專利名稱：臨床治療用臍帶胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備儲存和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于臨床治療用的臍帶胎盤干細(xì)胞，及其制備，儲存和應(yīng)用。具體地說是涉及一種不 同于一般細(xì)胞庫的方法，而是旨在臨床治療用的臍帶和胎盤的干細(xì)胞，庫，和其制備與儲存。
背景
由于干細(xì)胞對多種疾病潛在的臨床治療作用，干細(xì)胞己被在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)試驗(yàn)方法上進(jìn)行了廣泛的研究。 然而由于其基礎(chǔ)研宄的特性和向臨床應(yīng)用的過度方式的特質(zhì)，使這些研究在臨床治療用干細(xì)胞的制備，儲
存和應(yīng)用方面有所欠缺。并為所儲存的干細(xì)胞被病原體的污染，和所儲存的不同個體干細(xì)胞之間的交互污 染留下隱患。從而為這些干細(xì)胞的臨床應(yīng)用埋下潛在危險(xiǎn)，使這些干細(xì)胞喪失臨床應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明公開 用于臨床治療所用的安全的臍帶，胎盤干細(xì)胞，和庫，以及這些干細(xì)胞的制備，儲存和應(yīng)用的方法。
背景技術(shù)：
近年來有關(guān)干細(xì)胞的研究日益深化，新的發(fā)現(xiàn)已使干細(xì)胞在人類與疾病斗爭中又增添了全新的武器。 目前，新的干細(xì)胞多向性分化(plasticity)的發(fā)現(xiàn)是可以將來源于不同組織的干細(xì)胞用于器官、組織疾 病的治療，例如比較容易獲得的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞己被廣泛應(yīng)用于不同疾病治療的研究，比較明 顯的結(jié)果是有關(guān)心血管疾病、神經(jīng)損傷、代謝疾病的研究。胎盤及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC臍帶，胎盤的干細(xì)胞)在疾病治療中的作用已在動物實(shí)驗(yàn)和人類疾病的治療中取得進(jìn)展和證實(shí)。 這些疾病包括Alzheimer病(癡呆癥)、脊髓損傷、中風(fēng)、燒傷、心臟病、糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎等。
早期的間充質(zhì)干細(xì)胞的研究立足于對這些細(xì)胞的生物特性和功能的研究。其后的一些細(xì)胞庫的研宄則 處于這些研究結(jié)果過度之中。由于其基礎(chǔ)研究的特性和向臨床應(yīng)用的過度方式的特質(zhì)，使這些研究在臨床 治療用干細(xì)胞的制備儲存和應(yīng)用方面有所欠缺。主要表現(xiàn)為
1 正常分娩時(shí)由于胎盤臍帶經(jīng)由有菌的陰道娩出。許多正常分娩的臍帶不能得到很好地處理，從而
使這些臍帶不能用于干細(xì)胞的儲存。
2 由于有些臍帶被病原體污染，所獲的一些臍帶在培養(yǎng)過程中，細(xì)菌，霉菌等繁殖，造成對其它細(xì)
胞和其他個體儲存物的污染。
3 更為嚴(yán)重的是由于目前一般儲存中多采用在液氮中浸泡法儲存，這樣就會使被儲存的細(xì)胞之間經(jīng)
由液氮液相的交互污染的危險(xiǎn)機(jī)會增加。
4 在使用有蓋的塑料儲存管時(shí)，由管蓋口泄露也對其他標(biāo)本交互污染的機(jī)會大大增加。
