)
新陳代謝通量中允許的最大值和最小值。
基于這種線性編程方法的新陳代謝通量分析技術(shù)提供了多種信息， 因此是非常有用的，但在大多數(shù)情況下，實(shí)際新陳代謝通量網(wǎng)絡(luò)模型具有顯著大于方程數(shù)的參數(shù)個(gè)數(shù)，因此不能提供用于內(nèi)部新陳代謝通量值 的實(shí)際值。
出于這種原因，近來(lái)發(fā)展了用于分析細(xì)胞內(nèi)新陳代謝通量的技術(shù)，
其中通過(guò)GCMS (氣相色譜-質(zhì)譜)使用放射性同位素標(biāo)記的碳源測(cè)定來(lái) 自細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的主要代謝物的同位素含量，并將其用作附加的約束。 這種技術(shù)(也被稱為同位素體分析，isotopomer analysis)具有的優(yōu)點(diǎn)在 于它在非線性編程方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行計(jì)算并提供了用于中心新陳代謝 網(wǎng)絡(luò)的實(shí)際新陳代謝通量分布。但是，這種技術(shù)具有的缺點(diǎn)是，由于它 以非線性編程方法為基礎(chǔ)，它使用非常復(fù)雜的計(jì)算過(guò)程，給用戶造成了 不便并需要很長(zhǎng)的計(jì)算時(shí)間，并且由于其復(fù)雜性和約束的范圍和數(shù)目方 面的限制，它還僅僅在小尺寸模型中進(jìn)行計(jì)算，包括糖酵解、磷酸戊糖 途徑、TCA、補(bǔ)給途徑和一些氨基酸合成途徑CB/o&c/mo/. 66:86, 1999; K. Shimizu， S/Wec/mo/. B/o戶c咖7:237, 2002)。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出了許多努力以更精確更容易地方式來(lái)分 析新陳代謝通量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用于分析目標(biāo)生物體的新陳代謝特性的新 陳代謝通量分析能夠以準(zhǔn)確迅速的方式通過(guò)各種實(shí)驗(yàn)來(lái)確定特定代謝反 應(yīng)的通量比而得到，從而完成了本發(fā)明，這些實(shí)驗(yàn)包括使用放射性同位 素標(biāo)記的碳源的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和用于酶反應(yīng)速率測(cè)定的實(shí)驗(yàn)，使用CRD、SRD 以及人工代謝物概念將通量比應(yīng)用于化學(xué)計(jì)算矩陣，并基于線性編程使 用化學(xué)計(jì)算矩陣進(jìn)行新陳代謝通量分析。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的技術(shù)課題
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于新陳代謝通量分析的方法，其 包括下列步驟選擇特定目標(biāo)生物體，構(gòu)建所選生物體的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)
模型，將特定新陳代謝通量定義為CRD和SRD，通過(guò)實(shí)驗(yàn)諸如13C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或者酶活性測(cè)定確定新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型中的新陳代謝通量比，并
基于具有CRD、 SRD概念和人工代謝物的線性編程繪出新陳代謝網(wǎng)絡(luò)的 總新陳代謝通量的譜圖。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于分析Exoli的新陳代謝通量的 方法，其包括所述步驟。
技術(shù)方案
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于分析目標(biāo)生物體的通量分 布的方法，該方法包括下列步驟(a)選擇目標(biāo)生物體(人類除外)， 構(gòu)建所選生物體的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型和待測(cè)的總新陳代謝通量；(b)識(shí) 別步驟(a)的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型中特定新陳代謝通量之間的相關(guān)性，并 將特定新陳代謝通量的相關(guān)比定義為CRD (會(huì)聚比決定簇)和SRD (分 流比決定簇)；(c)在所選生物體上進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)諸如13C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或 者酶活性測(cè)定，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上確定步驟(b)的相關(guān)比、CRD 和SRD并對(duì)它們進(jìn)行校正；(d)定義特定新陳代謝通量之間的人工代 謝物；(e)通過(guò)將步驟(c)的校正相關(guān)比、CRD和SRD應(yīng)用于化學(xué)計(jì) 算矩陣以便使用步驟(d)的人工代謝物解答線性方程來(lái)確定附加方程， 并將確定的附加方程應(yīng)用于化學(xué)計(jì)算矩陣以修改化學(xué)計(jì)算矩陣；和(f) 根據(jù)線性編程使用在步驟(e)中修改的化學(xué)計(jì)算矩陣?yán)L出新陳代謝網(wǎng)絡(luò) 的最佳值和總新陳代謝通量的譜圖。
在本發(fā)明中，目標(biāo)生物體優(yōu)選為微生物。而且，步驟(b)中特定新 陳代謝通量的相關(guān)比優(yōu)選使用下列方程1和2定義為CRD和SRD。
Z斗-
cg=p^~~,v一
13<formula>formula see original document page 14</formula>
其中/p是特定新陳代謝通量p的相關(guān)比，/9是特定新陳代謝通量《 的相關(guān)比，q是用于會(huì)聚途徑中特定新陳代謝通量Vq的CRD ， D《是用
于分流途徑中特定新陳代謝通量^的SRD(假定PEP ，其中 P表示所有的會(huì)聚途徑或者分流途徑)。
而且，在步驟(c)中用于新陳代謝通量比的實(shí)驗(yàn)優(yōu)選為使用放射性 同位素標(biāo)記的碳源的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和/或酶反應(yīng)測(cè)定。
