專利名稱：核酸定量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行核酸定量的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核酸的定量在從分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究到診斷學(xué)和病原體檢測(cè)的許多領(lǐng)域中是重要的。當(dāng)足夠量的核酸存在時(shí)，斑點(diǎn)技術(shù)可被用于定量。但是，這些技術(shù)有限的靈敏度妨礙了它們?cè)谠S多情況中的應(yīng)用。不久前發(fā)展的定量PCR方法為需要更高靈敏度的情況中的分析提供了工具。這些技術(shù)基于在PCR擴(kuò)增中產(chǎn)物的量指數(shù)增長(zhǎng)并且因此在相對(duì)少量的循環(huán)后獲得的產(chǎn)物的量可被傳統(tǒng)方法(例如熒光檢測(cè))檢測(cè)到的事實(shí)。此外，如果擴(kuò)增循環(huán)數(shù)是已知的，原則上初始 (即在擴(kuò)增開始時(shí))存在的產(chǎn)物的量，可從擴(kuò)增結(jié)束時(shí)獲得的產(chǎn)物的量中被確定。簡(jiǎn)要概括，實(shí)際上，在給定的PCR反應(yīng)條件下靶核酸及標(biāo)準(zhǔn)和/或?qū)Ρ扔脴悠?(comparative sample)進(jìn)行PCR，并且PCR產(chǎn)物的形成在擴(kuò)增程序的過程中被監(jiān)控。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)通過例如當(dāng)結(jié)合到靶標(biāo)上發(fā)射特異性信號(hào)的熒光標(biāo)記的雜交探針的方法或允許檢測(cè)雙鏈產(chǎn)物的DNA插入熒光染料的方法來完成。對(duì)獲得特異地?zé)晒忾撝邓奖匦璧臄U(kuò)增循環(huán)數(shù)，指定為Ct值，被確定并且將靶標(biāo)的Ct值與已知濃度(絕對(duì)量)的核酸標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋系列的Ct值相比較。為確定靶標(biāo)的絕對(duì)量，標(biāo)準(zhǔn)曲線從標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值中建立并用于確定靶標(biāo)的初始濃度?？蛇x擇地，靶標(biāo)的Ct值與單獨(dú)的對(duì)比用興趣核酸相比(相對(duì)定量)。 在這種情況下靶標(biāo)和對(duì)比用樣品Ct值的比值被確定并用于估定靶標(biāo)和對(duì)比用核酸的初始量的比值。不幸地是，由于一些問題這些方法的實(shí)際應(yīng)用是復(fù)雜的，這些問題中的一些將在下文中討論。定量PCR領(lǐng)域中的一些挑戰(zhàn)涉及增長(zhǎng)的在短時(shí)間間隔中分析大量樣品的需求。由于定量PCR不斷增長(zhǎng)的應(yīng)用范圍需要以高通量的方式分析非常大量的樣品，例如在臨床實(shí)踐中，開發(fā)可以完全自動(dòng)化及需要非常少或無人員交互的定量PCR方法是必要的。這在一些情況中具有至關(guān)重要的價(jià)值，由于如果需要人員交互，簡(jiǎn)單地高通量應(yīng)用(例如在臨床實(shí)踐中)無法在必需的短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。用這種自動(dòng)化方法實(shí)現(xiàn)的附加的好處是不同實(shí)驗(yàn)室之間分析數(shù)據(jù)的改進(jìn)的可比較性，所述實(shí)驗(yàn)室普遍使用很不同的定量PCR實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程。鑒于增長(zhǎng)的使用定量PCR 技術(shù)于基礎(chǔ)研究的實(shí)驗(yàn)室的數(shù)量，此問題具有極為重要的價(jià)值。建立自動(dòng)化方法作為定量實(shí)驗(yàn)的客觀參考將徹底地有助于這些研究成果。擴(kuò)增反應(yīng)過程中形成的PCR產(chǎn)物的典型圖顯示了 4個(gè)不同的擴(kuò)增程序的階段(參見圖1):(1)熒光信號(hào)受背景熒光和噪聲控制的本底階段；(2)來自PCR產(chǎn)物的信號(hào)上升超過本底水平并指數(shù)增長(zhǎng)的指數(shù)階段；(3)由于如PCR試劑的消耗和檢測(cè)探針的降解的因素引起擴(kuò)增效率降低，信號(hào)增長(zhǎng)少于指數(shù)速度的對(duì)數(shù)線性階段；(4)由于上升減慢及擴(kuò)增反應(yīng)最終停止，信號(hào)邊緣上升的平臺(tái)階段。盡管表面上簡(jiǎn)單易懂的概念，為確定Ct值選擇適當(dāng)?shù)男盘?hào)閾值水平不是一個(gè)簡(jiǎn)單的任務(wù)。如可從圖1的圖中看到的，選擇高閾值水平可導(dǎo)致Ct值在擴(kuò)增反應(yīng)的對(duì)數(shù)線性或平臺(tái)階段。這是不合需要的，由于在此區(qū)域中反應(yīng)已經(jīng)從指數(shù)增長(zhǎng)減慢下來，使初始和現(xiàn)有核酸量之間的關(guān)系不明顯。選擇低閾值水平，另一方面，可導(dǎo)致Ct值定位在擴(kuò)增反應(yīng)的本底階段，其中噪聲和背景信號(hào)可使測(cè)量復(fù)雜化。明顯地，因此，精選導(dǎo)致Ct值閾值水平對(duì)應(yīng)到指數(shù)增長(zhǎng)的循環(huán)數(shù)，即在指數(shù)階段，是令人滿意的。許多方法已被開發(fā)以達(dá)到此目的(參見例如JD Durtschi等人Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64)。基本閾值法需要實(shí)驗(yàn)人員觀察擴(kuò)增曲線并運(yùn)用其自己的判斷選擇適當(dāng)?shù)脑谥笖?shù)階段相交的信號(hào)閾值。