以上由于正常分娩的帶菌性大大限制了這些個體的臍帶，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的可儲存性，甚至這些儲 存被僅限于刨腹產(chǎn)者。更為嚴(yán)重的是諸項(xiàng)中的細(xì)菌，霉菌，液相交互污染，和儲存物從管口外泄導(dǎo)致的交 互污染都會對將來的臨床治療的應(yīng)用造成巨大的問題。并為所儲存的干細(xì)胞被病原體的污染，和所儲存的 不同個體干細(xì)胞之間的細(xì)胞，DNA， RNA等的交互污染留下隱患。從而為這些干細(xì)胞的臨床應(yīng)用埋下潛 在危險(xiǎn)，使這些干細(xì)胞喪失臨床應(yīng)用價(jià)值。因而目前這些問題是為保證干細(xì)胞臨床治療安全性；和使廣大 正常陰道分娩孕婦的干細(xì)胞也可得到應(yīng)用所需亟待解決的問題。
本發(fā)明的目的就是在于克服以上問題，提供用于臨床治療所用臍帶，胎盤干細(xì)胞，庫和這些細(xì)胞的制 備和儲存，為臨床干細(xì)胞的治療在安全上提供保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明內(nèi)容的技術(shù)方案步驟如下1) 正常陰道分娩胎盤，臍帶的去污染處理，a) 用無菌生理鹽水沖洗胎盤和臍帶去除肉眼可見的污物和殘留血液。b) 用2%醫(yī)用碘酒和75%醫(yī)用酒精，或其它中高強(qiáng)度消毒劑對臍帶，胎盤表面處理。c) 根據(jù)情況以手工分離，或?qū)Ｓ脙x器去除0.5 mm左右的臍帶胎盤外表面。去除過程中外表面不接 觸無菌的內(nèi)側(cè)組織。(圖一)d) 以上方法確保包括待處理的胎盤，臍帶組織的無菌，和干細(xì)胞的最好回收率，并為后期工作減少 需處理的組織量和消化酶的使用量。e) 所儲存?zhèn)€體常規(guī)進(jìn)行組織配型(HLA)，生物學(xué)，病源微生物檢測。同時(shí)建立臨床用臍帶，胎盤間 充質(zhì)干細(xì)胞庫的數(shù)據(jù)庫，制備與所儲存者的各類細(xì)胞，個人資料數(shù)據(jù)庫，和各項(xiàng)報(bào)告相一致的數(shù) 據(jù)卡和條形碼。2) 間充質(zhì)干細(xì)胞的制備和培養(yǎng)。a) 使用無菌手動，或自動方法處理臍帶或胎盤組織至小于1 mm大小b) 進(jìn)-步可使用無菌組織研磨設(shè)施處理組織至更小的顆粒c) 室溫離心250g5分鐘，棄去上清，收集細(xì)胞，用DMEM清洗。再次離心和清洗。d) 常規(guī)膠原酶，胰蛋白酶處理組織。e) 常規(guī)收集儲存第一代和培養(yǎng)后收集第二，三代間充質(zhì)干細(xì)胞。f) 培養(yǎng)采用Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, Gibco, USA), 10%自身血清或正常人AB血 清，1。/。glutamine (Gibco， USA)及無血清培養(yǎng)液3) 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的安全儲存。a) 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以無菌的方式根據(jù)需要收集在無菌的2或5ml細(xì)胞儲存管屮。Corning 2mL Vial (430661)， Corning 5mL Vial, (430663),或冷凍袋'E叩endorf等低溫冷凍管中。b) 含有干細(xì)胞的儲存管加密封蓋。c) 加蓋后的細(xì)胞儲存管進(jìn)一步用高質(zhì)量聚酯膜，EVO共聚物膜，Teflon FEP film或其它適用于 -210攝氏度的雙層膜覆蓋并用抽空密封法封存各管。每一儲存者擁有各自的密封的儲存系統(tǒng)。該 各自系統(tǒng)含有與計(jì)算機(jī)，紙文件檔案相一致的封存的條形碼和儲存者的信息(圖二)。 