此外，步驟(d)中的人工代謝物優(yōu)選使用下列方程3定義 <formula>formula see original document page 14</formula>其中AfS /是用于會(huì)聚途徑中CRD的人工代謝物，"W^^是用于分 流途徑中SRD的人工代謝物，/"/ ^^/是流到人工代謝物M中的新陳代 謝通量的總和，o"0z^^,是從人工代謝物M中流出的新陳代謝通量的總 和，vp和vg分別為新陳代謝通量p和q的新陳代謝通量速率，C《是用 于特定新陳代謝通量q的CRD，Z^是用于特定新陳代謝通量^的SRD 。
此外，在步驟(e)中的修改之前化學(xué)計(jì)算矩陣優(yōu)選表示如下
<formula>formula see original document page 14</formula>而且，在步驟(e)中的修改之后化學(xué)計(jì)算矩陣優(yōu)選表示如下
1-10-100
S.v= 0 1-1 0陽(yáng)l C
0 00 11 -1
.0 00 1 -C《 0
另外，步驟(f)中總新陳代謝通量的最佳值和譜圖優(yōu)選使用下列方
程4繪出 [方程4]
最大化/最小化 Z=Z9V/
戸
條件 2LsVv產(chǎn)6/ V;E/
a/ < <卩 V/ = J
vl v2 v3 v4 v5 v6
=0
其中&是/反應(yīng)中產(chǎn)代謝物的化學(xué)計(jì)算系數(shù)，".是/途徑中的新 陳代謝通量向量，/是一組所有代謝物，J是所有途徑中的一組新陳代謝 通量,￡是一組所有流入/流出的新陳代謝通量，。是用于/途徑的新陳 代謝通量的加權(quán)值，6,是產(chǎn)代謝物的凈輸送通量，/,和",表示產(chǎn)代謝物 的凈輸送通量，以及ay和^是限制值，它們可在/途徑中由新陳代謝通
量處理。
15發(fā)明效果
另一方面，本發(fā)明提供一種用于篩選待擴(kuò)增或剔除的基因以便增加 有用物質(zhì)的產(chǎn)量的方法，所述方法包括使用根據(jù)上述方法繪出的新陳代 謝網(wǎng)絡(luò)的總新陳代謝通量的最佳值和譜圖。
再一方面，本發(fā)明提供一種用于改進(jìn)產(chǎn)生有用物質(zhì)的生物體的方法， 所述方法包括擴(kuò)增或剔除目標(biāo)生物體中所述篩選基因。
還一方面，本發(fā)明提供一種用于分析Exoli.的新陳代謝通量的方法， 所述方法包括下列步驟(a)構(gòu)建E.coli.的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型；(b) 識(shí)別步驟U)的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型中特定新陳代謝通量之間的相關(guān)性， 并將特定新陳代謝通量的相關(guān)比定義為CRD(會(huì)聚比決定簇)和SRD(分 流比決定簇)；(c)在E.coli.上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以便測(cè)定新陳代謝通量比，并 在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上確定步驟(b)的相關(guān)比、CRD和SRD并對(duì)它們進(jìn) 行校正；(d)定義特定新陳代謝通量之間的人工代謝物；(e)通過(guò)將 步驟(c)的校正的相關(guān)比、CRD和SRD應(yīng)用于化學(xué)計(jì)算矩陣以便使用 步驟(d)的人工代謝物解答線性方程來(lái)確定附加方程，并將確定的附加 方程應(yīng)用于化學(xué)計(jì)算矩陣以修改化學(xué)計(jì)算矩陣；和(f)根據(jù)線性編程使 用在步驟(e)中修改的化學(xué)計(jì)算矩陣?yán)L出新陳代謝網(wǎng)絡(luò)的最佳值和總新 陳代謝通量的譜圖。
在本發(fā)明中，步驟(b)中特定新陳代謝通量的相關(guān)比優(yōu)選使用下列 方程1和2定義為CRD和SRD:
Dg = p^,，P
其中/p是特定新陳代謝通量/7的相關(guān)比，《是特定新陳代謝通量《
的相關(guān)比，C《是用于會(huì)聚途徑中特定新陳代謝通量v《的CRD ， ￡)9是用
于分流途徑中特定新陳代謝通量^的SRD(假定Pep ，其中
P表示所有的會(huì)聚途徑或者分流途徑)。
而且，在步驟(c)中用于新陳代謝通量比的實(shí)驗(yàn)優(yōu)選為使用放射性 同位素標(biāo)記的碳源的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和/或酶反應(yīng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)。
此外，步驟(d)中的人工代謝物優(yōu)選使用下列方程3定義 [方程3]
C及D
^ g "PEP"
淑f伊
其中MS /是用于會(huì)聚途徑中crd的人工代謝物，Mf^是用于分 流途徑中SRD的人工代謝物，/"p"^^是流到人工代謝物M中的新陳代
謝通量的總和，OW0"fM。,/是從人工代謝物M中流出的新陳代謝通量的總
和，&和v《分別為新陳代謝通量p和q的新陳代謝通量速率，C《是用 于特定新陳代謝通量q的CRD，i^是用于特定新陳代謝通量^的SRD 。 此外，在步驟(e)中的修改之前化學(xué)計(jì)算矩陣優(yōu)選表示如下<formula>formula see original document page 18</formula>而且，在步驟(e)中的修改之后化學(xué)計(jì)算矩陣優(yōu)選表示如下:
<formula>formula see original document page 18</formula>另外，步驟(f)中總新陳代謝通量的最佳值和譜圖優(yōu)選使用下列方 程4繪出 [方程4]
最大化/最小化:
<formula>formula see original document page 18</formula>其中&是/反應(yīng)中產(chǎn)代謝物的化學(xué)計(jì)算系數(shù)，力是/途徑中的新 陳代謝通量向量，/是一組所有代謝物，J是所有途徑中的一組新陳代謝 通量,￡是一組所有流入/流出的新陳代謝通量，。是用于/途徑的新陳
代謝通量的加權(quán)值，6,是產(chǎn)代謝物的凈輸送通量，/,.和w,.表示^代謝物的凈輸送通量，以及力和A是限制值，它們可在/途徑中由新陳代謝通 量處理。
再一方面，本發(fā)明提供一種用于篩選待擴(kuò)增或剔除的基因以便增加 有用物質(zhì)的產(chǎn)量的方法，所述方法包括使用根據(jù)上述方法繪出的新陳代 謝網(wǎng)絡(luò)的總新陳代謝通量的最佳值和譜圖。
