專利名稱：：一種測定低乳糖牛奶中乳糖水解率的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種測定低乳糖牛奶中乳糖水解率的方法，更具體而言，涉及采用本申請所述的葡萄糖氧化酶-分光光度法測定低乳糖牛奶的乳糖水解率的方法。
背景技術：
：低乳糖牛奶是利用乳糖酶將牛奶中乳糖進行水解，水解產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖，因此水解率是衡量低乳糖牛奶水解程度的一項重要的生產(chǎn)指標。目前文獻資料報導中所介紹的測定低乳糖牛奶水解率的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)(甘賓賓，2001)、凝固點下降法(馬夫霞，2002)、碘量法(秦立虎，2003)等幾種。其中HPLC法是以色譜儀作為基礎，其最大的優(yōu)點就是乳糖水解率測定的準確度高，但不足之處是每次開機的費用很高，即使大型的乳品企業(yè)該方法也不能接受；而其他的幾種方法也由于所需要有專用的儀器及其相關的配套試劑，或是由于其檢測分析的周期過長以及所測定的結果的準確性差等原因，也使得這些方法目前很難在實際的檢測分析中得到應用，并且這些檢測低乳糖牛奶乳糖水解率的方法必須有對照樣，即必須保留未水解的牛奶，以便在測定乳糖水解率時用來測定未水解時牛奶中乳糖的濃度，這對于成品檢測是無法實現(xiàn)的。發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，1分子的乳糖在乳糖酶的作用下水解生成1分子的葡萄糖和1分子的半乳糖，樣品中的葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶氧化生成葡萄糖酸及過氧化氫，后者在過氧化氫酶的作用下，將還原性4-氨醛按提比林與酚偶聯(lián)縮合成可被分光光度計測定的紅色醌類化合物。生成的醌類化合物顏色的深淺與葡萄糖含量成正比，分別測定標準管與樣品管的吸光光度值，則可計算葡萄糖的含量，通過葡萄糖濃度可計算出水解的乳糖濃度，如果牛奶是完全水解的，則通過葡萄糖濃度可計算出水解以前牛奶中乳糖的濃度。發(fā)明人基于此而完成了本發(fā)明。
發(fā)明內容本發(fā)明解決了
背景技術：
提到的現(xiàn)有技術方案中的不足之處，從乳糖水解反應的本質出發(fā)，提供了一種測定低乳糖牛奶中乳糖水解率的方法—葡萄糖氧化酶-分光光度法，其采用葡萄糖氧化酶—分光光度法測定牛奶中乳糖的水解率，可降低檢測成本，快速簡便地測定低乳糖牛奶的乳糖水解率。本發(fā)明的葡萄糖氧化酶-分光光度法的技術方案如下(a).測定低乳糖牛奶水解后的乳糖濃度；(b).測定低乳糖牛奶水解前的乳糖濃度；(c).具體操作步驟如下(a).測定低乳糖牛奶水解后的乳糖濃度先給乳糖水解牛奶中加入混合試劑沉淀蛋白制備樣品A；然后，吸取等體積的標準葡萄糖溶液和樣品A，例如各取20μL，加入到酶試劑與酚試劑混合組成的工作液中；在30℃-40℃下反應一段時間，優(yōu)選15-30分鐘；于500-520nm，優(yōu)選505nm的紫外可見分光光度計下測定其吸光度值，根據(jù)標準葡萄糖濃度，計算樣品的葡萄糖濃度，再根據(jù)該濃度計算出水解的乳糖的濃度；(b).