在使用冷 凍袋時(shí)，同樣處理。這些個體干細(xì)胞儲存系統(tǒng)儲存于蒸汽液氮罐的汽相部分。d) 為安全和臨床實(shí)際需要，備查管分二級保管和待查。 一份存于-80度冰箱，另一份存于C項(xiàng)描 述的密封存儲系統(tǒng)。(圖二)e) 所有經(jīng)以上方法處理的細(xì)胞儲存在MVE攝氏-190度高效能蒸汽液氮罐Vapor (MVE 815P-190, MVE 1536P-190, MVE 1879P-190)的汽相中，或其它廠家的攝氏-190度的蒸汽式液氮儲存罐的汽 相中。經(jīng)以上方法處理的干細(xì)胞，及其干細(xì)胞庫和儲存方法可以避免由于液相浸泡所導(dǎo)致的細(xì)菌，霉菌等病 原體，其他人的細(xì)胞，DNA， RNA等的交互污染。也可避免因所用管蓋泄漏引起的對其他儲存者干細(xì)胞 的污染，使儲存的干細(xì)胞的安全性和將來的臨床應(yīng)用得以保證。同時(shí)大f節(jié)省儲存空間。進(jìn)而降低成本。圖例說明(圖一)以手工分離，或?qū)Ｓ脙x器去除0.5 mm左右的臍帶胎盤外表面。去除過程中外表面不接觸無 菌的內(nèi)側(cè)組織。(圖二)以儲存管為例的安全儲存干細(xì)胞的個人儲存系統(tǒng)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:正常陰道分娩胎盤，臍帶的去污染處理。用無菌生理鹽水沖洗胎盤和臍帶去除肉眼可見的污物和殘留 血液。用2%醫(yī)用碘酒30秒，后75%醫(yī)用酒精脫碘。以手工分離0.5 mm左右的臍帶胎盤外表面。去除過程中外表面不接觸無菌的內(nèi)側(cè)組織。所儲存?zhèn)€體常規(guī)進(jìn)行組織配型(HLA)，生物學(xué)，病源微生物檢測。 同時(shí)建立臨床用臍帶，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞庫的數(shù)據(jù)庫，制備與所儲存者的各類細(xì)胞，個人資料數(shù)據(jù)庫，和 各項(xiàng)報(bào)告相一致的數(shù)據(jù)卡和條形碼。間充質(zhì)干細(xì)胞的制備和培養(yǎng)。使用無菌手動，或自動方法處理臍帶或胎盤組織至小于1 mm大小。室溫離心250g5分鐘，棄去上清， 收集細(xì)胞，用DMEM清洗。再次離心和清洗。常規(guī)膠原酶，胰蛋白酶處理組織。常規(guī)收集儲存第一代和 培養(yǎng)后收集第二，三代間充質(zhì)干細(xì)胞。培養(yǎng)采用Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM， Gibco， USA),川％自身血清培養(yǎng)液。擠帶間充質(zhì)干細(xì)胞以無菌的方式根據(jù)需要收集在無菌的5ml細(xì)胞儲存管中。Coming 5mL管， (430663),中，2ml的作為待査管。含有干細(xì)胞的儲存管加密封蓋。加蓋后的細(xì)胞儲存管進(jìn)一步用高質(zhì)量聚 酯膜，雙層膜覆蓋并用抽空密封法封存各管。每一儲存者擁有各自的密封的儲存系統(tǒng)。該各自系統(tǒng)含有與 計(jì)算機(jī)，紙文件檔案相一致的封存的條形碼和儲存者的信息。這些個體干細(xì)胞儲存系統(tǒng)儲存于MVE攝氏 -190度高效能蒸汽液氮罐Vapor (MVE 815P-190, MVE 1536P-190, MVE 1879P-190)的汽相中。為安全和 臨床實(shí)際需要，備查管分二級保管和待查。 一份存于-80度冰箱，另一份存于上項(xiàng)描述的密封存儲系統(tǒng)。實(shí)施例2:正常陰道分娩胎盤，臍帶的去污染處理。用無菌生理鹽水沖洗胎盤和臍帶去除肉眼可見的污物和殘留 血液。用2%醫(yī)用碘酒和75%醫(yī)用酒精，臍帶胎盤表面處理。