再一方面，本發(fā)明提供了一種用于改進(jìn)產(chǎn)生有用物質(zhì)的E.coli.的方 法，所述方法包括擴(kuò)增或剔除E.coli.中所述篩選基因。
通過(guò)下列具體實(shí)施方式
和附圖，本發(fā)明的其它特征和實(shí)施方式將更 加明顯。


圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的新陳代謝通量分析方法。
圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明通過(guò)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)使用放射性同位素標(biāo)記的碳源 定義CRD和SRD的方法。
圖3顯示了在根據(jù)本發(fā)明定義的CRD和SRD的基礎(chǔ)上使用人工代 謝物定義相關(guān)反應(yīng)方程之間的相關(guān)性的方法。
圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的使用MetaFluxNet的其中CRD和SRD被 應(yīng)用的實(shí)施例。
圖5顯示了使用人工代謝物的其中CRD和SRD被應(yīng)用于E.coli.的 新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型的實(shí)施例，并顯示了該實(shí)施例的結(jié)果值(圖5A)和結(jié) 果值的準(zhǔn)確性(圖5B)。
具體實(shí)施例方式
在本文中，術(shù)語(yǔ)特定新陳代謝通量之間的"相關(guān)比"指的是相關(guān)性， 諸如從各種環(huán)境變化或者生長(zhǎng)曲線得到的新陳代謝通量值，或者來(lái)自可通過(guò)新陳代謝通量值預(yù)測(cè)的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)值的穩(wěn)定增加或降低，并意味著 包括可表示相關(guān)性的所有條件。
為了進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)新陳代謝通量分析技術(shù)，其總新陳代謝 通量將被測(cè)定的目標(biāo)生物體(人類除外)首先被選擇，并且構(gòu)建所選生 物體的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型。然后，其間具有相關(guān)性的特定新陳代謝通量 在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上被識(shí)別，是否存在從特定代謝物流入或流出的新陳 代謝通量被確定以便基于新陳代謝通量的數(shù)量級(jí)將新陳代謝通量的貢獻(xiàn)
程度定義為CRD或者SRD。而且，為了測(cè)定所選生物體的新陳代謝通量， 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)包括使用放射性同位素標(biāo)記的碳源的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和用于酶反應(yīng)測(cè) 定，并且基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定CRD和SRD。然后，確定的CRD和SRD使 用人工代謝物被應(yīng)用于化學(xué)計(jì)算矩陣，總新陳代謝通量的最佳值和譜圖 在線性編程的基礎(chǔ)上繪出?？傂玛惔x通量的最佳值和譜圖可使用下列 算法來(lái)計(jì)算
最大化/最小化 Z-2。"
戸
條件 2Ls》v7=&
嚴(yán) ' a, <力s卩,
其中&是/反應(yīng)中產(chǎn)代謝物的化學(xué)計(jì)算系數(shù)，"是/途徑中的新 陳代謝通量向量，/是一組所有代謝物，J是所有途徑中的一組新陳代謝 通量，￡是一組所有流入/流出的新陳代謝通量，。是用于/途徑的新陳
代謝通量的加權(quán)值，^是產(chǎn)代謝物的凈輸送通量，/,和",表示產(chǎn)代謝物的凈輸送通量，以及力和A是限制值，它們可在/途徑中由新陳代謝通 量處理。
圖1顯示了使用根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)新陳代謝通量技術(shù)執(zhí)行繪出具有
更高精確性的總新陳代謝通量譜圖的方法的全部過(guò)程，圖2示意性地示 出了將所述方法應(yīng)用于新陳代謝通量分析的實(shí)施例。
為了應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的新陳代謝分析方法，用于主要會(huì)聚途 徑(A)或分流途徑(B)的CRD和SRD首先應(yīng)當(dāng)被定義。通過(guò)初步實(shí) 驗(yàn)，包括使用放射性同位素標(biāo)記的碳源測(cè)定典型代謝物的同位素標(biāo)記和 用于測(cè)定主要會(huì)聚途徑或分流途徑的酶反應(yīng)的測(cè)定，特定新陳代謝通量 和f的相關(guān)比被測(cè)定，并在確定的相關(guān)比的基礎(chǔ)上定義CRD和SRD。這 里，主要分流途徑或會(huì)聚途徑的相關(guān)比之和被定義為1:
其中/p是特定新陳代謝通量p的相關(guān)比，P表示所有的會(huì)聚途徑或 者分流途徑。
下面顯示通過(guò)圖2的示例性模型定義用于會(huì)聚途徑(圖2A)中特定 新陳代謝通量的CRD的算術(shù)表示，以便應(yīng)用本發(fā)明
其中/p是特定新陳代謝通量p的相關(guān)比，《是特定新陳代謝通量《的
相關(guān)比，q是用于會(huì)聚途徑中特定新陳代謝通量^的CRD。
下面顯示通過(guò)圖2的示例性模型定義用于分流途徑(圖2B)中特定 新陳代謝通量的SRD的算術(shù)表示，以便應(yīng)用本發(fā)明 Z 4-《
21其中/p是特定新陳代謝通量p的相關(guān)比,/g是特定新陳代謝通量《的
相關(guān)比，i^是用于分流途徑中特定新陳代謝通量v《的SRD。
為了將定義的CRD或者SRD應(yīng)用于化學(xué)計(jì)算矩陣以解決線性編程，
相關(guān)新陳代謝通量之間的人工代謝物M^f如圖2所示被定義。通過(guò)上述
計(jì)算過(guò)程得到的CRD和SRD可直接預(yù)測(cè)為用于人工代謝物Martf的化學(xué)
計(jì)算系數(shù)，假定為準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)的情況下其反應(yīng)方程如下，其和為0: (^CV^ c及"
