專利名稱：核酸擴(kuò)增判定方法以及核酸擴(kuò)增判定裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增判定方法、核酸擴(kuò)增判定系統(tǒng)、核酸擴(kuò)增判定裝置、能在計(jì)算機(jī)上執(zhí)行上述判定方法的計(jì)算機(jī)程序以及存儲(chǔ)該程序的電子介質(zhì)。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，作為檢測(cè)基因多態(tài)性及突變等的方法，廣泛采用解析由靶核酸和探針形成的雙鏈核酸的熔解曲線的方法(熔解曲線解析方法)。根據(jù)上述熔解曲線解析方法，通過(guò)對(duì)上述熔解
曲線解析上述雙鏈的熔解溫度(Tm: melting temperature)處有無(wú)峰，能夠判斷基因的多態(tài)性(基因型)以及檢測(cè)有無(wú)突變。
通常Tm如下進(jìn)行定義。持續(xù)力p熱含雙鏈核酸的溶液，260nm處吸光度將上升。其原因是雙鏈核酸中的雙鏈間的氬鍵由于加熱而解開，解離成單鏈核酸(雙鏈核酸的熔解)。并且，全部雙鏈核酸解離成單鏈核酸時(shí)，其吸光度顯示為加熱開始時(shí)的吸光度(只有雙鏈核酸時(shí)的吸光度)的大約1.5倍左右，由此可判斷熔解完成?；诖朔N現(xiàn)象，熔解溫度Tm ( 。C )通常被定義為吸光度到達(dá)吸光度總上升量的50 %時(shí)的溫度。
利用雙鏈核酸的這種特性，例如，可如下所述4企測(cè)革巴位點(diǎn)的多態(tài)性及突變。即，用與包含突變型靶位點(diǎn)的耙核酸序列互補(bǔ)的突變型檢測(cè)用探針，使分析對(duì)象的單鏈核酸與上述探針形成雙鏈核酸，對(duì)形成的雙鏈核酸實(shí)施加熱處理，通過(guò)測(cè)定吸光度等信號(hào)來(lái)檢測(cè)伴隨溫度上升的雙鏈的解離，基于該檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)Tm值處的上述信號(hào)的行為來(lái)判斷靶位點(diǎn)有無(wú)突變的方法(參見非專利文獻(xiàn)l、專利文獻(xiàn)l)。雙鏈核酸的同源性越高，則
7Tm值越高，同源性越低則Tm值越低。因而，可事先分別對(duì)由 包含突變型靶位點(diǎn)的耙核酸序列以及與其100%互補(bǔ)的突變型 4企測(cè)用探針構(gòu)成的雙鏈DNA、以及由上述靶位點(diǎn)為野生型的核 酸序列與上述突變型檢測(cè)用探針構(gòu)成的雙鏈DNA,求出作為評(píng) 價(jià)基準(zhǔn)的Tm值。如上所述，由于同源性越高Tm值也越高，因 此前者即靶位點(diǎn)為突變型時(shí)的Tm值(以下也稱為"Tmm值")相 對(duì)較高，后者即靶位點(diǎn)為野生型時(shí)的Tm值(以下也稱為"Tmw 值")相對(duì)較低。然后制作出由分析對(duì)象的單鏈核酸與上述突變 型檢測(cè)用探針形成的雙鏈核酸的熔解曲線，確認(rèn)在預(yù)先求得的 Tmm值和TmJ直中哪個(gè)值處存在信號(hào)峰。其結(jié)果，在Tmm值附近 存在峰的情況下，由于與上述突變型檢測(cè)用探針100%匹配，因 此可判斷分析對(duì)象的單鏈核酸為突變型的多態(tài)性。另 一方面， 在T m w值附近存在峰的情況下，由于上述突變型檢測(cè)用探針有1 個(gè)堿基錯(cuò)配，因此可判斷分析對(duì)象的單鏈核酸為野生型的多態(tài) 性。此外，還可判斷多態(tài)性是純合型還是雜合型。即，分析一 對(duì)等位基因時(shí)，當(dāng)Tmm值附近和Tmw值附近雙方均存在峰時(shí)可 判斷為雜合型，另一方面，當(dāng)僅在Tmm值附近存在峰時(shí)可判斷 為突變型的純合型，當(dāng)僅在T m w值附近存在峰時(shí)可判斷為野生 型的純合型。
在進(jìn)行這種熔解曲線解析時(shí)，通常對(duì)含RNA、 DNA的樣品 進(jìn)行上述靶核酸序列的擴(kuò)增處理，對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，使其與 如上所述的探針形成雙鏈并加熱進(jìn)行解離。然而，擴(kuò)增處理中， 無(wú)法充分?jǐn)U增上述靶核酸序列時(shí)，將出現(xiàn)誤判斷多態(tài)性的問(wèn)題。 因此在現(xiàn)有方法中，對(duì)上述擴(kuò)增處理后的樣品，制作示出各溫 度與表示上述各溫度下的樣品熔解狀態(tài)的信號(hào)值或信號(hào)值的微 分值(以下稱為"信號(hào)微分值")的關(guān)系的熔解曲線圖，目視判 斷上述靶核酸序列的Tmm值或Tmw值附近是否存在峰。但是在這種基因解析的判斷中必須具備專業(yè)知識(shí)，例如難以很簡(jiǎn)單地 判斷出是否存在峰。此外，目視判斷時(shí)，判斷基準(zhǔn)存在個(gè)體差 異，這也是一個(gè)問(wèn)題。因此，在現(xiàn)有的方法中，即使對(duì)沒有正 常進(jìn)行核酸擴(kuò)增的樣品也 一 直進(jìn)行到最終的熔解曲線解析，存 在費(fèi)力的問(wèn)題。此外，由于這種原因，導(dǎo)致在一般的分析和診 斷現(xiàn)場(chǎng)利用熔解曲線解析進(jìn)行基因分析、基因診斷的用途難以 推廣。此外，由于其專業(yè)性等， 一次性分析多個(gè)受試體也是相 當(dāng)困難的。
非專利文獻(xiàn)l:夕卩-力A-少；、^卜卩一 ，2000年，第46 號(hào)，第5號(hào)，p631-635;
專利文獻(xiàn)l:日本特開2005-58107號(hào)公才艮

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種擴(kuò)增判定方法，其能夠?qū)?經(jīng)核酸擴(kuò)增處理后的樣品判斷目標(biāo)核酸是否被擴(kuò)增。此外，本 發(fā)明的目的是提供用于實(shí)施這種擴(kuò)增判定方法的擴(kuò)增判定系 統(tǒng)、擴(kuò)增判定裝置、程序以及電子介質(zhì)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的擴(kuò)增判定方法，其特征在于， 其是能夠?qū)?jīng)核酸擴(kuò)增處理后的樣品判斷目標(biāo)核酸是否被擴(kuò)增 的擴(kuò)增判定方法，其包括
信號(hào)值準(zhǔn)備工序，該工序準(zhǔn)備示出各溫度下的上述處理后 樣品的熔解狀態(tài)的信號(hào)值；
最大值(A)檢索工序，該工序從上述各溫度下的上述信 號(hào)值中檢索最大值(A);
微分運(yùn)算工序，該工序?qū)ι鲜龈鳒囟认碌纳鲜鲂盘?hào)值進(jìn)行 連續(xù)的信號(hào)值間的微分，得到微分值；
二次微分運(yùn)算工序，該工序?qū)ι鲜龉ば虻玫降奈⒎种颠M(jìn)行連續(xù)的微分值間的微分，得到二次微分值；
最大差(B)運(yùn)算工序，該工序從上述工序得到的二次微 分值內(nèi)，從包括上述目標(biāo)核酸的Tm值在內(nèi)的預(yù)定溫度范圍下的 二次微分值中，選出最大的二次微分值(Dmax，)和最小的二次 微分值(Dmin，)，根據(jù)下式算得二次微分值的最大差(B):
B= ( Dmax，)國(guó)(Dmin,);
運(yùn)算工序，該工序用上述最大值(A)以及上述最大差(B)
進(jìn)行下式的運(yùn)算 X= ( B ) / ( A); 以及
