專利名稱：Hplc微管法一次性測定白術內酯及蒼術酮的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及測定白術內酯及蒼術酮的方法，尤其是采用HPLC微管法一次性測定白術內酯及蒼術酮的方法。屬于中藥成份測定技術領域。
背景技術：
中藥白術為菊科植物白術(Rhizoma atractylodis macrocephala Koidz.)的干燥根莖《中華人民共和國藥典》，2005版，一部。是著名的傳統(tǒng)多用途常用中藥，為“浙八味”之一。其具健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之功效。國內多個省份有種植，浙江省是主產省份之一，我省年產量近5000噸，占全國總產量的近一半，年產值約5000萬元。國內外市場年需量約為8000噸，市場銷售額約為8000萬元。
在分離得到蒼術酮后，又已從白術中，分離出白術內酯類成分——白術內酯I、白術內酯III(黃寶山.白術內酯的分離鑒定.植物學報，1992，34(8)614.)，藥理學研究表明，白術內酯類成分(白術內酯I、白術內酯III)為白術的抗炎、抗癌有效成分，蒼術酮也具有調節(jié)胃腸道功能和促進營養(yǎng)物質吸收的作用(湯得芳，郝玉珩，劉佐雅，等.平江白術根莖揮發(fā)油的成分及其抑瘤作用研究.藥學通報，1984，19(9)43.)。目前對上述三種有效成分，有每個成分單獨的含量測定方法(陳仲良.中藥白術的化學成分.化學學報，1989，471022.)；(王燕生.白術成分的研究.陜西新醫(yī)藥，1980，(4)47.)。但單一成分的含量測定方法不足之處，在于需要兩個試驗條件，分兩次測定，不僅費時費力，而且加大了三成份內在比例的誤差。
鑒于《中華人民共和國藥典(2005年版，一部)》中尚無揮發(fā)油含量、蒼術酮及白術內酯含量的測定方法和標準，同一色譜條件一次性測定中藥白術中白術內酯III、白術內酯I及蒼術酮的方法未見報道。
故發(fā)明一項一次性同時測定三個有效成分的方法是急待解決的問題，有重要的學術價值及實際應用的意義。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種HPLC微管法一次性測定白術內酯及蒼術酮的方法，以實現(xiàn)一次性同時測定白術樣品中白術內酯III、白術內酯I及蒼術酮三成份。
本發(fā)明的HPLC微管法一次性測定白術內酯及蒼術酮的方法，包括以下步驟 (1)配制流動相 取色譜純甲醇、乙腈和重蒸水，按體積比配制流動相A、B溶液 流動相A溶液甲醇∶乙腈∶水＝90∶5∶5 流動相B溶液甲醇∶乙腈∶水＝55∶5∶40 (2)制備對照品溶液 精密稱取白術內酯I 5.8mg、白術內酯III 6mg、蒼術酮6.3mg，分別置入10ml量瓶內，加入甲醇至10ml刻度，搖勻，使對照品溶解；然后吸取白術內酯I 10μl、白術內酯III 10μl、蒼術酮溶液80μl，加入流動相B溶液900μl，混勻，得含0.0058mg/ml白術內酯I、0.006mg/ml白術內酯III、0.0504mg/ml蒼術酮的混合對照品溶液； (3)制備供試樣品溶液 精密稱取白術樣品0.3克～0.5克，置入25ml量瓶中，加入流動相B溶液20ml；將量瓶置于超聲震蕩儀內超聲30mim，放至室溫后，再加入流動相B溶液至25ml刻度，搖勻，經濾紙過濾，取濾液2ml用0.32μm濾膜過濾，待測試； (4)設置色譜條件 采用“帶梯度測試”的高效液相色譜儀，色譜柱l C18 5μm，150mm×1.0mm；設定檢測波長220nm；流動相的流速50μ/min； (5)設置梯度測試的參數(shù) 按下表設置梯度測試時的流動相A、B的參數(shù)及時間參數(shù)， (6)進樣測試 由高效液相色譜儀自動進樣器注入對照品溶液3μl/次，分別在三個不同時間獲得三個吸收峰； 由高效液相色譜儀自動進樣器注入供試樣品溶液3μl/次，分別與對照品相應時間獲得三個吸收峰； (7)計算內酯III、白術內酯I及蒼術酮三成分的含量 依據(jù)步驟(6)測得的內酯III、白術內酯I及蒼術酮的峰面積，按下列公式計算成g/100g生藥的含量。