__^= /，W/ -卯,財(cái)(V孤^D-o
蘊(yùn): —
其中A'/g /是用于會(huì)聚途徑中crd的人工代謝物，^r^是用于
分流途徑中SRD的人工代謝物，、新陳代謝通量《的新陳代謝通量速率， C9是用于特定新陳代謝通量Vq的CRD, D《是用于特定新陳代謝通量v《 的SRD。結(jié)果，用于人工代謝物的反應(yīng)方程被應(yīng)用為線性編程中的等式 約束。
根據(jù)各種實(shí)驗(yàn)誤差，CRD和SRD值有時(shí)可變成具有最大值和最小值 之間的范圍的值。因此，在這種情況下，人工代謝物的反應(yīng)方程還可具 有范圍，并被應(yīng)用于不等式限制，其數(shù)學(xué)表示如下
^^^^ c1111^
-^- ^-々、甲—v《 j》o
廣max
^M"， 一 ，max 、
j :■■:■■: = V^r —'( ，.j vp —可 J《0
其中A/art/是人工代謝物M的最小化學(xué)計(jì)算值，Af。《是人工代謝
物M的最大化學(xué)計(jì)算值，C《mZ 是用于^的最小CRD值,C《w";c是用于 v,的最大CRD值。
22在本發(fā)明中，人工代謝物被用于將上述定義的CRD和SRD應(yīng)用于 化學(xué)計(jì)算矩陣來(lái)解答線性方程以便有效地應(yīng)用附加限制值，所產(chǎn)生的化 學(xué)計(jì)算矩陣被用于在線性編程的基礎(chǔ)上進(jìn)行總新陳代謝通量分析。
下列軟件系統(tǒng)可被用于計(jì)算新陳代謝通量以Matlab為基礎(chǔ)的軟件 系統(tǒng)，諸如FluxAnalyzer (Klamt等人，^/o/w/wtwW/w, 19:216， 2003)和 Metabologica (Zhu等人，Afeto6. 5:74， 2003)，可獨(dú)立進(jìn)行計(jì)算的程序， 包括 Fluxor(http:〃arep.med.harvard. edu/moma/biospicefluxor.html), Simpheny (Genomatica Inc., San Diago, CA)， INSILICO Discovery (腦ILCO biotechnology Inc., Stuttgart, Germany), FBA (http:〃systemsbiology.ucsd. edu/downloads/fba.htm)，和MetaFluxNet (Lee等人,別o/"/orm油'w, 19:2144， 2003),以及計(jì)算機(jī)語(yǔ)言通用程序工具， 諸如Gams (GAMS Development Corporation, NW Washington, DC), C語(yǔ) 言禾卩Fortran 。
在本發(fā)明中，選擇E.coli.模型系統(tǒng)作為用于應(yīng)用所述方法的模型系 統(tǒng)，Exoli.新陳代謝通量的總新陳代謝通量分析通過(guò)初步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。
實(shí)施例
下面，將通過(guò)特定實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)地描述，但是，本 發(fā)明并不限于這些實(shí)施例，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是，可在 本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行各種變化和修改。
特別是，下面的實(shí)施例示出了使用五sc&n'cWfl co/M乍為待分析新陳 代謝通量的菌株進(jìn)行改進(jìn)的新陳代謝通量分析，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō) 顯而易見的是，通過(guò)本發(fā)明公開的內(nèi)容，也可使用除E.coli.以外的其它 菌株來(lái)進(jìn)行新陳代謝通量分析。
而且，在下面的實(shí)施例中，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中新陳代謝通量的相關(guān)比使 用放射性同位素標(biāo)記的碳源由GC-MS (氣相色譜質(zhì)譜)確定為用于定義
23CRD和SRD的初步實(shí)驗(yàn)。但是，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是， 通過(guò)本發(fā)明公開的內(nèi)容，可表示新陳代謝通量之間的關(guān)系的所有其它實(shí) 驗(yàn)，包括酶反應(yīng)速率測(cè)定都可被用作定義CRD和SRD的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例l: CRD和SRD在示范性模型中的應(yīng)用
作為用于新陳代謝通量分析的示范性模型，構(gòu)建了圖3中顯示的系 統(tǒng)。設(shè)置了包括5個(gè)反應(yīng)方程、3個(gè)代謝物及1個(gè)吸收(uptake, Rl)和 最大值v6作為新陳代謝通量分析的目標(biāo)函數(shù)的示范性模型。使用 MetaFluxNet 1.6進(jìn)行刺激，其可通過(guò)http:〃mbel.kaist.ac.kr/下載(Lee 等人，所o/"/orma"d 19:2144, 2003)。
為了進(jìn)行比較，初步進(jìn)行了不包括CRD和SRD的新陳代謝通量分 析。當(dāng)假定為準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)時(shí)，示范性模型的化學(xué)計(jì)算矩陣如下
<formula>formula see original document page 24</formula>
在化學(xué)計(jì)算矩陣的基礎(chǔ)上根據(jù)線性編程進(jìn)行新陳代謝通量分析。對(duì) 于實(shí)驗(yàn)限制值的輸入的類似實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，R3新陳代謝速率，即客觀新陳代 謝通量之一被設(shè)置為lmmol/g DCWh并輸入為限制值，作為碳源吸收的 新陳代謝通量的Rl的新陳代謝通量被設(shè)置為5mmol/g DCWh，結(jié)果如下 最大化 &
A v，- a- a =0 :約束條件 <formula>formula see original document page 24</formula>包括一種相對(duì)于代謝物C的會(huì)聚途徑的這種示范性模型和用于會(huì)聚 途徑的反應(yīng)方程R4和R5被設(shè)置為具有相關(guān)性。而且，根據(jù)相關(guān)比，CRD、 Cq被設(shè)定為0.5。