由于信號(hào)的絕對(duì)水平依賴于許多因素，包括核酸的長(zhǎng)度和用于檢測(cè)的方法，這種方法的閾值水平必須被檢查，并如果必要，對(duì)每一種應(yīng)用校對(duì)。類似地，在擬合點(diǎn)法中，實(shí)驗(yàn)人員必須根據(jù)其自己的判斷選擇適當(dāng)?shù)拈撝?。但是替代賦值Ct到記錄的信號(hào)相交于閾值的循環(huán)數(shù)，線性擬合是以曲線的指數(shù)部分的半對(duì)數(shù)圖為模型，并且這條直線通過閾值的循環(huán)數(shù)被設(shè)定為Ct。另一個(gè)概念稱為最大二階導(dǎo)數(shù)法，其中擴(kuò)增曲線的二階導(dǎo)數(shù)的最大值被數(shù)值地確定。相應(yīng)的循環(huán)數(shù)被假設(shè)存在于指數(shù)增長(zhǎng)階段的末尾，在此處反應(yīng)開始減慢下來到線性增長(zhǎng)。這個(gè)循環(huán)數(shù)，類似于Ct，用于確定靶標(biāo)的量。相對(duì)于基本閾值和擬合點(diǎn)法，此方法需要很少或無人員交互，因?yàn)殚撝邓讲槐仨氂蓪?shí)驗(yàn)人員設(shè)定。還另一種方法稱為S形曲線擬合法，其中S形公式以擴(kuò)增曲線為模型。對(duì)應(yīng)于曲線拐點(diǎn)的循環(huán)數(shù)可以從模型中獲得并類似于Ct被用于確定靶標(biāo)的量。這種方法也需要很少或無人員交互。最大二階導(dǎo)數(shù)法和S形曲線擬合法，原則上顯示適合于完全地自動(dòng)化。基本閾值法和擬合點(diǎn)法由其特性無論如何需要人員交互，并因此不適合于自動(dòng)化。最大二階導(dǎo)數(shù)法和S形曲線擬合法，盡管已被發(fā)現(xiàn)對(duì)需要高靈敏度的應(yīng)用使用受限 (JD Durtschi 等人 Analytical biochemistry 2007 (361) 55—64)。因此，本發(fā)明的目的是提供適合于完全自動(dòng)化的高靈敏度的核酸定量的方法。發(fā)明目的和概述
根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于相對(duì)定量樣品中至少一種靶核酸的方法來達(dá)到，所述方法包括以下步驟
(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，
(b)對(duì)比用核酸的至少一種樣品中的每一種的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與至少一種對(duì)比用核酸中的每一種的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，
(C)獲得的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(d)靶和對(duì)比用核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，
(e)靶和對(duì)比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度(ameasure of randomness) M 的計(jì)算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和對(duì)比用核酸是最小的，
(g)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)通過比較靶和對(duì)比用樣品的Cc，與對(duì)比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對(duì)量。可選地，根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于絕對(duì)定量樣品中至少一種靶核酸的方法來達(dá)到，所述方法包括以下步驟(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，
(b)已知濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋系列的樣品的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的核酸的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，
(C)獲得的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(d)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，
(e)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品是最小的，
(g)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)通過比較靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法來達(dá)到，所述方法包括以下步驟
(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增，
(b)同時(shí)獲得關(guān)聯(lián)于至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增的信號(hào)，
(c)獲得的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(d)每一種靶核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，
(e)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于每一種靶核酸是最小的，