判定工序，該工序?qū)⑸鲜鯴滿足[X〉預(yù)定閾值]的情況判斷 為擴(kuò)增正常；將上述X滿足[X ^預(yù)定閾值]的情況判斷為擴(kuò)增不 良。
依據(jù)本發(fā)明，利用如上所述的二次微分等運(yùn)算，可容易地 判定目標(biāo)核酸是否被擴(kuò)增。因此，可避免例如像以前那樣進(jìn)行 判定的個(gè)人的判定基準(zhǔn)的不同、以及必須具有專業(yè)知識(shí)的問(wèn)題。 此外，由于能夠容易地判斷目標(biāo)核酸有無(wú)擴(kuò)增，因此例如對(duì)將 導(dǎo)致基因型判斷錯(cuò)誤的、顯示擴(kuò)增不良的樣品，能夠中止此后 的熔解曲線解析。因而，最終能更容易地以高可靠性進(jìn)行熔解 曲線解析。特別是，通過(guò)在現(xiàn)有的基因解析裝置等中組裝本發(fā) 明的系統(tǒng)，例如當(dāng)然能確認(rèn)有無(wú)擴(kuò)增，還能全自動(dòng)化地進(jìn)行從 核酸的擴(kuò)增至基因型的判斷。因此，本發(fā)明例如在一般的分析 和診斷現(xiàn)場(chǎng)也能使用，擴(kuò)大了用途，能容易地進(jìn)行大量受試體 的解析，可以說(shuō)尤其在基因解析領(lǐng)域中是極為有用的技術(shù)。


圖l是使用了本發(fā)明的系統(tǒng)的單機(jī)型裝置的 一 個(gè)例子的總結(jié)構(gòu)圖。
圖2是使用了本發(fā)明的系統(tǒng)的聯(lián)網(wǎng)利用型裝置的 一 個(gè)例子 的總結(jié)構(gòu)圖。
圖3是示出上述單機(jī)型裝置的機(jī)器結(jié)構(gòu)的 一個(gè)例子的框圖。
圖4是示出上述聯(lián)網(wǎng)型裝置的機(jī)器結(jié)構(gòu)的 一 個(gè)例子的框圖。
圖5是用于實(shí)施本發(fā)明的系統(tǒng)的流程圖的 一 個(gè)例子。
圖6是示出本發(fā)明的實(shí)施方式中的熔解曲線的圖表。
圖7是示出本發(fā)明的實(shí)施方式中的微分曲線的圖表。
圖8是示出本發(fā)明的實(shí)施方式中的二次微分曲線的圖表。
圖9是示出本發(fā)明的實(shí)施方式中的乂= (B) / ( A)的圖表。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，表示樣品熔解狀態(tài)的信號(hào)，例如可以是由上 述樣品的非熔解而產(chǎn)生、由上述樣品的熔解而產(chǎn)生受到抑制的 信號(hào)，相反也可以是由上述樣品的非熔解而產(chǎn)生受到抑制、由 上述樣品的熔解而產(chǎn)生的信號(hào)。在本發(fā)明中，信號(hào)微分值例如 可以用[dF/dT]表示，也可以用[-dF/dT]表示。dF表示信號(hào)值的 變化量，dT表示溫度的變化量。當(dāng)信號(hào)的產(chǎn)生由于樣品熔解而 被抑制時(shí)，在用[dF/dT]表示信號(hào)微分值的熔解曲線中，峰是谷 型的；在用[-dF/dT]表示信號(hào)微分值的熔解曲線中，峰是山型的。 此外，當(dāng)由于上述樣品熔解而產(chǎn)生信號(hào)時(shí)，在用[dF/dT]表示信 號(hào)微分值的熔解曲線中，峰是山型的；在用[-dF/dT]表示信號(hào)微 分值的熔解曲線中，峰是谷型的。予以說(shuō)明，無(wú)論在樣品的熔 解和非熔解的任一狀態(tài)下產(chǎn)生信號(hào)，以及用任一個(gè)式子表示信 號(hào)微分值的情況下，都可通過(guò)信號(hào)微分值的絕對(duì)值的大小來(lái)評(píng) 價(jià)峰的大小。
在本發(fā)明中，信號(hào)值的種類沒有特別限制，例如可舉出吸
ii光度(吸收強(qiáng)度)、熒光強(qiáng)度等。上述信號(hào)的具體例子可舉出例
如是如上所述的由于雙鏈熔解而增加的260nm下的吸光度。此 外，當(dāng)使用熒光物時(shí)，上述信號(hào)值還可以是由于與上述熒光物 相應(yīng)的激發(fā)光而發(fā)出的熒光的強(qiáng)度。如上所述，上述熒光物可 以是由于雙鏈形成(非熔解)而發(fā)出熒光的物質(zhì)，也可以是由 于雙鏈熔解而發(fā)出熒光的物質(zhì)。作為熒光物的具體例子，可舉 出溴乙錠及如SYBR (注冊(cè)商標(biāo))Green那樣的嵌入劑。這些物 質(zhì)通常由于雙鏈形成(非熔解)而發(fā)出熒光，由于雙鏈熔解而
抑制熒光產(chǎn)生。此外，上述熒光物例如可以與構(gòu)成雙鏈核酸的 至少一個(gè)單鏈核酸結(jié)合。作為上述的結(jié)合了熒光物的單鏈核酸，
可舉出例如作為鳥噤呤猝滅探針而已知的QProbe (注冊(cè)商標(biāo)) 那樣的熒光猝滅探針。上述熒光猝滅探針通常因雙鏈形成而熒 光消失，且由于雙鏈熔解而產(chǎn)生熒光。予以說(shuō)明，本發(fā)明的特 征在于信號(hào)值的處理，而信號(hào)的種類等沒有任何限制。 <擴(kuò)增判定方法>
對(duì)本發(fā)明的擴(kuò)增判定方法列舉一個(gè)例子進(jìn)行說(shuō)明，該例中， 擴(kuò)增的目標(biāo)核酸(以下稱為"靶核酸")是靶位點(diǎn)具有多態(tài)性的 核酸，上述目標(biāo)核酸的Tm值是由上述靶位點(diǎn)具有多態(tài)性的核酸 和能夠與上述靶位點(diǎn)雜交的核酸(以下稱為"檢測(cè)用核酸")構(gòu) 成的雙鏈核酸的Tm值。予以說(shuō)明，本發(fā)明不限于此。
信號(hào)值準(zhǔn)備工序
首先，準(zhǔn)備表示各溫度下的上述處理后樣品的熔解狀態(tài)的 信號(hào)值。
上述信號(hào)值的溫度間隔沒有特別限制，例如是O.l ~ 5。C的 間隔，優(yōu)選為0.2~ 3。C的間隔，更優(yōu)選為0.8 ~ 1.2°。的間隔。此 外，上述溫度間隔例如雖然可以不同，^旦優(yōu)選為等間隔。
信號(hào)值例如優(yōu)選是對(duì)包括T m值在內(nèi)的溫度范圍進(jìn)行準(zhǔn)備。在上述靶位點(diǎn)具有多態(tài)性的情況下，如后所述，作為由上述靶
核酸與上述纟企測(cè)用核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的Tm值，假定 一 個(gè)相對(duì) 較高溫度的TmH值和相對(duì)較低溫度的TmL值。因此，信號(hào)值例 如優(yōu)選對(duì)包括TmH值和TmL值兩者在內(nèi)的較寬的溫度范圍進(jìn)行 準(zhǔn)備。上述溫度范圍例如下限優(yōu)選是比TmL值低l ~ 20。C的溫 度、更優(yōu)選比Tnvf直低l ~ 10。C的溫度；上限優(yōu)選是比TniH值高 1 20。C的溫度、更優(yōu)選比TmH值高1 ~ 10。C的溫度。作為具體 例子，上述溫度范圍優(yōu)選為[TmL值-5;TC ~ [TmH值+5;TC。