為了應(yīng)用CRD，具有相關(guān)性的兩種新陳代謝通量之間的人工代謝物 M時(shí)f被設(shè)定，圖3顯示了將CRD應(yīng)用于這種模型的方法。而且，根據(jù)本 發(fā)明，人工代謝物的系數(shù)被定義為/^ = 0.5，其為CRD值。得到的修改 的化學(xué)計(jì)算矩陣如下
<formula>formula see original document page 25</formula>
在根據(jù)線性編程的化學(xué)計(jì)算矩陣的基礎(chǔ)上進(jìn)行新陳代謝通量分析。
對(duì)于實(shí)驗(yàn)限制值輸入的類似實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，R3新陳代謝速率，即客觀新陳代
謝通量之一被設(shè)置為lmmol/gDCWh并輸入為限制值，作為碳源吸收的
新陳代謝通量的Rl的新陳代謝通量被設(shè)置為5mmol/g DCWh，結(jié)果如下
<formula>formula see original document page 25</formula>如圖3所示，CRD沒(méi)有被應(yīng)用于其上的一般新陳代謝通量分析的實(shí) 施例顯示了內(nèi)部新陳代謝通量分布的簡(jiǎn)單組合，特別是用于代謝物C的 會(huì)聚途徑之一的R4不具有其值。顯然，這是一種在使用根據(jù)實(shí)際線性編 程的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行新陳代謝通量分析中對(duì)于一些會(huì)聚途徑或者分流 途徑來(lái)說(shuō)新陳代謝通量分布中頻繁出現(xiàn)的現(xiàn)象，而且顯然不是實(shí)際現(xiàn)象。
但是，與上面的情況不同，在通過(guò)將構(gòu)成會(huì)聚途徑的兩種新陳代謝 通量之間的相關(guān)比定義為CRD和人工代謝物的新陳代謝通量分布中，會(huì) 聚途徑的新陳代謝通量分布根據(jù)相關(guān)比被識(shí)別，甚至目標(biāo)函數(shù)的值都是 相同的。由于這種相關(guān)比是以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的，其顯示非常好的效果，即 顯示更接近實(shí)際現(xiàn)象的新陳代謝通量分布。
實(shí)施例2: CRD應(yīng)用于E.coli.新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型中的實(shí)施例
在E.coli.的情況下，由979生物化學(xué)反應(yīng)和814代謝物構(gòu)成的新的 新陳代謝網(wǎng)絡(luò)被作為新陳代謝網(wǎng)絡(luò)。包括所有E.coli.生物化學(xué)反應(yīng)和用 于形成待使用生物量形成方程作為目標(biāo)函數(shù)的E.coli.的生物量組成中的 大多數(shù)的這種系統(tǒng)如下(Neidhardt等人，CW/m/ct Mo/ecw/w 5z'o/ogy, 1996): 55%蛋白質(zhì)，20.5% RNA, 3.1% DNA， 9.1%脂類，3.4%脂多糖， 2.5%肽聚糖，2.5%糖原，0.4%聚胺和3.5%其它代謝物，輔因子及離子。
一般來(lái)說(shuō)，E.coli.似乎使用最大細(xì)胞組分生長(zhǎng)，這被表示為特定生長(zhǎng) 率。因此，使用特定生長(zhǎng)率作為目標(biāo)函數(shù)根據(jù)線性編程進(jìn)行新陳代謝通 量分析。
首先，在E.coli.中，可定義相關(guān)比的實(shí)驗(yàn)值通過(guò)使用放射性同位素 標(biāo)記的碳源的實(shí)驗(yàn)得到。為了通過(guò)GCMS (氣相色譜-質(zhì)譜)測(cè)定確定新 陳代謝通量之間的相關(guān)比，進(jìn)行E. Fischer等人的方法(E. Fischer等乂, 五w. / 270:880， 2003)，其數(shù)學(xué)表示如下。
26根據(jù)通過(guò)除去天然放射性同位素含量的測(cè)定值修正的主要代謝物的
同位素含量定義MDV (質(zhì)量分布向量)，將每種代謝物的元素之和定義為l:
—)
定位在主要會(huì)聚途徑中的代謝物的成分的同位素含量以其前體的同位素含量為基礎(chǔ)，并依賴于以新陳代謝通量網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)的新陳代謝通量
的數(shù)量級(jí)，特別是，定義每種代謝物的同位素含量的MDV的元素之和為l。因此，通過(guò)每種代謝物的MDV，定位在會(huì)聚途徑中并彼此相關(guān)的新陳代謝通量之間的相關(guān)比定義如下
力一 MZH; - MDFp2
Pi 一 A鼎；-扁&2
其中M是會(huì)聚途徑中存在的目標(biāo)代謝物，和是用作代謝物M的前體的代謝物，/p/表示來(lái)自pl的新陳代謝通量與來(lái)自p2的新陳代謝通量的相關(guān)比。這里，相關(guān)新陳代謝通量的相關(guān)比之和被定義為1，其數(shù)
學(xué)表示如下PEP
為了應(yīng)用本發(fā)明，對(duì)于特定新陳代謝通量的CRD被定義，其數(shù)學(xué)表
示如下
其中/p是特定新陳代謝通量p的相關(guān)比，/《是特定新陳代謝通量《
的相關(guān)比，CV是對(duì)于會(huì)聚途徑中特定新陳代謝通量《的CRD。在E.coli.的新陳代謝通量網(wǎng)絡(luò)中，包括糖酵解、磷酸戊糖途徑、TCA
及補(bǔ)給途徑的主要中心新陳代謝通量網(wǎng)絡(luò)中的5個(gè)會(huì)聚途徑之間的關(guān)系
被定義，并以目標(biāo)代謝物和如圖4中顯示的主要會(huì)聚途徑的反應(yīng)方程的
名義被表達(dá)。為了應(yīng)用來(lái)自實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的相關(guān)新陳代謝通量的相關(guān)比，使
用相關(guān)新陳代謝通量之間的人工代謝物定義附加的反應(yīng)方程，并且當(dāng)假
定為準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)時(shí)，用于每種人工代謝物的反應(yīng)方程如下叔
== 2(v加一 & — v加)—C (v* + v汰+ 3v汰2 + 2v似)=0