(g)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)從Cc值中計(jì)算Ct值。用本領(lǐng)域已知的方法，獲得的Ct值可被用于定量核酸。可選地，根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于相對(duì)定量樣品中至少一種靶核酸的方法來達(dá)到，所述方法包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸和至少一種對(duì)比用核酸的擴(kuò)增曲線的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(b)靶和對(duì)比用核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，
(c)靶和對(duì)比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，
(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和對(duì)比用核酸是最小的，
(e)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(f)通過比較靶和對(duì)比用樣品的Cc，與對(duì)比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對(duì)量?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于絕對(duì)定量樣品中至少一種靶核酸的方法來達(dá)到，所述方法包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸和已知濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋系列的樣品的擴(kuò)增曲線的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(b)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，
(c)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，
(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品是最小的，
(e)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(f)通過比較靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量。可選地，根據(jù)本發(fā)明，此目的通過用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法來達(dá)到，所述方法包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸的擴(kuò)增曲線的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(b)每一種靶核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，
(c)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，
(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于每一種靶核酸是最小的，
(e)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(f)從Cc值中計(jì)算Ct值。用本領(lǐng)域已知的方法，獲得的Ct值可被用于核酸的定量。此外，本發(fā)明涉及如上描述的方法，所述方法以完全自動(dòng)化，即無人員交互的方式進(jìn)行。另外，本發(fā)明涉及其上已儲(chǔ)存用于進(jìn)行上述方法的步驟(C)到(h)的指令的機(jī)器可讀介質(zhì)。此外，本發(fā)明涉及用于分析核酸樣品的儀器，其包含含有用于進(jìn)行上述方法的信息的機(jī)器可讀記憶裝置。


圖1顯示在擴(kuò)增反應(yīng)過程中形成的PCR產(chǎn)物的典型圖，揭示了擴(kuò)增過程中的不同階段=GP=本底階段，EP=指數(shù)階段，LP=對(duì)數(shù)線性階段，PP=平臺(tái)階段。C表示循環(huán)數(shù)及I。 表示記錄的信號(hào)強(qiáng)度。圖2顯示數(shù)值計(jì)算的3個(gè)在25μ1體積中以IO6拷貝DNA初始量開始的PCR擴(kuò)增的E(C)曲線。圖3Α顯示由實(shí)施例1中獲得的背景修正的擴(kuò)增曲線。圖:3Β顯示在實(shí)施例1中獲得的譜熵曲線。該圖顯示對(duì)于106、105、104、IO3UO2拷貝數(shù)/25μ1濃度的樣品，譜熵(M)分別在20、23J6、31、34個(gè)循環(huán)數(shù)(C)展示特征性最小值。發(fā)明詳述
擴(kuò)增效率的隨機(jī)性的量度具有不同的最小值，其可被用作擴(kuò)增的特征性點(diǎn)。在核酸定量的過程中，使用基本閾值法或擬合點(diǎn)法將Ct值賦值(assignment)到擴(kuò)增曲線需人員介入?；谄渥约旱呐袛?，實(shí)驗(yàn)人員必須選擇在指數(shù)階段末端之前到達(dá)的 (在指數(shù)階段末端擴(kuò)增明顯地減慢下來)并進(jìn)一步在本底階段之后到達(dá)的由本底信號(hào)和噪聲控制的信號(hào)閾值水平。因此，就其特性而言，這些方法不適合于自動(dòng)化。相反，最大二階導(dǎo)數(shù)法和S形曲線擬合法包括無人員介入地在曲線上指定特征性點(diǎn)。因此，原則上這些方法對(duì)自動(dòng)化未顯示不適合。但是最近最大二階導(dǎo)數(shù)法和S形曲線擬合法被發(fā)現(xiàn)對(duì)于定量低拷貝數(shù)的靶標(biāo)是不可靠的(JD Durtschi等人Analytical biochemistry 2007 (361) 55—64)。出乎意料地，結(jié)果證明擴(kuò)增效率的隨機(jī)性的量度的圖具有不同的最小值或不同的向最小值的轉(zhuǎn)變。與這個(gè)最小值或向最小值的轉(zhuǎn)變相關(guān)的循環(huán)數(shù)可無人員介入地被賦值為對(duì)于每一個(gè)擴(kuò)增曲線的特征性點(diǎn)，并可被用于可靠地定量核酸包括低拷貝數(shù)靶標(biāo)的定量。