根據(jù)情況以手工和專用儀器去除0.5 mm左 右的臍帶胎盤外表面。去除過程中外表面不接觸無菌的內(nèi)側(cè)組織。所儲存?zhèn)€體常規(guī)進(jìn)行組織配型(HLAJ. 生物學(xué)，病源微生物檢測。同時(shí)建立臨床用臍帶J臺盤間充質(zhì)干細(xì)胞庫的數(shù)據(jù)庫，制備與所儲存者的各類 細(xì)胞，個人資料數(shù)據(jù)庫，和各項(xiàng)報(bào)告相一致的數(shù)據(jù)卡和條形碼。間充質(zhì)干細(xì)胞的制備和培養(yǎng)。使自動方 法處理臍帶或胎盤組織至小于1 mm大小。進(jìn)一步使用無菌組織研磨設(shè)施處理組織至更小的顆粒。室溫 離心250g5分鐘，棄去上清，收集細(xì)胞，用DMEM清洗。再次離心和清洗。常規(guī)膠原酶，胰蛋白酶處 理組織。常規(guī)收集儲存第一代和培養(yǎng)后收集第二，三代間充質(zhì)干細(xì)胞。培養(yǎng)采用Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM， Gibco， USA), 無血清培養(yǎng)液。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的安全儲存于冷凍袋,進(jìn)一步用Teflon FEP film膜覆蓋并用抽空密封法封存各袋。 每一儲存者擁有各自的密封的儲存系統(tǒng)。該各自系統(tǒng)含有與計(jì)算機(jī)，紙文件檔案相一致的封存的條形碼和 儲存者的信息。這些個體干細(xì)胞儲存系統(tǒng)儲存于蒸汽液氮罐的汽相部分。為安全和臨床實(shí)際需要，備査管 分二級保管和待査。 一份存于-80度冰箱，另一份存于上項(xiàng)描述的密封存儲系統(tǒng)。所有經(jīng)以上方法處理的 細(xì)胞儲存在MVE攝氏-190度高效能蒸汽液氮罐V鄰or (MVE815P-190, MVE 1536P-190'MVE 1879P-190) 的汽相中。實(shí)施例3:用帶有青霉素，鏈霉素的無菌生理鹽水沖洗胎盤和臍帶去除殘留血液。用醫(yī)用H202快速處理胎盤， 臍帶表面。根據(jù)情況以手工分離，或?qū)Ｓ脙x器去除0.5 mm左右的臍帶胎盤外表面。去除過程中外表面不 接觸無菌的內(nèi)側(cè)組織。所儲存?zhèn)€體常規(guī)進(jìn)行組織配型(HLA),生物學(xué)，病源微生物檢測。同時(shí)建立臨床 用臍帶，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞庫的數(shù)據(jù)庫，制備與所儲存者的各類細(xì)胞，個人資料數(shù)據(jù)庫，和各項(xiàng)報(bào)告相一致 的數(shù)據(jù)卡和條形碼。使用無菌手動，或自動方法處理臍帶或胎盤組織至小于lmm大小。進(jìn)一步可使用無菌組織研磨設(shè)施 處理組織至更小的顆粒。室溫離心250g5分鐘，棄去上清，收集細(xì)胞，用帶青霉素，鏈霉素DMEM清洗。 再次離心和清洗。常規(guī)膠原酶，胰蛋白酶處理組織。常規(guī)收集儲存第一代和培養(yǎng)后收集第二，三代間充質(zhì) 干細(xì)胞。培養(yǎng)采用Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, Gibco， USA), 正常人AB血清'1% glutamine (Gibco, USA)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以無菌的方式根據(jù)需要收集在無菌低溫冷凍管中。含有干細(xì)胞的儲存管加密封蓋。