Z = VWa - C- (vw* + v, ) = 0= v解一 Cy vWfc = O
max
= U - d + v一)》O
= +3&2 + 2vto)-Cr(U +2 -2v汰2-2、)《0
其中，參見圖4， Vh是從F6P到T3P的fba反應(yīng)的通量的量，Vtk2是從E4P和P5P到F6P和T3P的tk2反應(yīng)的通量的量，vtkl是從P5P到S7P和T3P的tkl反應(yīng)的通量的量， 是從S7P和T3P到F6P和E4P的ta反應(yīng)的通量的量，vppe是從PEP到OAA的ppc反應(yīng)的通量的量，veda是從6-P-葡萄糖酸到T3P和PYR的eda反應(yīng)的通量的量，vmdh是從MAL到OAA的mdh反應(yīng)的通量的量，vpyk是從PEP到PYR的pyk反應(yīng)的通量的量，v皿是從MAL到PYR的mez反應(yīng)的通量的量，Ca和M。分別表示對(duì)于特定會(huì)聚途徑a的CRD和人工代謝物，Cp和Mp分別表示對(duì)于特定會(huì)聚途徑p的CRD和人工代謝物，CY和MY分別表示對(duì)于特定會(huì)聚途徑y(tǒng)的CRD和人工代謝物，并且Q和Ms分別表示對(duì)于特定會(huì)聚途徑S的CRD和人工代謝物。
28確定了對(duì)于5個(gè)會(huì)聚途徑的5個(gè)人工代謝物的總和，它們的反應(yīng)方程被定義，并且基于根據(jù)實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)比值是否具有范圍定義了三個(gè)等式約束和兩個(gè)不等式約束。
根據(jù)Fischer等人04脂/. 5foc/zem. 325:308, 2004)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算了得自用于確定用于每種人工代謝物的反應(yīng)方程中的每個(gè)CRD值的實(shí)際實(shí)驗(yàn)的每種代謝物的MDV和得自MDV值的相關(guān)比，并與使用20/80M[U-13C]葡萄糖/[1-13C]葡萄糖標(biāo)記的碳源得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)值一致。根據(jù)上述方法定義的CRD值在下表1中顯示。
表1
人工代謝物會(huì)聚比決定簇(C)
用于絲氨酸的iVf。2.57 ±0.06
用于丙酮酸鹽的3/60.01 ±0.10
用于草酰乙酸鹽的Mg1.86 ±0.06
用于丙酮酸鹽的^/rf(上限)0.19±0.14
用于丙酮酸鹽的3^(下限)0.06 ±0.04
用于磷酸烯醇丙酮酸鹽的3fe(上限)0.20 ±0.10
如上所述，當(dāng)應(yīng)用了用于人工代謝物的附加定義的反應(yīng)方程和CRD值，E.coli.的新陳代謝通量根據(jù)假定為準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)的線性編程來(lái)進(jìn)行。
在分析結(jié)果中，主要中心新陳代謝網(wǎng)絡(luò)中的新陳代謝通量的實(shí)施例在圖5中顯示。而且，基于根據(jù)非線性編程得到的用于主要中心新陳代謝通量網(wǎng)絡(luò)的新陳代謝通量分布，使用本發(fā)明的結(jié)果(圖5A中上位值)和不使用本發(fā)明的結(jié)果(圖5B中下位值)的準(zhǔn)確性在圖5B中顯示。
在上面的結(jié)果的基礎(chǔ)上可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一些通過(guò)附加實(shí)驗(yàn)得到的附加數(shù)值有效地用作線性編程的附加限制值時(shí)，可得到更為準(zhǔn)確的細(xì)胞內(nèi)新陳代謝通量分布。
29實(shí)施例3:使用本發(fā)明來(lái)增加有用物質(zhì)產(chǎn)量的基因篩選和生物體改進(jìn)為了增加有用物質(zhì)的產(chǎn)量，使用根據(jù)實(shí)施例1和2得到的總新陳代謝通量最佳值和譜圖篩選了增加有用物質(zhì)產(chǎn)量的待擴(kuò)增基因。待擴(kuò)增基因的篩選根據(jù)公開號(hào)為10-2005-0086119的韓國(guó)專利文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行。
而且，根據(jù)公開號(hào)為10-2005-0086119的韓國(guó)專利文獻(xiàn)中的方法篩選的待擴(kuò)增基因可被引入相關(guān)生物體中或者在其中擴(kuò)增，以構(gòu)建相關(guān)生物體的突變體。
雖然已經(jīng)參照特定特征對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是，該描述僅僅用于優(yōu)選實(shí)施方式，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將由所附的權(quán)利要求書及其等同物來(lái)限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)本發(fā)明的簡(jiǎn)單修改、變化和附加都是可能的，都不偏離在所附權(quán)利要求書中限定的本發(fā)明的精神和范圍。
工業(yè)實(shí)用性
如上面詳細(xì)描述的那樣，本發(fā)明提供了新陳代謝通量分析方法和用于分析E.coli.的新陳代謝通量的方法。根據(jù)本發(fā)明，相對(duì)于目標(biāo)生物體中特定代謝物(該目標(biāo)生物的基因組水平的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型被構(gòu)建)的流入/流出新陳代謝通量之間的關(guān)系可使用得自各種實(shí)驗(yàn)包括使用放射性同位素標(biāo)記的碳源的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和用于測(cè)定酶反應(yīng)速率的實(shí)驗(yàn)的有用信息定義為相關(guān)比，使內(nèi)部新陳代謝通量可以更為準(zhǔn)確迅速的方式定量并分析。
30
權(quán)利要求