使用擴(kuò)增效率的隨機(jī)性的量度的最小值或向最小值的轉(zhuǎn)變作為特征性點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)源自此點(diǎn)通常定位于指數(shù)階段的早期部分的事實(shí)。因?yàn)閿U(kuò)增效率被多種因素影響，例如PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度、GC含量和潛在的二級(jí)結(jié)構(gòu)及可能存在于擴(kuò)增混合物中的抑制劑，使用在指數(shù)階段早期部分的特征性點(diǎn)是有利的，原因在于在那個(gè)階段擴(kuò)增效率的差異具有有限的影響。另一個(gè)使用擴(kuò)增效率的隨機(jī)性的量度的最小值或向最小值的轉(zhuǎn)變作為特征性點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)源自對(duì)于許多應(yīng)用，期望在單反應(yīng)批中進(jìn)行多于一種核酸的擴(kuò)增的事實(shí)。多重類型分析(每批多于一種靶標(biāo))或使用內(nèi)標(biāo)可因此容易進(jìn)行。這些一管式(one-pot)反應(yīng)的主要優(yōu)勢(shì)是必須操作的反應(yīng)批次更少以及批次中的每種核酸都置于相同的可包含PCR反應(yīng)抑制劑的化學(xué)環(huán)境。對(duì)于這些一管式分析的必要的前提條件是不同標(biāo)記物必須用于每一種核酸，以便分別地監(jiān)控每一種的擴(kuò)增。許多不同的在低濃度下可用于此目的的熒光染料是可得到的。但是，隨著增加濃度，熒光團(tuán)的相互作用可能導(dǎo)致熒光信號(hào)的擾亂，因此降低分析的精確性。為了最小化這樣的熒光團(tuán)相互作用，因此在標(biāo)記的PCR產(chǎn)物濃度相對(duì)低的指數(shù)階段早期部分使用特征性點(diǎn)是有利的。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于定量核酸的方法，其中用于定量的信號(hào)是在擴(kuò)增的指數(shù)階段的早期部分獲得的信號(hào)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增的指數(shù)階段的早期部分被認(rèn)為是以下的一項(xiàng)指數(shù)階段的前半段、指數(shù)階段的前10個(gè)循環(huán)、指數(shù)階段的前5個(gè)循環(huán)、指數(shù)階段的前3個(gè)循環(huán)或指數(shù)階段的第一個(gè)循環(huán)。絕對(duì)和相對(duì)定量
本發(fā)明涉及用于相對(duì)定量核酸的方法，其包括以下步驟
(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，
(b)對(duì)比用核酸的至少一種樣品中的每一種的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與至少一種對(duì)比用核酸中的每一種的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，
(c)獲得的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(d)靶和對(duì)比用核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，
(e)靶和對(duì)比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和對(duì)比用核酸是最小的，
(g)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)通過比較靶和對(duì)比用樣品的Cc，與對(duì)比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對(duì)量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于絕對(duì)定量樣品中的至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟
(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，
(b)已知濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋系列的樣品的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的核酸的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，
(c)獲得的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(d)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，(e)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品是最小的，
(g)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)通過比較靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法，其包括以下步驟
(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增，
(b)同時(shí)獲得關(guān)聯(lián)于至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增的信號(hào)，