測定低乳糖牛奶水解前的乳糖濃度；步驟(b)中，首先制備乳糖完全水解牛奶每升低乳糖牛奶中加入5000-10000NLU(NeutralLactaseUnits，即中性乳糖酶單位)的乳糖酶，在30℃-40℃的水浴中反應一段時間，優(yōu)選2-4小時，該量及反應時間確保低乳糖牛奶中未水解的乳糖完全水解——即乳糖水解率可達100％；然后，加入混合試劑，制備樣品B；再吸取等體積的標準葡萄糖溶液和樣品B，加入到酶試劑與酚試劑混合組成的工作液中；在30℃-40℃下反應一段時間，優(yōu)選15-30分鐘；于500-520nm，優(yōu)選505nm的紫外可見分光光度計下測定其吸光度值，根據(jù)標準葡萄糖濃度，計算樣品的葡萄糖濃度，再根據(jù)該濃度計算出水解前的乳糖的濃度；(c).計算乳糖水解率在上述方案中，所述的混合試劑為試劑carrez甲和carrez乙組成，czrrez甲由質量百分比濃度為1.5％-3.0％，優(yōu)選2.0％的K4Fe(CN)6·3H2O水溶液組成；carrez乙由質量百分比濃度為3.0％-6.0％，優(yōu)選4.0％的ZnSO4·7H2O水溶液組成，優(yōu)選地，所述的混合試劑為等體積的carrez甲和carrez乙組成。其中，在樣品A和樣品B的制備中，優(yōu)選地，還加入能將牛奶稀釋至10-100倍，例如20倍體積的蒸餾水，之后再振蕩后靜置一段時間，優(yōu)選10-20分鐘，然后過濾。其中，所用的工作液由酶試劑和酚試劑組成，優(yōu)選地，由等體積的酶試劑和等體積的酚試劑組成；酶試劑由≥10500U/L的葡萄糖氧化酶、≥8000U/L的過氧化物酶和≥0.1g/L4-氨基安替吡啉組成，酚試劑由≥0.5g/L的苯酚組成。其中，樣品中葡萄糖濃度為0-4.5g/L，隨著葡萄糖的增加，測定管的吸光度值與濃度呈線性相關，r2≥0.995。其中，樣品葡萄糖的濃度(g/L)為1為標準葡萄糖的濃度(g/L)；水解的乳糖濃度(g/L)為葡萄糖濃度(g/L)×2×(10-100)，其中2表示1個單位質量的乳糖可水解成2個單位質量的葡萄糖，10-100代表制備樣品A和B時所取原始牛奶的稀釋倍數(shù)，下同。其中，乳糖完全水解牛奶是通過下述方法制備的給低乳糖牛奶中再加入5000-10000NLU/L的乳糖酶，水解2-4小時，例如加入10000NLU/L的乳糖酶水解2小時，將未水解的乳糖完全水解；如果是奶粉，將奶粉還原后，再加入5000-10000NLU/L的乳糖酶，水解2-4小時，例如加入5000NLU/L的乳糖酶水解4小時，將未水解的乳糖完全水解。在本發(fā)明中，所述的低乳糖牛奶是指牛奶中添加乳糖酶，使牛奶中的乳糖部分水解，乳糖的水解率≥70％。一般牛奶中的乳糖水解率達到70％，就能解決乳糖不耐受癥(馬夫霞，2002)。與目前現(xiàn)有技術中的其他檢測方法相比，本發(fā)明的檢測方法速度快、費用低、準確度高，并且檢測成品低乳糖乳制品的水解率不需要對照樣品，所述的對照樣品為必須用沒加乳糖酶的相同批次的牛奶，并且本發(fā)明的方法尤其適于檢測成品中的乳糖水解率。具體實施例方式實施例1A.測定低乳糖液態(tài)奶乳糖水解量(1)制備樣品A取1ml乳糖水解牛奶加1mlcarrez試劑甲和1mlcarrez試劑乙沉淀蛋白，再加7ml蒸餾水稀釋到10倍，振蕩后靜置約10分鐘，然后過濾，過濾液稱為樣品A；(2)分別吸取20μL1g/L的葡萄糖標準溶液和20μL樣品A加入到酶試劑與酚試劑等體積混合的工作液中；(3)之后，將其置于30℃恒溫水浴中，反應30分鐘，在500nm波長處分別測定葡萄糖標準液和樣品的吸光度值，計算濾液中葡萄糖的濃度此葡萄糖的濃度就是水解了的乳糖釋放的葡萄糖的濃度，所以通過葡萄糖的濃度就可計算出水解的乳糖的濃度。