本發(fā)明的有益效果在于 僅用同一色譜條件，一次進樣即可測定中藥白術中白術內酯III、白術內酯I及蒼術酮的含量，這樣不僅簡化了操作，可減少多次進樣的誤差，還有利于同時分析這三種成分的構成比。本發(fā)明具有重要的學術價值及實際應用的意義。
圖1是白術內酯III、I、蒼術酮的對照品圖譜； 圖2是HPLC微管法測定的江西安福白術樣品圖譜； 圖3是HPLC微管法測定的湖南邵東白術樣品圖譜；
具體實施例方式 以下結合實施例進一步說明本發(fā)明。
實施例1江西安福白術樣品三種成分的含量測定 (1)配制流動相 取色譜純甲醇、乙腈和重蒸水，按體積比配制流動相A、B溶液 流動相A溶液甲醇∶乙腈∶水＝90∶5∶5 流動相B溶液甲醇∶乙腈∶水＝55∶5∶40 (2)制備對照品溶液 于分析天平上精密稱取白術內酯I 5.8mg、白術內酯III 6mg、蒼術酮6.3mg，分別置入10ml量瓶內，加入甲醇至10ml刻度，搖勻，使對照品溶解；再吸取白術內酯I(0.58mg/ml)、白術內酯III(0.6mg/ml)各10μl、蒼術酮(0.63mg/ml)溶液80μl，加入流動相B液900μl，混勻，即得含白術內酯I(0.0058mg/ml)、白術內酯III(0.006mg/ml)、蒼術酮(0.0504mg/ml)的混合對照品溶液。
(3)制備供試樣品溶液 于分析天平上精密稱取江西安福白術樣品0.4038克，加入含有流動相B溶液20ml的25ml量瓶內；將量瓶置于超聲震蕩儀內超聲30mim，放至室溫后，再加入流動相B溶液至25ml刻度，搖勻，經普通濾紙過濾，取濾液2ml用0.32μm濾膜過濾，待測試。
(4)設置高效液相色譜儀測定的色譜條件 按相應操作規(guī)范連接好“帶梯度測試”的高效液相色譜儀，(本法采用Micro-Tech Ultra plus II高效液相色譜儀，微科技公司)；選用微管色譜柱C185μm，150mm×1.0mm；設定檢測波長220nm；流速50μl/min。
(5)設置梯度測試的參數(shù) 按下表設置梯度測試時的流動相A、B的參數(shù)及時間參數(shù) (6)進樣測試 由高效液相色譜儀自動進樣器注入對照品溶液3μl/次，分別在8、12、30min時獲得三個吸收峰，見圖1。
由高效液相色譜儀自動進樣器注入供試品溶液3μl/次，也分別在8、12、30min時與對照品相應時間獲得三個吸收峰，見圖2。
(7)計算內酯III、白術內酯I及蒼術酮三成分的含量 依據(jù)步驟(6)測得的白內酯III、白術內酯I及蒼術酮的峰面積，按下列公式計算成g/100g生藥的含量。
結果見下表 江西安福白術樣品中三成分的含量 實施例2湖南邵東白術樣品三種成分的含量測定 (1)配制流動相 取色譜純甲醇、乙腈和重蒸水，按體積比配制流動相A、B溶液 流動相A溶液甲醇∶乙腈∶水＝90∶5∶5 流動相B溶液甲醇∶乙腈∶水＝55∶5∶40 (2)制備對照品溶液 于分析天平上精密稱取白術內酯I5.8mg、白術內酯III6mg、蒼術酮6.3mg，分別置入10ml量瓶內，加入甲醇至10ml刻度，搖勻，使對照品溶解，再吸取白術內酯I(0.58mg/ml)、白術內酯III(0.6mg/ml)各10μl、蒼術酮(0.63mg/ml)溶液80μl，加流動相B液900μl，混勻即得含白術內酯I(0.0058mg/ml)、白術內酯III(0.006mg/ml)、蒼術酮(0.0504mg/ml)的混合對照品溶液。
(3)制備供試樣品溶液 于分析天平上精密稱取湖南邵東白術樣品0.4134g，加入含有流動相B溶液20ml的25ml量瓶內；將量瓶置于超聲震蕩儀內超聲30mim，放至室溫后，再加入流動相B溶液至25ml刻度，搖勻，經普通濾紙過濾，取濾液2ml用0.32μm濾膜過濾，待高效液相色譜儀測試。