1、一種分析目標(biāo)生物體的新陳代謝通量的方法，該方法包括下列步驟(a)選擇目標(biāo)生物體(人類除外)，其總新陳代謝通量被測(cè)定，并構(gòu)建所選生物體的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型；(b)識(shí)別步驟(a)的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型中特定新陳代謝通量之間的相關(guān)性，并將特定新陳代謝通量的相關(guān)比定義為CRD和SRD；(c)在所選生物體上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)定新陳代謝通量比，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上確定步驟(b)的相關(guān)比、CRD和SRD并對(duì)它們進(jìn)行校正；(d)定義特定新陳代謝通量之間的人工代謝物；(e)通過(guò)將步驟(c)的校正的相關(guān)比、CRD和SRD應(yīng)用于化學(xué)計(jì)算矩陣以便使用步驟(d)的人工代謝物解答線性方程來(lái)確定附加方程，并將確定的附加方程應(yīng)用于化學(xué)計(jì)算矩陣以修改化學(xué)計(jì)算矩陣；和(f)根據(jù)線性編程使用在步驟(e)中修改的化學(xué)計(jì)算矩陣?yán)L出新陳代謝網(wǎng)絡(luò)的最佳值和總新陳代謝通量的譜圖。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的分析目標(biāo)生物體的新陳代謝通量的方法， 其特征在于，目標(biāo)生物體優(yōu)選為微生物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的分析目標(biāo)生物體的新陳代謝通量的方法， 其特征在于，步驟(b)中特定新陳代謝通量的相關(guān)比使用下列方程l和 2定義為CRD和SRD:[方程1][方程2]<formula>formula see original document page 3</formula>其中/p是特定新陳代謝通量/7的相關(guān)比，/《是特定新陳代謝通量《的相關(guān)比，C《是用于會(huì)聚途徑中特定新陳代謝通量v《的CRD ， 是用于分流途徑中特定新陳代謝通量v《的SRD(假定l'v^sp， 其中P表示所有的會(huì)聚途徑或者分流途徑)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的分析目標(biāo)生物體的新陳代謝通量的方法， 其特征在于，在步驟(c)中用于新陳代謝通量比的實(shí)驗(yàn)為使用放射性同 位素標(biāo)記的碳源的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和/或酶反應(yīng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析目標(biāo)生物體的新陳代謝通量的方法， 其特征在于，步驟(d)中的人工代謝物使用下列方程3定義[方程3〗<formula>formula see original document page 3</formula>其中A/art/是用于會(huì)聚途徑中CRD的人工代謝物，Mart/是用于 分流途徑中SRD的人工代謝物，/"pwfMw是流到人工代謝物M中的新陳 代謝通量的總和，oW/w^^是從人工代謝物M中流出的新陳代謝通量的 總和，vp和Vq分別為新陳代謝通量p和q的新陳代謝通量速率，Cg是 用于特定新陳代謝通量q的CRD， D,是用于特定新陳代謝通量v《的 SRD 。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析目標(biāo)生物體的新陳代謝通量的方法， 其特征在于，在步驟(e)中的修改之前化學(xué)計(jì)算矩陣表示如下<formula>formula see original document page 4</formula>
7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析目標(biāo)生物體的新陳代謝通量的方法, 其特征在于，在步驟(e)中的修改之后化學(xué)計(jì)算矩陣表示如下 <formula>formula see original document page 4</formula>
8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析目標(biāo)生物體的新陳代謝通量的方法， 其特征在于，步驟(f)中總新陳代謝通量的最佳值和譜圖使用下列方程4繪出[方程4]戸最大化/最小化:9"條件》=J其中&是/反應(yīng)中產(chǎn)代謝物的化學(xué)計(jì)算系數(shù)，力是/途徑中的新 陳代謝通量向量，/是一組所有代謝物，/是所有途徑中的一組新陳代謝通量，￡是一組所有流入/流出的新陳代謝通量，c,是用于/途徑的新陳代謝通量的加權(quán)值，^是產(chǎn)代謝物的凈輸送通量，/,和表示產(chǎn)代謝物 的凈輸送通量，以及ay和A是限制值，它們可在/途徑中由新陳代謝通 量處理。
9、 一種篩選待擴(kuò)增或剔除的基因以便增加有用物質(zhì)的產(chǎn)量的方法， 所述方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法繪出的新陳代 謝網(wǎng)絡(luò)的總新陳代謝通量的最佳值和譜圖。
10、 一種改進(jìn)產(chǎn)生有用物質(zhì)的生物體的方法，所述方法包括擴(kuò)增或 剔除目標(biāo)生物體中通過(guò)權(quán)利要求9所述的方法篩選的基因。
11、 一種分析E.coli.的新陳代謝通量的方法，所述方法包括下列步驟(a) 構(gòu)建E.coli.的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型；(b) 識(shí)別步驟(a)的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型中特定新陳代謝通量之間 的相關(guān)性，并將特定新陳代謝通量的相關(guān)比定義為CRD和SRD;(c) 在E.coli.上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以便測(cè)定新陳代謝通量比，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的基礎(chǔ)上確定步驟(b)的相關(guān)比、CRD和SRD并對(duì)它們進(jìn)行校正；(d) 定義特定新陳代謝通量之間的人工代謝物；(e) 通過(guò)將步驟(c)的校正的相關(guān)比、CRD和SRD應(yīng)用于化學(xué)計(jì) 算矩陣以便使用步驟(d)的人工代謝物解答線性方程來(lái)確定附加方程， 并將確定的附加方程應(yīng)用于化學(xué)計(jì)算矩陣以修改化學(xué)計(jì)算矩陣；和(f) 根據(jù)線性編程使用在步驟(e)中修改的化學(xué)計(jì)算矩陣?yán)L出新 陳代謝網(wǎng)絡(luò)的最佳值和總新陳代謝通量的譜圖。