在上述靶位點(diǎn)具有多態(tài)性的情況下，上述耙核酸可以考慮 上述靶位點(diǎn)為野生型的耙核酸(以下稱為"野生型耙核酸")以 及上述靶位點(diǎn)為突變型的靶核酸(以下稱為"突變型靶核酸")。 通常上述野生型靶核酸與突變型靶核酸僅在上述耙位點(diǎn)有一個(gè) 堿基不同，因此上述雙鏈核酸的Tm值可舉出例如與上述檢測(cè)用 核酸100 %匹配的雙鏈的TmH值以及與上述檢測(cè)用核酸有1個(gè)堿 基^"配的雙鏈的Tn^值。由于Tm值會(huì)隨著雙鏈的同源性的相對(duì) 升高而變高、相對(duì)降低而變低，因此，前者即TniH值比后者即 Tnvf直的溫度更高。作為具體例子，例如在使用能與突變型的 靶位點(diǎn)雜交的;f企測(cè)用核酸(以下稱為"突變型^r測(cè)用核酸")的 情況時(shí)，可舉出突變型靶核酸與上述突變型檢測(cè)用核酸構(gòu)成的 雙一漣核酸的Tm值以及野生型耙核酸與上述突變型4企測(cè)核酸構(gòu) 成的雙鏈核酸的Tm值。在這種情況中，前者的Tm值成為TmH 值，后者的Tm值成為TmL值。相反，在使用能與野生型耙位點(diǎn) 雜交的檢測(cè)用核酸(以下稱為"野生型檢測(cè)用核酸，，)的情況中， 可舉出野生型靶核酸與上述野生型#r測(cè)用核酸構(gòu)成的雙鏈核酸 的Tm值以及突變型的靶核酸與上述野生型檢測(cè)用核酸構(gòu)成的 雙鏈核酸的Tm值。在這種情況中，前者的Tm值成為TmH值，后 者的Tm值成為TmL值。且，上述Tm值可才艮據(jù)上述靶核酸的序列及上述4全測(cè)用核酸的序列等適當(dāng)確定，更具體地，例如可用目
前公知的MELTCALC軟件(http: 〃www.meltcalc.com/)等算出， 或可由田比鄰法(Nearest Neighbor Method )確定(如下相同)。 在本實(shí)施方式中，表示上述處理后樣品的熔解狀態(tài)的信號(hào)值， 例如也可以說(shuō)是表示上述處理后的樣品中上述耙核酸的擴(kuò)增物
和能與上述靶核酸雜交的檢測(cè)用核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的熔解狀 態(tài)的信號(hào)值。
最大值(A)檢索工序
接著，從上述各溫度下的上述信號(hào)值中檢索最大值(A)。 這時(shí)，當(dāng)無(wú)法檢索最大值(A)時(shí)，可判斷為擴(kuò)增不良。 微分運(yùn)算工序
接著，對(duì)上述各溫度下的上述信號(hào)值進(jìn)行連續(xù)的信號(hào)值間 的微分而得到微分值。上述微分沒有特別限制，但優(yōu)選例如連 續(xù)的2點(diǎn)間~ 10點(diǎn)間的孩i分，更優(yōu)選連續(xù)的2點(diǎn)間~ 5點(diǎn)間的，特 別優(yōu)選連續(xù)的2點(diǎn)間的微分。例如在進(jìn)行2點(diǎn)間的微分的情況下， 任意點(diǎn)(p)的微分值(Dp)可以是任意點(diǎn)(p)的信號(hào)值(Sp) 與相鄰近的點(diǎn)(p+l)的信號(hào)值(Sp+J間的微分值，也可以 是任意點(diǎn)(p)的信號(hào)值(Sp)與相鄰近的點(diǎn)(p-l)的信號(hào)值 (Sp.J間的微分值，但優(yōu)選各點(diǎn)以相同方式求得微分值。在前 者的情況下，p為正整數(shù)，在后者的情況下，p為2以上的正整數(shù)。
二次微分運(yùn)算工序
此外，對(duì)上述工序得到的微分值進(jìn)行連續(xù)的多點(diǎn)間的微分 而得到二次微分值。上述微分值的微分例如優(yōu)選在連續(xù)的2 ~ 10 點(diǎn)間，更優(yōu)選在3 7點(diǎn)間，進(jìn)一步優(yōu)選在3 5點(diǎn)間，特別優(yōu)選 在4點(diǎn)間進(jìn)行。作為具體的例子，在進(jìn)行4點(diǎn)間的微分的情況下， 任意點(diǎn)(p)的二次微分值(Dp，)例如可以是下述例l ~例3中 的任一個(gè)，但優(yōu)選各點(diǎn)以相同方式求得二次微分值。例l中，任
14意點(diǎn)(p)的二次微分值(Dp，)例如可根據(jù)點(diǎn)(p)、( p+l )、( p+2)、 (p+3)總共4點(diǎn)間的微分算出，例2中根據(jù)點(diǎn)(p-l )、(p)、(p+l )、 (p+2)總共4點(diǎn)間的微分算出，例3中根據(jù)點(diǎn)(p-2)、(p-l )、(p)、 (p+l)總共4點(diǎn)間的微分算出。在上述例l的情況中上述p是正
整數(shù)，在上述例2的情況中p是2以上的正整數(shù)，在上述例3的情
況中，p是3以上的正整數(shù)。 最大差(B)運(yùn)算工序
在上述工序得到的二次微分值內(nèi)，從包括上述擴(kuò)增目標(biāo)核 酸的Tm值在內(nèi)的預(yù)定溫度范圍中的二次微分值中，選出最大的 二次微分值(Dmax，)與最小的二次微分值(Dmin，)，根據(jù)下式 得到最大差(B):
(B) = (Dmax，) - (Dmin，)。
上述預(yù)定溫度范圍只要包含上述擴(kuò)增目標(biāo)核酸的Tm值在 內(nèi)即可，但在本實(shí)施方式中，例如，如上所述是包含TmH值以 及TmL值兩者的溫度范圍。具體的例子是，上述溫度范圍的下 限優(yōu)選為比TniL值低l ~ 2(TC的溫度，更優(yōu)選為比Tn^值低l ~ l(TC的溫度，進(jìn)一步優(yōu)選為[TmL值-5]。C。上述溫度范圍的上限 優(yōu)選為比TmH值高1 ~ 20。C的溫度，更優(yōu)選為比TmH值高1 ~ 10°C 的溫度，進(jìn)一步優(yōu)選為[TmH值+5]。C。在本工序中，可以從上述 預(yù)定溫度范圍中的二次微分值中選出上述最大值和最小值。因 此，例如在上述二次微分運(yùn)算工序中，僅獲得上述預(yù)定溫度范 圍的二次微分值也是足夠的。而且，在上述微分運(yùn)算工序中， 僅在可得到上述預(yù)定溫度范圍的二次微分值的范圍下獲得微分 值也是足夠的。
X運(yùn)算工序
用上述最大值(A)及上述最大差(B)進(jìn)行下式的運(yùn)算 X= B ) / ( A)。判定工序
當(dāng)上述x滿足[x〉預(yù)定閾值]時(shí)，判斷為擴(kuò)增正常，當(dāng)上述x
滿足[xs預(yù)定閾值]時(shí)，判斷為擴(kuò)增不良。且，在本發(fā)明中，擴(kuò)
增正常意味著例如靶核酸被擴(kuò)增、認(rèn)為可進(jìn)行可靠的基因解析
的狀態(tài)；擴(kuò)增不良意味著例如沒有被擴(kuò)增、幾乎沒有被擴(kuò)增或 其它核酸被擴(kuò)增等情況，無(wú)法進(jìn)行可靠的基因解析，或有無(wú)法 進(jìn)行可靠的基因解析的擔(dān)憂的狀態(tài)。
上述閾值可根據(jù)例如信號(hào)的種類、信號(hào)的檢測(cè)波長(zhǎng)、發(fā)出 信號(hào)(熒光)的熒光物的種類、擴(kuò)增目標(biāo)的核酸及上述核酸的 靶位點(diǎn)的多態(tài)性的種類、檢測(cè)用核酸的序列、形成雙鏈核酸時(shí) 的反應(yīng)溶液組成等進(jìn)行適宜的設(shè)定。本發(fā)明的特征不是閾值的 具體的值及其設(shè)定方法，也不受其任何限定。此外，閾值的設(shè) 定方法的一個(gè)例子如后所述。
本發(fā)明的擴(kuò)增判定方法例如優(yōu)選還具有將得到的判定結(jié)果 的信息進(jìn)行輸出的輸出工序。上述判定結(jié)果例如可舉出擴(kuò)增正 常與否的項(xiàng)目。輸出時(shí)例如可以僅輸出判定結(jié)果，也可以將上 述x值、溫度與微分值作圖而得到的熔解曲線的圖、溫度與二 次微分值作圖而得到的圖表等與上述判定結(jié)果一起輸出。
另外，上述信號(hào)值準(zhǔn)備工序中的信號(hào)值可以使用例如通過(guò) 預(yù)先檢測(cè)而得到的數(shù)據(jù)，但也可以在信號(hào)值準(zhǔn)備工序之前通過(guò) 信號(hào)值的檢測(cè)來(lái)進(jìn)行準(zhǔn)備。具體而言，在上述信號(hào)值準(zhǔn)備工序 之前，進(jìn)一步還可以具有改變擴(kuò)增處理后的樣品(例如雙鏈核 酸)的溫度的溫度變化工序、以及連續(xù)或斷續(xù)地檢測(cè)示出溫度 變化時(shí)上述樣品的熔解狀態(tài)的信號(hào)值的檢測(cè)工序。上述溫度變 化工序例如可以是加熱上述樣品的加熱工序，也可以是使已被 加熱的樣品冷卻的冷卻工序，-f旦優(yōu)選上述加熱工序。