(4)設置高效液相色譜儀測定的色譜條件 按相應操作規(guī)范連接好“帶梯度測試”的高效液相色譜儀，(本法采用Micro-Tech Ultra plus II高效液相色譜儀，微科技公司)；色譜柱C18 5μm，150mm×1.0mm；設定檢測波長220nm；流速50μl/min。
(5)設置梯度測試的參數(shù) 按下表設置梯度測試時的流動相A、B的參數(shù)及時間參數(shù) (6)進樣測試 由高效液相色譜儀自動進樣器注入對照品溶液3μl/次，分別在8、12、30min三個不同時間獲得三個吸收峰，見圖1。
由高效液相色譜儀自動進樣器注入供試品溶液3μl/次，分別與對照品相應時間獲得三個吸收峰，見圖4。
(7)計算內酯III、白術內酯I及蒼術酮三成分的含量依據(jù)步驟(6)測得的白內酯III、白術內酯I及蒼術酮的峰面積，按下列公式計算成g/100g生藥的含量。
結果見下表 湖南邵東白術樣品三種成分的含量測定
權利要求
1.HPLC微管法一次性測定白術內酯及蒼術酮的方法，包括以下步驟
(1)配制流動相
取色譜純甲醇、乙腈和重蒸水，按體積比配制流動相A、B溶液
流動相A溶液甲醇∶乙腈∶水＝90∶5∶5
流動相B溶液甲醇∶乙腈∶水＝55∶5∶40
(2)制備對照品溶液
精密稱取白術內酯I 5.8mg、白術內酯III 6mg、蒼術酮6.3mg，分別置入10ml量瓶內，加入甲醇至10ml刻度，搖勻，使對照品溶解；然后吸取白術內酯I 10μl、白術內酯III 10μl、蒼術酮溶液80μl，加入流動相B溶液900μl，混勻，得含0.0058mg/ml白術內酯I、0.006mg/ml白術內酯III、0.0504mg/ml蒼術酮的混合對照品溶液；
(3)制備供試樣品溶液
精密稱取白術樣品0.3克～0.5克，置入25ml量瓶中，加入流動相B溶液20ml；將量瓶置于超聲震蕩儀內超聲30mim，放至室溫后，再加入流動相B溶液至25ml刻度，搖勻，經濾紙過濾，取濾液2ml用0.32μm濾膜過濾，待測試；
(4)設置色譜條件
采用“帶梯度測試”的高效液相色譜儀，色譜柱1 C18 5μm，150mm×1.0mm；設定檢測波長220nm；流動相的流速50μl/min；
(5)設置梯度測試的參數(shù)
按下表設置梯度測試時的流動相A、B的參數(shù)及時間參數(shù)，
(6)進樣測試
由高效液相色譜儀自動進樣器注入對照品溶液3μl/次，分別在三個不同時間獲得三個吸收峰；
由高效液相色譜儀自動進樣器注入供試樣品溶液3μl/次，分別與對照品相應時間獲得三個吸收峰；
(7)計算內酯III、白術內酯I及蒼術酮三成分的含量
依據(jù)步驟(6)測得的內酯III、白術內酯I及蒼術酮的峰面積，按下列公式計算成g/100g生藥的含量。
全文摘要
本發(fā)明公開的一次性測定白術內酯及蒼術酮的方法，其步驟包括取色譜純甲醇、乙腈和重蒸水，配制流動相A、B溶液；制備含白術內酯I、白術內酯III、蒼術酮的混合對照品溶液；制備供試樣品溶液；利用液相色譜儀按設置的流動相A、B梯度及時間，分別測試對照品溶液在三個不同時間的三個吸收峰以及供試樣品與對照品相應時間的三個吸收峰，按式X＝(供試品的峰面積×對照品的濃度/對照品的峰面積×供試品的濃度)×100％，計算內酯III、白術內酯I及蒼術酮三成分的含量。本發(fā)明一次進樣即可測定白術中白術內酯III、白術內酯I及蒼術酮的含量，不僅簡化操作，可減少多次進樣的誤差，還有利于同時分析這三種成分的構成比。具有重要的學術價值及實際應用意義。
文檔編號G06F19/00GK101113975SQ20071007078
公開日2008年1月30日 申請日期2007年8月14日 優(yōu)先權日2007年8月14日
發(fā)明者戴詩文, 章建民, 旦 壽 申請人:浙江省中醫(yī)藥研究院