(4)計算水解的乳糖濃度(g/L)＝葡萄糖濃度(g/L)×2×10。B.測定水解前液態(tài)奶中乳糖含量(1)制備乳糖完全水解牛奶在1000mL的乳糖水解牛奶中再加入5000個單位的乳糖酶，即最終濃度為5000NLU/L的乳糖酶，在30℃的水浴中放置4小時，確保乳糖水解牛奶中未水解的乳糖全部水解，即得乳糖完全水解牛奶；(2)制備樣品B取1mL乳糖完全水解牛奶加1mLcarrez試劑甲和1mLcarrez試劑乙沉淀蛋白，再加7mL蒸餾水稀釋到10倍，振蕩后靜置約10分鐘，然后過濾；(3)分別吸取20μL1g/L的葡萄糖標準溶液和20μL樣品B，加入到由等體積的酶試劑與酚試劑混合組成的工作液中；(4)然后，將其置于30℃恒溫水浴中，反應30分鐘，在500nm波長處分別測定葡萄糖標準液和樣品的吸光度值，然后計算濾液中葡萄糖的濃度此葡萄糖濃度就是乳糖完全水解后產(chǎn)生的葡萄糖的量，所以通過葡萄糖的濃度可推算出水解前牛奶中乳糖的濃度(5).計算水解前牛奶中乳糖濃度乳糖濃度(g/L)＝葡萄糖濃度(g/L)×2×10。C.計算乳糖水解率實施例2A.測定低乳糖液態(tài)奶乳糖水解量(1)制備樣品A取10ml乳糖水解牛奶加10mlcarrez試劑甲和10mlcarrez試劑乙沉淀蛋白，再加970ml蒸餾水稀釋到100倍，振蕩后靜置約20分鐘，然后過濾，過濾液稱為樣品A；(2)分別吸取50μL1g/L的葡萄糖標準溶液和50μL樣品A加入到由酶試劑與酚試劑等體積混合的工作液中；(3)之后，將其置于40℃恒溫水浴中，反應15分鐘，在520nm波長處分別測定葡萄糖標準液和樣品的吸光度值，計算濾液中葡萄糖的濃度此葡萄糖的濃度就是水解了的乳糖釋放的葡萄糖的濃度，所以通過葡萄糖的濃度就可計算出水解的乳糖的濃度。(4)計算水解的乳糖濃度(g/L)＝葡萄糖濃度(g/L)×2×100。B.測定水解前液態(tài)奶中乳糖含量(1)制備乳糖完全水解牛奶在1000mL的乳糖水解牛奶中再加入10000個單位的乳糖酶，即最終濃度為10000NLU/L的乳糖酶，在40℃的水浴中放置2小時，確保乳糖水解牛奶中未水解的乳糖全部水解，即得乳糖完全水解牛奶；(2)制備樣品B取10mL乳糖完全水解牛奶加10mLcarrez試劑甲和10mLcarrez試劑乙沉淀蛋白，再加970mL蒸餾水稀釋到100倍，振蕩后靜置約20分鐘，然后過濾；(3)分別吸取50μL1g/L的葡萄糖標準溶液和50μL樣品B，加入到由等體積的酶試劑與酚試劑混合組成的工作液中；(4)然后，將其置于40℃恒溫水浴中，反應15分鐘，在520nm波長處分別測定葡萄糖標準液和樣品的吸光度值，然后計算濾液中葡萄糖的濃度此葡萄糖濃度就是乳糖完全水解后產(chǎn)生的葡萄糖的量，所以通過葡萄糖的濃度可推算出水解前牛奶中乳糖的濃度(5).計算水解前牛奶中乳糖濃度乳糖濃度(g/L)＝葡萄糖濃度(g/L)×2×100。C.計算乳糖水解率實施例3A.低乳糖奶粉水解后乳糖水解量的測定(1)制備樣品A取10g奶粉定容到100mL的容量瓶，制成還原奶粉，然后取5mL還原奶粉加5mLcarrez試劑甲和5mLcarrez試劑乙沉淀蛋白，再加235mL蒸餾水稀釋到50倍，振蕩后靜置約15分鐘，然后過濾，過濾液即為樣品A；(2)分別吸取30μL1g/L的葡萄糖標準溶液和30μL樣品A加入到酶試劑與酚試劑等體積混合工作液中；(3)之后，將其置于35℃恒溫水浴中，反應20分鐘，在510nm波長處分別測定葡萄糖標準液和樣品的吸光度值，計算濾液中葡萄糖的濃度此葡萄糖的濃度就是還原奶粉中水解了的乳糖釋放的葡萄糖的濃度，所以通過葡萄糖的濃度就可計算出還原奶粉中水解的乳糖的濃度。