此外，在上述溫度變化工序之前，可包含對(duì)樣品進(jìn)行核酸擴(kuò)增處理的核酸擴(kuò)增工序。這時(shí)，上述4企測(cè)用核酸例如可以添 加至核酸擴(kuò)增處理后的樣品中，但優(yōu)選在核酸擴(kuò)增處理之前將 前述檢測(cè)用核酸添加至處理前的樣品中，因?yàn)檫@樣能夠連續(xù)進(jìn) 行處理。
更具體地，以圖6~ 8所示的圖表為例，說(shuō)明本發(fā)明的擴(kuò)增 判定方法。圖6是示出溫度與信號(hào)值的關(guān)系的圖表(熔解曲線)； 圖7是示出溫度與信號(hào)微分值的關(guān)系的圖表(微分曲線)；圖8 是示出溫度與二次微分值的關(guān)系的圖表(二次微分曲線)。在圖 6中，Y軸是信號(hào)值；在圖7中，Y軸是信號(hào)微分值；在圖8中， Y軸是二次微分值；在各圖中X軸均為溫度。此外，相對(duì)較低的 Tmi/f直為5(TC,相對(duì)較高的TmH值為56。C,上述最大差(B)運(yùn) 算工序中的溫度范圍設(shè)定為45。C (TmL值-5。C ) ~61°C ( TniH值 +5°C)。然而，它們僅是例示，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。
如圖6所示，準(zhǔn)備示出溫度與各溫度下的信號(hào)值的關(guān)系的圖 表，檢索最大值(A)。另一方面，如圖7所示，對(duì)上述信號(hào)值 進(jìn)行微分，制作示出溫度與各溫度下的微分值的關(guān)系的圖表。 接著，如圖8所示，對(duì)上述微分值進(jìn)行微分，制作示出上述溫度 范圍45 ~ 61。C與各溫度下的二次微分值的關(guān)系的圖表。接著， 在上述圖8的圖表中，選出最大的二次微分值(Dmax，)與最小
的二次微分值(Dmin，)，根據(jù)式(B)=(Dmax，) - (Dmin，)算
出二次微分值的最大差(B)。然后，用上述最大值(A)與上 述最大差(B)進(jìn)行式[乂= (B) / ( A)]的運(yùn)算。當(dāng)?shù)玫降腦滿 足[X〉預(yù)定閾值]時(shí)，判斷為擴(kuò)增正常，當(dāng)滿足[X^預(yù)定閾值]時(shí)， 判斷為擴(kuò)增不良?？梢詢H對(duì)判斷為擴(kuò)增正常的上述核酸擴(kuò)增處 理后的樣品進(jìn)行例如如后所述的熔解曲線解析，進(jìn)行多態(tài)性的 判定。
此外，上述圖6~ 8是伴隨著溫度上升所引起的雙鏈核酸解
17離而信號(hào)值增加的例子，但在伴隨著溫度上升所引起的雙鏈核 酸解離而信號(hào)值減少的情況下，同樣也可求得信號(hào)值的最大值
(A)、 二次微分值的最大差(B),通過(guò)上述X的運(yùn)算，能判斷 擴(kuò)增是正常還是不良。而且，在這個(gè)例子中，雖然例示出了3 種圖表，但在本發(fā)明中各種圖表的制作不是必須的。
在本發(fā)明中，如上所述，上述X的闊值沒有任何限制，可 根據(jù)靶核酸(基因)的種類及多態(tài)性的種類等適宜確定。下文 中例示出了閾值的設(shè)定方法，但本發(fā)明不受其限制。
X的閾值例如可如下所述確定。首先，對(duì)多個(gè)核酸受試體 進(jìn)行核酸擴(kuò)增處理，確認(rèn)目標(biāo)耙核酸的擴(kuò)增是正常還是不良。 接著，對(duì)由各核酸受試體得到的擴(kuò)增物與檢測(cè)用核酸構(gòu)成的雙 鏈，檢測(cè)各溫度下的信號(hào)值，與上述同樣地，確定上述最大值
(A)及上述最大差(B)，以及進(jìn)行X^ (B) / ( A)的運(yùn)算。 隨后，制作對(duì)各核酸受試體的X作圖而成的圖表。圖9中示出了 這種圖表的一個(gè)例子。如該圖所示，擴(kuò)增正常的核酸受試體(■) 與擴(kuò)增不良的核酸受試體( )的上述X值明顯不同。因此， 從該圖表求出擴(kuò)增正常及擴(kuò)增不良的X的臨界值，將其確定為 上述閾值。
在本發(fā)明的擴(kuò)增判定方法中，上述目標(biāo)核酸不限于如上所 述的假定了2個(gè)Tm值的上述靶位點(diǎn)具有多態(tài)性的耙核酸。在l 個(gè)Tm值的情況下，在上述最大差(B)運(yùn)算工序中的包括Tm值 在內(nèi)的溫度范圍的下限例如優(yōu)選為比Tm值低l ~ 20。C的溫度， 更優(yōu)選為比Tm值低l ~ 10。C的溫度，進(jìn)一步優(yōu)選為[Tm值-5]。C。 上述溫度范圍的上限優(yōu)選為比Tm值高l 2(TC的溫度，更優(yōu)選 為比Tm值高1 ~ 10。C的溫度，進(jìn)一步優(yōu)選為[Tm值+5]。C。
本發(fā)明的擴(kuò)增判定方法還可進(jìn) 一 步包括解析上述核酸擴(kuò)增 處理后的樣品的熔解曲線以判定預(yù)定溫度范圍內(nèi)是否存在峰的熔解曲線解析工序。由此，可以僅對(duì)判斷為擴(kuò)增正常的樣品進(jìn) 行熔解曲線解析，例如可進(jìn)行多態(tài)性的解析(基因型的解析)。 這樣，依據(jù)本發(fā)明的方法，能排除對(duì)擴(kuò)增不良的樣品進(jìn)行熔解 曲線解析，因此與現(xiàn)有技術(shù)相比能更為迅速和高效地進(jìn)行熔解 曲線解析。而且，本發(fā)明通過(guò)包括熔解曲線解析工序，例如能 連續(xù)進(jìn)行從核酸擴(kuò)增的判定至對(duì)判定為擴(kuò)增正常的樣品進(jìn)行的 熔解曲線解析以及多態(tài)性(基因型)的判定。因此，本發(fā)明的 擴(kuò)增判定方法例如還可稱為熔解曲線解析方法或多態(tài)性解析方 法(或基因型解析方法)。
本發(fā)明的擴(kuò)增判定方法可由例如下述本發(fā)明的擴(kuò)增判定系 統(tǒng)、本發(fā)明的擴(kuò)增判定裝置、本發(fā)明的計(jì)算機(jī)程序的運(yùn)行等來(lái) 實(shí)現(xiàn)。
<擴(kuò)增判定系統(tǒng)〉
本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)，其特征在于，其是對(duì)經(jīng)核酸擴(kuò)增 處理后的樣品判斷目標(biāo)核酸是否被擴(kuò)增的擴(kuò)增判定系統(tǒng)，其包
括
信號(hào)值輸入部，其輸入表示各溫度下的上述處理后樣品的 熔解狀態(tài)的信號(hào)值；
最大值(A)檢索部，其從通過(guò)上述信號(hào)值輸入部中輸入 的、上述各溫度下的上述信號(hào)值中檢索最大值(A);
微分運(yùn)算部，其對(duì)上述各溫度下的上述信號(hào)值進(jìn)行連續(xù)的 信號(hào)值間的微分，得到微分值；
二次微分運(yùn)算部，其對(duì)由上述微分運(yùn)算部得到的微分值進(jìn) 行連續(xù)的微分值間的微分，得到二次微分值；
最大差(B)運(yùn)算部，其在由上述二次微分運(yùn)算部得到的 二次微分值內(nèi)，從包括上述擴(kuò)增目標(biāo)的核酸的Tm值在內(nèi)的預(yù)定 溫度范圍下的二次微分值中，選出最大的二次微分值(Dmax，)與最小的二次微分值(Dmin，)，根據(jù)下式得到二次微分值的最 大差(B)，
B =( Dmax， ) - ( Dmin，)；
運(yùn)算部，其用上述最大值(A)和上述最大差(B)進(jìn)行下 式的運(yùn)算，