加蓋后的細(xì)胞儲存管進(jìn)一步用高質(zhì)量聚酯膜，EVO共聚物膜，Teflon FEP film或其它 適用于-210攝氏度的雙層膜覆蓋并用抽空密封法封存各管。每一儲存者擁有各自的密封的儲存系統(tǒng)。該 各自系統(tǒng)含有與計(jì)算機(jī)，紙文件檔案相一致的封存的條形碼和儲存者的信息。這些個體干細(xì)胞儲存系統(tǒng) 儲存于蒸汽液氮罐的汽相部分。為安全和臨床實(shí)際需要，備査管分二級保管和待査。 一份存于-80度冰箱， 另一份存于密封存儲系統(tǒng)。所有經(jīng)以上方法處理的細(xì)胞儲存在MVE攝氏-190度高效能蒸汽液氮罐Vapor (MVE815P-190, MVE 1536P-190, MVE 1879P-190)的汽相中，或其它廠家的攝氏-190度的蒸汽式液氮儲 存罐的汽相中。經(jīng)以上方法處理的干細(xì)胞，及其干細(xì)胞庫和儲存方法可以避免由于液相浸泡所導(dǎo)致的細(xì)菌，霉菌等病 原體，其他人的細(xì)胞，DNA， RNA等的交互污染。也可避免因所用管蓋泄漏引起的對其他儲存者干細(xì)胞 的污染，使儲存的干細(xì)胞的安全性和將來的臨床應(yīng)用得以保證。同時(shí)大量節(jié)省儲存空間。進(jìn)而降低成本。
權(quán)利要求
1干細(xì)胞制備時(shí)正常陰道分娩胎盤，臍帶的去污染處理。a)用無菌生理鹽水沖洗胎盤和臍帶去除肉眼可見的污物和殘留血液。b)用2％醫(yī)用碘酒和75％醫(yī)用酒精，或其它中高強(qiáng)度消毒劑對臍帶，胎盤表面處理。c)根據(jù)情況以手工分離，或?qū)Ｓ脙x器去除0.5mm左右的臍帶胎盤外表面。去除過程中外表面不接觸無菌的內(nèi)側(cè)組織。(圖一)d)以上方法確保包括待處理的胎盤，臍帶組織的無菌，和干細(xì)胞的最好回收率，并為后期工作減少需處理的組織量和消化酶的使用量。e)所儲存?zhèn)€體常規(guī)進(jìn)行組織配型(HLA)，生物學(xué)，病源微生物檢測。同時(shí)建立臨床用臍帶，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞庫的數(shù)據(jù)庫，制備與所儲存者的各類細(xì)胞，個人資料數(shù)據(jù)庫，和各項(xiàng)報(bào)告相一致的數(shù)據(jù)卡和條形碼。
2 根據(jù)權(quán)利要求1)，間充質(zhì)干細(xì)胞的制備和培養(yǎng)。a) 使用無菌手動，或自動方法處理臍帶或胎盤組織至小于lmm大小b) 進(jìn)一步可使用無菌組織研磨設(shè)施處理組織至更小的顆粒c) 室溫離心250g5分鐘，棄去上清，收集細(xì)胞，用DMEM清洗。再次離心和清洗。d) 常規(guī)膠原酶，胰蛋白酶處理組織。e) 常規(guī)收集儲存第一代和培養(yǎng)后收集第二，三代間充質(zhì)干細(xì)胞。f) 培養(yǎng)采用Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM， Gibco， USA), 10%自身血清或正常人AB血 清，1% glutamine (Gibco， USA)及無血清培養(yǎng)液
3 根據(jù)權(quán)利要求l)， 2),臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的安全儲存。a) 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以無菌的方式根據(jù)需要收集在無菌的2或5ml細(xì)胞儲存管中。Coming 2mL Vial (430661)， Corning 5mL Vial, (430663),或冷凍袋，Eppendorf等低溫冷凍管中。b) 含有干細(xì)胞的儲存管加密封蓋。