(4)計算水解的乳糖濃度乳糖濃度(g/L)＝葡萄糖濃度(g/L)×2×50。B.測定水解前奶粉乳糖含量(1)制備乳糖完全水解奶粉取10g奶粉定容到100mL的容量瓶制成還原奶粉，然后加入750個單位的乳糖酶，即最終為7500NLU/L的乳糖酶，在35℃的水浴中放置3小時，確保乳糖水解奶粉中未水解的乳糖全部水解，即為乳糖完全水解奶粉；(2)制備樣品B取5mL乳糖完全水解牛奶加5mLcarrez試劑甲和5mLcarrez試劑乙沉淀蛋白，再加235mL蒸餾水稀釋到50倍，振蕩后靜置約15分鐘，然后過濾，過濾液即為樣品B；(3)分別吸取30μL1g/L的葡萄糖標準溶液和30μL樣品B，加入到酶試劑與酚試劑等體積混合的工作液中；(4)之后，將其置于35℃恒溫水浴中，反應20分鐘，在510nm波長處分別測定葡萄糖標準液和樣品的吸光度值，讓后計算濾液中葡萄糖的濃度此葡萄糖濃度就是還原奶粉中乳糖完全水解后產(chǎn)生的葡萄糖的量，所以通過葡萄糖的濃度可推算出還原奶粉水解前乳糖的含量。(5)計算水解前乳糖濃度乳糖濃度(g/L)＝葡萄糖濃度(g/L)×2×50。C.計算奶粉乳糖水解率試驗1葡萄糖氧化酶—分光光度法測定葡萄糖的回收率試驗對葡萄糖氧化酶—分光光度法測定葡萄糖含量的準確度進行試驗，分別取0.1018、0.1504、0.2021、0.2507、0.3016g葡萄糖加入到100mL牛奶中，按照本申請說明書中實施例1的方法處理樣品后測定葡萄糖的值，將所測結果在表1中列出表1葡萄糖氧化酶—分光光度法測定葡萄糖的回收率試驗結果<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="835">12345</table></tables>從表1可以看出，葡萄糖的回收率在97％-101％之間，從而表明本申請的方法測定的葡萄糖含量的準確度很高。試驗2葡萄糖氧化酶—分光光度法測定牛奶中乳糖水解率的精密度試驗對葡萄糖氧化酶—分光光度法測定牛奶中乳糖水解的精密度進行試驗，給牛奶中加入2000NLU/L的乳糖酶在37℃的條件下水解1小時，水解后在沸水中將乳糖酶滅活，按照本申請所述的實施例1或實施例2的方法處理樣品后測定乳糖水解前后的乳糖的量，所測結果如表2所示表2葡萄糖氧化酶—分光光度法測定牛奶中乳糖水解率的精密度試驗注標準管的吸光度值為0.250。從表2可看出，測定結果的變異系數(shù)分別為1.7％和2.1％，從而表明，本申請的方法測定的牛奶中乳糖水解率的精密度很好。本發(fā)明在本文中所述的和要求的不受本文公開的特定實施方案的限制，因為實施方案旨在闡述本發(fā)明的某些方面。任意同等的實施方案也包括在本發(fā)明內。實際上，除了本文中顯示的和描述的，對本領域技術人員而言，本發(fā)明對上述描述的各種改變都是顯而易見的。這些改變也落入附加權利要求的范圍內。權利要求1.一種低乳糖牛奶中乳糖水解率的測定方法，其特征在于，該方法包括(a).測定低乳糖牛奶水解后的乳糖濃度；(b).測定低乳糖牛奶水解前的乳糖濃度；(c).