X= ( B ) / ( A); 以及
判定部，其將上述X滿足[X〉預(yù)定閾值]的情況判斷為擴(kuò)增
正常，將上述x滿足[xs預(yù)定閾值]的情況判斷為擴(kuò)增不良。而 且，只要沒有特別示出，與上述本發(fā)明的擴(kuò)增判定方法相同。 本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)中，上述微分運(yùn)算部?jī)?yōu)選例如進(jìn)行
連續(xù)的2點(diǎn)間的微分而得到微分值，此外，上述二次微分值運(yùn)算 部?jī)?yōu)選例如進(jìn)行連續(xù)的4點(diǎn)間的微分而得到二次微分值。
在本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)中，上述目標(biāo)核酸優(yōu)選為靶位點(diǎn) 具有多態(tài)性的核酸。而且，上述目標(biāo)核酸的Tm值優(yōu)選為由上述 靶位點(diǎn)具有多態(tài)性的核酸(耙核酸)與上述檢測(cè)用核酸構(gòu)成的 雙鏈核酸的T m值。在上述檢測(cè)用核酸為野生型測(cè)用核酸的情 況下，上述擴(kuò)增目標(biāo)的核酸的Tm值是例如由上述野生型耙核酸 與上述野生型檢測(cè)用核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的TmH值以及由上述 突變型耙核酸與上述野生型檢測(cè)用核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的TmL 值。此外，在上述檢測(cè)用核酸為突變型;f全測(cè)用核酸的情況下， 上述擴(kuò)增目標(biāo)的核酸的Tm值是例如由上述突變型靶核酸與上 述突變型4企測(cè)用核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的TmH值以及由上述野生 型靶核酸與上述突變型檢測(cè)用核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的Tmi/f直。
在上述最大差(B )運(yùn)算部中，包括上述擴(kuò)增目標(biāo)的核酸 的Tm值在內(nèi)的預(yù)定溫度范圍的下限例如是比TmL值低l ~ 20°C 的溫度，上限是比TmH值高1 ~ 20。C的溫度，優(yōu)選[TmL值-5]。C ~
20[TmH值+5;rC的溫度范圍。
本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)還可具有改變上述核酸擴(kuò)增處理后 的樣品的溫度的溫度變化部、以及連續(xù)或斷續(xù)地;險(xiǎn)測(cè)示出溫度 變化時(shí)上述樣品的熔解狀態(tài)的信號(hào)值的檢測(cè)部。上述溫度變化 部例如可以是加熱樣品的加熱部，也可以是將已凈皮加熱的樣品 進(jìn)行冷卻的冷卻部。上述溫度變化部可舉出例如能調(diào)節(jié)溫度的 溫度調(diào)節(jié)器、加熱器、熱循環(huán)儀等，上述檢測(cè)部可舉出例如分 光光度計(jì)及熒光光度計(jì)等。此外，裝配兩者的部分可舉出例如 實(shí)時(shí)PCR中使用的測(cè)定器等。上述信號(hào)例如是焚光，上述檢測(cè) 部?jī)?yōu)選纟企測(cè)熒光。
本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)還可包括對(duì)樣品核酸進(jìn)行擴(kuò)增處理 的核酸擴(kuò)增部。
當(dāng)上述目標(biāo)核酸是靶位點(diǎn)具有多態(tài)性的核酸時(shí)，本發(fā)明的 擴(kuò)增判定系統(tǒng)還可具有向上述樣品中添加能與上述耙位點(diǎn)雜交 的核酸的添加部。
本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)還可包括解析上述核酸擴(kuò)增處理后 的樣品的熔解曲線以解析預(yù)定溫度范圍中是否存在峰的熔解曲 線解析部。
本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)優(yōu)選例如還具有將得到的判定結(jié)果 的信息進(jìn)行輸出的輸出部。上述判定結(jié)果例如可舉出擴(kuò)增是否 正常的項(xiàng)目。輸出時(shí)，例如，可以僅輸出判定結(jié)果，也可將上 述X值、溫度與微分值作圖而得到的熔解曲線的圖表、溫度與 二次微分值作圖而得到的圖表等與上述判定結(jié)果 一 起輸出。 <聯(lián)網(wǎng)型擴(kuò)增判定系統(tǒng)以及用于該系統(tǒng)的終端> 本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)還可以是具有以下所示的終端和服 務(wù)器的聯(lián)網(wǎng)型系統(tǒng)。此外，只要沒有特別示出，與上述擴(kuò)增判 定系統(tǒng)相同。即，本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)，其特征在于，其是對(duì)經(jīng)核酸擴(kuò)增處理后的樣品解析目標(biāo)核酸是否被擴(kuò)增的聯(lián)網(wǎng)型 擴(kuò)增判定系統(tǒng)，
其具有終端和服務(wù)器，
上述終端和上述服務(wù)器可經(jīng)系統(tǒng)外的通信網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行連接， 上述終端具有
信號(hào)值輸入部，其輸入示出各溫度下的上述處理后樣品的
熔解狀態(tài)的信號(hào)值；
終端側(cè)發(fā)送部，其經(jīng)上述通信網(wǎng)絡(luò)將上述終端內(nèi)的信息發(fā) 送至上述服務(wù)器；以及
終端側(cè)接收部，其經(jīng)上述通信網(wǎng)絡(luò)接收從上述服務(wù)器發(fā)出 的信息；
上述服務(wù)器包括
服務(wù)器側(cè)發(fā)送部，其經(jīng)上述通信網(wǎng)絡(luò)將上述服務(wù)器內(nèi)的信 息發(fā)送至上述終端；
服務(wù)器側(cè)接收部，其經(jīng)上述通信網(wǎng)絡(luò)接收從上述終端發(fā)出 的信息；
最大值(A)檢索部，其從上述服務(wù)器側(cè)接收部接收的上 述各溫度下的上述信號(hào)值中檢索最大值(A);
微分運(yùn)算部，其對(duì)上述各溫度下的上述信號(hào)值進(jìn)行連續(xù)的 信號(hào)值間的微分，得到微分值；
二次微分運(yùn)算部，其對(duì)由上述微分運(yùn)算部得到的微分值進(jìn) 行連續(xù)的微分值間的微分，得到二次微分值；
最大差(B)運(yùn)算部，其在由上述二次微分運(yùn)算部得到的 二次微分值內(nèi)，從包括上述擴(kuò)增目標(biāo)的核酸的Tm值在內(nèi)的預(yù)定 溫度范圍下的二次微分值中，選出最大的二次微分值(Dmax，) 與最小的二次微分值(Dmin，)，根據(jù)下式得到二次微分值的最 大差(B)，
22(B ) = ( Dmax， ) - ( Dmin，)； 運(yùn)算部，其用上述最大值(A)和上述最大差(B)進(jìn)行下 式的運(yùn)算，
X= ( B ) / ( A); 以及
判定部，其將上述X滿足[X〉預(yù)定閾值]的情況判斷為擴(kuò)增 正常，將上述X滿足[XS預(yù)定閾值]的情況判斷為擴(kuò)增不良；