c) 加蓋后的細(xì)胞儲存管進(jìn)一步用高質(zhì)量聚酯膜，EVO共聚物膜，Teflon FEP film或其它適用于 -210攝氏度的雙層膜覆蓋并用抽空密封法封存各管。每一儲存者擁有各自的密封的儲存系統(tǒng)。該 各自系統(tǒng)含有與計(jì)算機(jī)，紙文件檔案相一致的封存的條形碼和儲存者的信息(圖二)。 在使用冷 凍袋時(shí)，同樣處理。這些個體干細(xì)胞儲存系統(tǒng)儲存于蒸汽液氮罐的汽相部分。d) 為安全和臨床實(shí)際需要，備査管分二級保管和待査。 一份存于-80度冰箱，另一份存于C項(xiàng)描 述的密封存儲系統(tǒng)。(圖二)e) 所有經(jīng)以上方法處理的細(xì)胞儲存在MVE攝氏-190度高效能蒸汽液氮罐Vapor (MVE 815P-190, MVE 1536P-190, MVE 1879P-190)的汽相中，或其它廠家的攝氏-190度的蒸汽式液氮儲存罐的汽 相中。
4 根據(jù)權(quán)利要求1)，對于正常由陰道分娩的臍帶，胎盤的去污染處理包括消毒劑的使用和被污染組織的 無菌清除，清除部分為外層0.5mm ±。
5 根據(jù)權(quán)利要求2),臍帶，胎盤干細(xì)胞培養(yǎng)是在DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行。用10%自體血清，AB血清或無血清培養(yǎng)。收集的細(xì)胞包括第一代，和培養(yǎng)之后的二，三代。
6 根據(jù)權(quán)利要求3)，安全的細(xì)胞儲存包括一個密閉的個體儲存系統(tǒng)和這一系統(tǒng)的-190度的汽相保存及信 息統(tǒng)一系統(tǒng)。這一個體儲存系統(tǒng)包括密閉的細(xì)胞儲存管，袋，信息卡，二級待査管。
7 根據(jù)權(quán)利要求1-3)這一制備，儲存系統(tǒng)也可用于臍帶間充質(zhì)之外的其他細(xì)胞，包括臍帶血干細(xì)胞的制 備和儲存。
8 根據(jù)卜6)，這一專利包括經(jīng)以上方法處理的干細(xì)胞的無菌方法，庫，和制備。及其干細(xì)胞庫和儲存方 法可以避免由于液相浸泡所導(dǎo)致的細(xì)菌，霉菌等病原體，其他人的細(xì)胞，DNA, RNA等的交互污染。 也可避免因所用管蓋泄漏引起的對其他儲存者干細(xì)胞的污染，使儲存的干細(xì)胞的安全性和將來的臨床 應(yīng)用得以保證。同時(shí)大量節(jié)省儲存空間。進(jìn)而降低成本。及所致的干細(xì)胞的安全臨床應(yīng)用。
全文摘要
本方法公開一種用于臨床治療用的干細(xì)胞的制備，儲存和應(yīng)用。本發(fā)明的構(gòu)建包括1)胎盤臍帶去污染處理a)用醫(yī)用碘酒和酒精或其它消毒劑對臍帶，胎盤表面的處理。b)手工或儀器去除臍帶胎盤外表面。c)胎盤臍帶組織的無菌和無干細(xì)胞的損失。2)間充質(zhì)干細(xì)胞的制備和培養(yǎng)(無菌)a)無菌手動或自動方法處理組織。b)無菌研磨組織至最小顆粒。c)酶處理2b項(xiàng)中制備的組織。d)清洗離心分離和收集細(xì)胞。e)培養(yǎng)細(xì)胞。3)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的安全儲存a)無菌方式收集細(xì)胞在儲存管或袋中。b)儲存管加密封蓋。c)用高質(zhì)量塑料膜雙層覆蓋并用抽空法封閉各管。d)儲存在蒸汽式液氮儲存罐的液相中，或制備安全注射液等。
文檔編號G06F7/00GK101298606SQ20081005228
公開日2008年11月5日 申請日期2008年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月14日
發(fā)明者王福生 申請人:天津環(huán)宇商橋商務(wù)信息咨詢有限公司