計算乳糖水解率其中，步驟(a)中，首先給乳糖水解牛奶中加入混合試劑沉淀蛋白制備樣品A；然后，吸取等體積的標準葡萄糖溶液和樣品A，加入到由酶試劑與酚試劑混合組成的工作液中；在30℃-40℃下反應一段時間；于500-520nm的紫外可見分光光度計下測定其吸光度值，根據(jù)標準葡萄糖濃度，計算樣品的葡萄糖濃度，再根據(jù)該濃度計算出水解的乳糖濃度；步驟(b)中，首先制備乳糖完全水解牛奶每升低乳糖牛奶中加入5000-10000NLU的乳糖酶，在30℃-40℃的水浴中反應一段時間，該量及反應時間確保低乳糖牛奶中未水解的乳糖完全水解；然后，加入混合試劑，制備樣品B；再吸取等體積的標準葡萄糖溶液和樣品B，加入到酶試劑與酚試劑混合組成的工作液中；在30℃-40℃下反應一段時間；于500-520nm的紫外可見分光光度計下測定其吸光度值，根據(jù)標準葡萄糖濃度，計算樣品的葡萄糖濃度，再根據(jù)該濃度計算出水解前的乳糖的濃度。2.根據(jù)權利要求1所述的測定方法，其特征在于，其中所述的混合試劑為試劑carrez甲和carrez乙組成，czrrez甲由質量百分比濃度為1.5-3.0％的K4Fe(CN)6·3H2O水溶液組成；carrez乙由質量百分比濃度為3.0％-6.0％的ZnSO4·7H2O水溶液組成。3.根據(jù)權利要求1或2的測定方法，其特征在于，其中在步驟(a)和(b)中，與工作液反應時間為15-30分鐘，在步驟(b)中，與乳糖酶反應時間為2-4小時，czrrez甲由質量百分比濃度為2.0％的K4Fe(CN)6·3H2O水溶液組成；carrez乙由質量百分比濃度為4.0％的ZnSO4·7H2O水溶液組成。4.根據(jù)權利要求3所述的測定方法，其特征在于，其中在樣品A和樣品B的制備中，在加入混合試劑后，還可加入能將牛奶稀釋至10-100倍體積的蒸餾水，之后再振蕩后靜置10-20分鐘，然后過濾。5.根據(jù)權利要求4所述的測定方法，其特征在于，其中標準葡萄糖溶液的濃度為1g/L，所述的混合試劑為等體積的carrez甲和carrez乙組成，其中吸光度值是在500-520nm的紫外可見分光光度計下測定。6.根據(jù)權利要求5所述的測定方法，其特征在于，其中所用的工作液由等體積的酶試劑和等體積的酚試劑組成。7.根據(jù)權利要求書6所述的測定方法，其特征在于，其中酶試劑由≥10500U/L的葡萄糖氧化酶、≥8000U/L的過氧化物酶和≥0.1g/L4-氨基安替吡啉組成，其中酚試劑由≥0.5g/L的苯酚組成。8.根據(jù)權利要求1所述的測定方法，其特征在于，其中樣品中葡萄糖濃度為數(shù)值為0-4.5g/L，隨著葡萄糖濃度的增加，測定管的吸光度值與濃度呈線性相關，r2≥0.995。9.根據(jù)權利要求1中所述的測定方法，其特征在于，其中水解的乳糖濃度(g/L)為葡萄糖濃度(g/L)×2×(10-100)。10.根據(jù)權利要求1或7所述的測定方法，其特征在于，其中乳糖完全水解牛奶是通過下述方法制備的給低乳糖牛奶中再加入5000-10000NLU/L的乳糖酶，將未水解的乳糖完全水解，如果是奶粉，將奶粉還原后，再加入5000-10000NLU/L的乳糖酶水解。全文摘要本申請公開了一種測定低乳糖牛奶中乳糖水解率的方法，更具體而言，涉及采用本申請所述的葡萄糖氧化酶－分光光度法測定低乳糖牛奶的乳糖水解率的方法；該方法包括(a)測定牛奶水解后的乳糖濃度；(b)測定牛奶水解前的乳糖濃度；(c)計算乳糖水解率，水解率=(水解后的乳糖濃度/水解前的乳糖濃度)×100%。本發(fā)明的檢測方法速度快、費用低、準確度高。文檔編號G06F19/00GK101034066SQ20071000714公開日2007年9月12日申請日期2007年2月3日優(yōu)先權日2007年2月3日發(fā)明者卜建斌,云戰(zhàn)友申請人:內蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司