至少上述各溫度下的上述信號(hào)值從上述終端側(cè)發(fā)送部被發(fā) 送至上述服務(wù)器側(cè)接收部，并且，上述擴(kuò)增正?；驍U(kuò)增不良的 判定結(jié)果的信息從上述服務(wù)器側(cè)發(fā)送部被發(fā)送至上述終端側(cè)接 收部。
本發(fā)明的終端的特征在于，其是用于本發(fā)明的聯(lián)網(wǎng)型擴(kuò)增 判定系統(tǒng)的終端， 上述終端具有
微分值輸入部，其輸入示出各溫度下的樣品的炫解狀態(tài)的 信號(hào)值；
終端側(cè)發(fā)送部，其經(jīng)上述通信網(wǎng)絡(luò)將上述終端內(nèi)的信息發(fā) 送至上述服務(wù)器； 以及
終端側(cè)接收部，其經(jīng)上述通信網(wǎng)絡(luò)接收上述服務(wù)器發(fā)出的 信息；
送至上述服務(wù)器側(cè)接收部，并且，上述擴(kuò)增正?；驍U(kuò)增不良的 判定結(jié)果的信息從上述服務(wù)器側(cè)發(fā)送部被發(fā)送至上述終端側(cè)接 收部。
<擴(kuò)增判定裝置>
本發(fā)明的擴(kuò)增判定裝置的特征在于，其是對(duì)經(jīng)核酸擴(kuò) 處理后的樣品判定目標(biāo)核酸是否被擴(kuò)增的擴(kuò)增判定裝置，其包括 本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)。 <程序〉
本發(fā)明的程序是可在計(jì)算機(jī)上執(zhí)行本發(fā)明的擴(kuò)增判定方法 的計(jì)算機(jī)程序。
<電子介質(zhì)>
本發(fā)明的電子介質(zhì)是儲(chǔ)存了本發(fā)明的計(jì)算機(jī)程序的電子介質(zhì)。
接著，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。 第一個(gè)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的例子
圖l示出了作為本發(fā)明的系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子的單機(jī)型 總結(jié)構(gòu)圖。圖l示出的系統(tǒng)由本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)ll構(gòu)成，擴(kuò)
增判定系統(tǒng)11由數(shù)據(jù)輸入輸出部12以及擴(kuò)增判定計(jì)算部13構(gòu) 成。圖3示出了單機(jī)型擴(kuò)增判定裝置的硬件結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子。如 圖所示，擴(kuò)增判定系統(tǒng)11由數(shù)據(jù)輸入輸出部12、擴(kuò)增判定計(jì)算 部13以及存儲(chǔ)裝置37構(gòu)成。上述數(shù)據(jù)輸入輸出部12由具有執(zhí)行 程序的CPU31、輸入輸出I/F (接口 ) 32、輸入數(shù)據(jù)的輸入裝置 33、輸出數(shù)據(jù)的輸出裝置34的計(jì)算機(jī)構(gòu)成。輸入裝置33可舉出 例如鍵盤及鼠標(biāo)等，輸出裝置34可舉出例如打印機(jī)及LED或液 晶顯示器等。擴(kuò)增判定計(jì)算部由具有存儲(chǔ)了程序的程序存儲(chǔ)部 36以及執(zhí)行程序的CPU35的計(jì)算機(jī)構(gòu)成。存儲(chǔ)裝置37中以能夠 調(diào)用的狀態(tài)存儲(chǔ)有例如各溫度下的信號(hào)值、信號(hào)微分值、二次 微分值、Tm值(TmH值、TniL值)、包括Tm值在內(nèi)的預(yù)定溫度 范圍、檢測(cè)用探針的序列與種類(野生型檢測(cè)用或突變型檢測(cè) 用)等數(shù)據(jù)。存儲(chǔ)裝置37可舉出例如ROM、 HDD、 HD等，在 CPU的控制下控制讀取/寫入，存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。且，數(shù)據(jù)輸入輸出部 12、擴(kuò)增判定計(jì)算部13、存儲(chǔ)裝置37是純功能性的，例如可以一體化構(gòu)成在l臺(tái)計(jì)算機(jī)上，也可在多臺(tái)計(jì)算機(jī)上分別構(gòu)成。
此外，本發(fā)明的系統(tǒng)還可具有改變樣品溫度的溫度變化部
(例如進(jìn)^亍加熱處理的加熱處理部)、連續(xù)或斷續(xù)；也;險(xiǎn)測(cè)示出溫
度變化時(shí)的樣品的熔解狀態(tài)的信號(hào)值的檢測(cè)部。而且，可將上 述檢測(cè)部檢出的信號(hào)值通過(guò)上述數(shù)據(jù)輸入輸出部進(jìn)行輸入。溫 度變化部可舉出例如加熱裝置等。上述檢測(cè)部可舉出例如光學(xué) 光度計(jì)及熒光光度計(jì)。上述加熱處理部及上述檢測(cè)部各自例如 既可以是一體化構(gòu)成在l臺(tái)計(jì)算機(jī)上，也可以是在多臺(tái)計(jì)算機(jī)上 分別分別構(gòu)成。
此外，本發(fā)明的系統(tǒng)還可進(jìn)一步具有用于解析上述核酸擴(kuò) 增處理后的樣品的熔解曲線以解析預(yù)定溫度范圍內(nèi)是否存在峰 的熔解曲線解析部。因此，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)，不僅可判斷擴(kuò) 增是正常還是不良，還可對(duì)判斷為正常的上述樣品進(jìn)一步進(jìn)行 熔解曲線解析，例如根據(jù)有無(wú)存在峰可判斷出耙核酸的多態(tài)性 (基因型)。而且，除此之外，還可配備用于從生物樣品中提取 核酸的核酸提取部、進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增處理部等。通過(guò)
以這種結(jié)構(gòu)，例如可才是供一種在一個(gè)系統(tǒng)中自動(dòng)進(jìn)4亍^v核酸擴(kuò)
增到擴(kuò)增的判定、或者由核酸的擴(kuò)增直至多態(tài)性(基因型)的 判定的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)。 第二個(gè)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的例子
圖2示出了用服務(wù)器處理的聯(lián)網(wǎng)型系統(tǒng)的總結(jié)構(gòu)圖。如圖2 所示，本實(shí)施方式的系統(tǒng)由本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)21、以及擴(kuò) 增判定計(jì)算部23構(gòu)成的服務(wù)器系統(tǒng)24構(gòu)成。擴(kuò)增判定系統(tǒng)21由 數(shù)據(jù)輸入輸出部2 2構(gòu)成。擴(kuò)增判定系統(tǒng)21與服務(wù)器系統(tǒng)2 4可通 過(guò)例如作為基于TCP (傳輸控制協(xié)議)/IP (因特網(wǎng)協(xié)議)的因 特網(wǎng)而起作用的公用網(wǎng)及專用線等通信線路100進(jìn)行連接。圖4 示出了上述聯(lián)網(wǎng)型系統(tǒng)的裝置的結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子。擴(kuò)增判定系