12、 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的分析E.coli.的新陳代謝通量的方法，其 特征在于，步驟(b)中特定新陳代謝通量的相關(guān)比使用下列方程1和2 定義為CRD和SRD:[方程1]<formula>formula see original document page 6</formula>[方程2] <formula>formula see original document page 6</formula>其中/p是特定新陳代謝通量/7的相關(guān)比，/g是特定新陳代謝通量^的相關(guān)比，Q是用于會(huì)聚途徑中特定新陳代謝通量v《的CRD ， Z)9是用于分流途徑中特定新陳代謝通量^的SRD(假定PEP其中P表示所有的會(huì)聚途徑或者分流途徑)。
13、 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的分析E.coli.的新陳代謝通量的方法，其 特征在于，在步驟(c)中用于新陳代謝通量比的實(shí)驗(yàn)為使用放射性同位 素標(biāo)記的碳源的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和/或酶反應(yīng)速率測(cè)定實(shí)驗(yàn)。
14、 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的分析E.coli.的新陳代謝通量的方法，其 特征在于，步驟(d)中的人工代謝物使用下列方程3定義[方程3]<formula>formula see original document page 6</formula>"Ci P w戰(zhàn)" 其中》/art/是用于會(huì)聚途徑中CRD的人工代謝物，Af art/是用于分流途徑中SRD的人工代謝物，/"/n^^/是流到人工代謝物M中的新陳代 謝通量的總和，oW;n^^/是從人工代謝物M中流出的新陳代謝通量的總 和，vp和vq分別為新陳代謝通量p和q的新陳代謝通量速率，C9是用 于特定新陳代謝通量q的CRD, Z)《是用于特定新陳代謝通量V《的SRD。
15、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的分析E.coli.的新陳代謝通量的方法，其 特征在于，在步驟(e)中的修改之前化學(xué)計(jì)算矩陣表示如下<formula>formula see original document page 7</formula>
16、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的分析E.coli.的新陳代謝通量的方法，其 特征在于，在步驟(e)中的修改之后化學(xué)計(jì)算矩陣表示如下<formula>formula see original document page 7</formula>
17、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的分析E.coli.的新陳代謝通量的方法，其 特征在于，步驟(f)中總新陳代謝通量的最佳值和譜圖使用下列方程4 繪出[方程4]最大化/最小化 Z = 2條件<formula>formula see original document page 7</formula>其中是/反應(yīng)中產(chǎn)代謝物的化學(xué)計(jì)算系數(shù)，力是/途徑中的新 陳代謝通量向量，/是一組所有代謝物，J是所有途徑中的一組新陳代謝 通量,￡是一組所有流入/流出的新陳代謝通量，。是用于/途徑的新陳 代謝通量的加權(quán)值，^是產(chǎn)代謝物的凈輸送通量，/,和表示產(chǎn)代謝物 的凈輸送通量，以及巧和A是限制值，它們可在/途徑中由新陳代謝通 量處理。
18、 一種篩選待擴(kuò)增或剔除的基因以便增加有用物質(zhì)的產(chǎn)量的方法， 所述方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)所述的方法繪出的新陳 代謝網(wǎng)絡(luò)的總新陳代謝通量的最佳值和譜圖。
19、 一種用于產(chǎn)生有用物質(zhì)的改進(jìn)E.coli.的方法，所述方法包括擴(kuò) 增或剔除Exoli.中通過(guò)權(quán)利要求18所述方法篩選的基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用CRD和SRD分析新陳代謝通量的方法，具體地，所述方法包括選擇特定目標(biāo)生物體，并基于生物化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建所選生物體的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，確定代謝網(wǎng)絡(luò)模型中特定代謝通量之間的相關(guān)性，將相關(guān)比定義為CRD和SRD，為了測(cè)定新陳代謝通量比通過(guò)實(shí)驗(yàn)定義新陳代謝通量的相關(guān)比，使用確定的CRD、SRD和人工代謝物相關(guān)比修改化學(xué)計(jì)算矩陣，并應(yīng)用代謝網(wǎng)絡(luò)模型的修改的化學(xué)計(jì)算矩陣以便進(jìn)行線性編程。根據(jù)本發(fā)明的方法，相對(duì)于目標(biāo)生物體(包括E.coli.)，該目標(biāo)生物的基因組水平的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)模型被構(gòu)建，其中特定代謝物的流入/流出新陳代謝通量之間的關(guān)系可使用得自各種實(shí)驗(yàn)包括使用放射性同位素標(biāo)記的碳源的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和用于測(cè)定酶反應(yīng)速率的實(shí)驗(yàn)的有用信息定義為相關(guān)比。因此，來(lái)自各種實(shí)驗(yàn)的限制值可被有效使用，使內(nèi)部新陳代謝通量可以更為準(zhǔn)確迅速的方式定量并分析。
文檔編號(hào)G06F19/00GK101460844SQ200680054294
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2006年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者崔亨奭, 李相燁, 金兌勇 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院