25統(tǒng)21由數(shù)據(jù)輸入輸出部22及通信I/F(接口 )47構(gòu)成，經(jīng)通信I/F47 與通信線路10 0連接。服務(wù)器系統(tǒng)2 4由擴(kuò)增判定計(jì)算部2 3及通信 1/F48構(gòu)成，通過(guò)通信I/F48與通信線路100連接。數(shù)據(jù)輸入輸出 部22由執(zhí)行程序的CPU41、輸入輸出I/F42、輸入數(shù)據(jù)的輸入裝 置43以及輸出數(shù)據(jù)的輸出裝置44構(gòu)成。上述數(shù)據(jù)輸入輸出部22 及通信I/F47是純功能性的，例如可以是一體化構(gòu)成在一臺(tái)計(jì)算 機(jī)上，也可以在多臺(tái)計(jì)算機(jī)上分別構(gòu)成。擴(kuò)增判定計(jì)算部23由 執(zhí)行程序的CPU45以及存儲(chǔ)程序的程序存儲(chǔ)部46構(gòu)成。擴(kuò)增判 定計(jì)算部23及通信I/F48是純功能性的，例如可以是一體化構(gòu)成 在一臺(tái)計(jì)算機(jī)上，也可以在多臺(tái)計(jì)算機(jī)上分別構(gòu)成。 系統(tǒng)的基本處理的例子
圖5的流程圖示出了本發(fā)明的擴(kuò)增判定系統(tǒng)的基本處理的 例子。以下按照該圖說(shuō)明處理的流程。而且，本發(fā)明的系統(tǒng)中 的各處理步驟，可通過(guò)適當(dāng)利用例如CPU、主存儲(chǔ)器、總線、 或二次存儲(chǔ)裝置、打印機(jī)及顯示器、其它外部周邊裝置等硬件 結(jié)構(gòu)部、以及其它外部周邊儀器用輸入輸出U/0)端口、用于 控制這些硬件的驅(qū)動(dòng)程序以及其它應(yīng)用程序等來(lái)執(zhí)行。輸入各溫度下的信號(hào)值。檢索最大值(A)。對(duì)各溫度下的信號(hào)值進(jìn)行微分。對(duì)信號(hào)微分值再次進(jìn)行微分。從上述二次微分值中檢索最大的二次微分值與最小的 二次微分值。得到上述最大二次微分值與最小二次微分值的差，即最 大差(B)。判斷經(jīng)上述最大值(A)與最大差(B)運(yùn)算而得到的X
是否滿足po閾值]。[8: YES]當(dāng)上述[7]為YES時(shí)，判斷為擴(kuò)增正常。 [9: NO]當(dāng)上述[7]為NO時(shí)，判斷為擴(kuò)增不良。 產(chǎn)業(yè)上的可利用性
如上所述，依據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)利用如上所述的二次微分 等運(yùn)算很容易地判定目標(biāo)核酸是否被擴(kuò)增。因此，例如，可避 免以往進(jìn)行判定的個(gè)人的判定基準(zhǔn)的不同、以及必須具有專業(yè) 知識(shí)那樣的問(wèn)題。這樣，由于能夠容易地判斷出目標(biāo)核酸有無(wú) 擴(kuò)增，因此例如對(duì)導(dǎo)致基因型判斷錯(cuò)誤的、顯示擴(kuò)增不良的樣 品，能終止其后的熔解曲線解析。因而，最終可更容易地以高 可靠性進(jìn)行熔解曲線解析。更特別地，通過(guò)在現(xiàn)有的基因解析 裝置等中組合本發(fā)明的系統(tǒng)，例如當(dāng)然能確認(rèn)擴(kuò)增的有無(wú)，還 能全自動(dòng)化進(jìn)行從核酸的擴(kuò)增至基因型的判斷的操作。因此， 本發(fā)明還可用于例如一般的分析和診斷現(xiàn)場(chǎng)，由于可容易地進(jìn) 行多個(gè)受試體的解析，因而可以說(shuō)尤其在基因解析領(lǐng)域中是極 為有用的技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種擴(kuò)增判定方法，其是對(duì)經(jīng)核酸擴(kuò)增處理后的樣品判定目標(biāo)核酸是否被擴(kuò)增的擴(kuò)增判定方法，其包括信號(hào)值準(zhǔn)備工序，該工序準(zhǔn)備示出各溫度下的上述處理后樣品的熔解狀態(tài)的信號(hào)值；最大值(A)檢索工序，該工序從上述各溫度下的上述信號(hào)值中檢索最大值(A)；微分運(yùn)算工序，該工序?qū)ι鲜龈鳒囟认碌纳鲜鲂盘?hào)值進(jìn)行連續(xù)的信號(hào)值間的微分，得到微分值；二次微分運(yùn)算工序，該工序?qū)ι鲜龉ば虻玫降奈⒎种颠M(jìn)行連續(xù)的微分值間的微分，得到二次微分值；最大差(B)運(yùn)算工序，該工序從上述工序得到的二次微分值內(nèi)，從包括上述目標(biāo)核酸的Tm值在內(nèi)的預(yù)定溫度范圍下的二次微分值中，選出最大的二次微分值(Dmax’)和最小的二次微分值(Dmin’)，根據(jù)下式算得二次微分值的最大差(B)B＝(Dmax’)-(Dmin’)；運(yùn)算工序，該工序用上述最大值(A)以及上述最大差(B)進(jìn)行下式的運(yùn)算X＝(B)/(A)；以及判定工序，該工序?qū)⑸鲜鯴滿足[X＞預(yù)定閾值]的情況判斷為擴(kuò)增正常，將上述X滿足[X≤預(yù)定閾值]的情況判斷為擴(kuò)增不良。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的擴(kuò)增判定方法，上述微分運(yùn)算工序中，進(jìn)行連續(xù)的2點(diǎn)間的微分而得到微分值。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的擴(kuò)增判定方法，上述二次微分運(yùn)算工序中，進(jìn)行連續(xù)的4點(diǎn)間的微分而得到二次微分值。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的擴(kuò)增判定方法，上述目標(biāo)核酸是耙位點(diǎn)具有多態(tài)性的核酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的擴(kuò)增判定方法，上述目標(biāo)核酸的Tm值是由上述粑位點(diǎn)具有多態(tài)性的核酸和能夠與上述靶位點(diǎn)雜交的核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的Tm值。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的擴(kuò)增判定方法，在能與上述靶位點(diǎn)雜交的核酸是野生型的能與上述靶位點(diǎn)雜交的核酸的情況下，上述目標(biāo)核酸的Tm值是由上述靶位點(diǎn)為野生型的核酸和能與上述野生型的耙位點(diǎn)雜交的核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的TmH值、以及由上述耙位點(diǎn)為突變型的核酸和能與上述野生型的乾位點(diǎn)雜交的核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的TmL值；在能與上述靶位點(diǎn)雜交的核酸是突變型的能與上述耙位點(diǎn)雜交的核酸的情況下，上述目標(biāo)核酸的Tm值是由上述靶位點(diǎn)為突變型的核酸和能與上述突變型的靶位點(diǎn)雜交的核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的TmH值、以及由上述靶位點(diǎn)為野生型的核酸和能與上述突變型的靶位點(diǎn)雜交的核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的TmL值。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的擴(kuò)增判定方法，在上述最大差(B)運(yùn)算工序中，包括上述目標(biāo)核酸的Tm值在內(nèi)的預(yù)定溫度范圍的下限是比TmL值低l ~ 20。C的溫度，上限是比TmH值高1 ~ 2(TC的溫度。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的擴(kuò)增判定方法，上述溫度范圍是[TmL值-5]。C ~ [TmH值+5]。C。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的擴(kuò)增判定方法，在上述信號(hào)值準(zhǔn)備工序之前，還具有溫度變化工序，該工序改變上述核酸擴(kuò)增處理后的樣品的溫度；以及4全測(cè)工序，該工序連續(xù)或斷續(xù)地4全測(cè)示出溫度變化時(shí)上述處理后的樣品的熔解狀態(tài)的信號(hào)值。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的擴(kuò)增判定方法，上述目標(biāo)核酸是耙位點(diǎn)具有多態(tài)性的核酸，在上述溫度變化工序之前，具有向上述樣品中添加能與上述^fc位點(diǎn)雜交的核酸的添加工序。
11. 一種擴(kuò)增判定系統(tǒng)，其是對(duì)經(jīng)核酸擴(kuò)增處理后的樣品判定目標(biāo)核酸是否被擴(kuò)增的擴(kuò)增判定系統(tǒng)，其包括信號(hào)值輸入部，其輸入示出各溫度下的上述處理后樣品的熔解狀態(tài)的信號(hào)值；最大值(A)檢索部，其從通過(guò)上述信號(hào)值輸入工序輸入的、上述各溫度下的上述信號(hào)值中檢索最大值(A);微分運(yùn)算部，其對(duì)上述各溫度下的上述信號(hào)值進(jìn)行連續(xù)的信號(hào)值間的微分，得到微分值；二次微分運(yùn)算部，其對(duì)由上述微分運(yùn)算部得到的微分值進(jìn)行連續(xù)的微分值間的微分，得到二次微分值；最大差(B)運(yùn)算部，其在由上述二次微分運(yùn)算部得到的二次微分值內(nèi)，從包括上述目標(biāo)核酸的Tm值在內(nèi)的預(yù)定溫度范圍下的二次微分值中，選出最大的二次微分值(Dmax，)與最小的二次微分值(Dmin，)，根據(jù)下式得到二次微分值的最大差(B ),B =( Dmax， ) - ( Dmin，)；運(yùn)算部，其用上述最大值(A)和上述最大差(B)進(jìn)行下式的運(yùn)算，X= ( B ) / ( A);以及判定部，其將上述X滿足[X〉預(yù)定閾值]的情況判斷為擴(kuò)增正常，將上述x滿足[x^預(yù)定閾值]的情況判斷為擴(kuò)增不良。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的擴(kuò)增判定系統(tǒng)，上述微分運(yùn)算部中，進(jìn)行連續(xù)的2點(diǎn)間的微分，得到二次微分值。
13. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的擴(kuò)增判定系統(tǒng)，上述二次微分運(yùn)算部中，進(jìn)行連續(xù)的4點(diǎn)間的微分，得到二次微分值。
14. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的擴(kuò)增判定系統(tǒng)，上述目標(biāo)核酸是靶位點(diǎn)具有多態(tài)性的核酸。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的擴(kuò)增判定系統(tǒng)，上述目標(biāo)核酸的Tm值是由上述靶位點(diǎn)具有多態(tài)性的核酸和能與上述耙位點(diǎn)雜交的核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的Tm值。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的擴(kuò)增判定系統(tǒng)，在能與上述靶位點(diǎn)雜交的核酸是野生型的能與上述耙位點(diǎn)雜交的核酸的情況下，上述目標(biāo)核酸的Tm值是由上述靶位點(diǎn)為野生型的核酸和能與上述野生型的靶位點(diǎn)雜交的核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的TmH值、以及由上述靶位點(diǎn)為突變型的核酸和能與上述野生型的耙位點(diǎn)雜交的核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的Tm^直；在能與上述靶位點(diǎn)雜交的核酸是突變型的能與上述耙位點(diǎn)雜交的核酸的情況下，上述目標(biāo)核酸的Tm值是由上述靶位點(diǎn)為突變型的核酸和能與上述突變型的靶位點(diǎn)雜交的核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的TmH值、以及由上述靶位點(diǎn)為野生型的核酸和能與上述突變型的耙位點(diǎn)雜交的核酸構(gòu)成的雙鏈核酸的TmL值。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的擴(kuò)增判定系統(tǒng)，在上述最大差(B)運(yùn)算部中，包括上述目標(biāo)核酸的Tm值在內(nèi)的預(yù)定溫度范圍的下限是比TmL值低l ~ 2(TC的溫度，上限是比TmH值高1 ~20。C的溫度。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的擴(kuò)增判定系統(tǒng)，上述溫度范圍是[TmL值-5]。C ~ [TmH值+5]。C。
19. 一種擴(kuò)增判定裝置，其是對(duì)經(jīng)核酸擴(kuò)增處理后的樣品判定目標(biāo)核酸是否被擴(kuò)增的擴(kuò)增判定裝置，其包括權(quán)利要求11所述的擴(kuò)增判定系統(tǒng)。
全文摘要
提供了一種擴(kuò)增判定方法，其能夠?qū)?jīng)核酸擴(kuò)增處理后的樣品判斷目標(biāo)核酸是否被擴(kuò)增。準(zhǔn)備示出各溫度下的核酸擴(kuò)增處理后的樣品熔解狀態(tài)的信號(hào)值，并檢索最大信號(hào)值(A)。另一方面，對(duì)上述各溫度下的上述信號(hào)值進(jìn)行連續(xù)的2點(diǎn)間的微分而得到微分值，再對(duì)上述微分值進(jìn)行連續(xù)的4點(diǎn)間的微分而得到二次微分值。在上述二次微分值中，從包括上述擴(kuò)增目標(biāo)的核酸的Tm值在內(nèi)的預(yù)定溫度范圍下的二次微分值中，選出最大的二次微分值(D_max’)和最小的二次微分值(D_min’)，根據(jù)式(B)＝(D_max’)-(D_min’)算得二次微分值的最大差(B)。進(jìn)行式X＝(B)/(A)的運(yùn)算，當(dāng)上述X滿足[X＞預(yù)定閾值]時(shí)，判斷為擴(kuò)增正常，當(dāng)上述X滿足[X≤預(yù)定閾值]時(shí)，判斷為擴(kuò)增不良。
文檔編號(hào)G06F19/00GK101688250SQ200880023290
公開日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者久保高輔 申請(qǐng)人:愛科來(lái)株式會(huì)社