(c)獲得的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(d)每一種靶核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，
(e)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，
(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于每一種靶核酸是最小的，
(g)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(h)從Cc值中計(jì)算Ct值。用本領(lǐng)域已知的方法，獲得的Ct值可被用于定量核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于相對(duì)定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸和至少一種對(duì)比用核酸的擴(kuò)增曲線的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(b)靶和對(duì)比用核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，
(c)靶和對(duì)比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，
(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和對(duì)比用核酸是最小的，
(e)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(f)通過比較靶和對(duì)比用樣品的Cc，與對(duì)比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對(duì)量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于絕對(duì)定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸和已知濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋系列的樣品的擴(kuò)增曲線的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(b)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，
(c)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，
(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品是最小的，
(e)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(f)通過比較靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法，其包括以下步驟
(a)獲得的用于至少一種靶核酸的擴(kuò)增曲線的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，
(b)每一種靶核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，
(c)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于每一種靶核酸是最小的，
(e)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，
(f)從Cc值中計(jì)算Ct值。用本領(lǐng)域已知的方法，獲得的Ct值可被用于核酸的定量。根據(jù)本發(fā)明相對(duì)定量核酸涉及在分析前獲得樣品中相應(yīng)核酸的量的比例的定量量度。根據(jù)本發(fā)明絕對(duì)定量核酸涉及在分析前獲得樣品中核酸量的絕對(duì)量度，例如物質(zhì)的拷貝數(shù)或量?？捎糜诒景l(fā)明核酸包含DNA、RNA、及帶有修飾的骨架和/或堿基結(jié)構(gòu)的核酸。通常擴(kuò)增通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲得的方法和設(shè)備的幫助由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行。但是，對(duì)于本發(fā)明的目的，不能直接由PCR擴(kuò)增的核酸可能必須通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法轉(zhuǎn)錄成DNA。例如RNA可能必須在擴(kuò)增前用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成DNA。為了允許重建相應(yīng)核酸的初始量，這樣的轉(zhuǎn)錄過程必須在能夠合理地良好建立關(guān)于轉(zhuǎn)錄成DNA的核酸和在轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的DNA的量的比例的假設(shè)情況下進(jìn)行。此類反應(yīng)條件是本領(lǐng)域眾所周知的。實(shí)施本發(fā)明的過程中擴(kuò)增的每一種核酸通常以選擇的方法擴(kuò)增。PCR中一種完成選擇性擴(kuò)增的方法是使用特異性引物。設(shè)計(jì)和使用這樣的引物是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明，與核酸擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)在擴(kuò)增反應(yīng)過程中被記錄。在擴(kuò)增反應(yīng)的所有循環(huán)的過程中記錄的信號(hào)的表示通常命名為擴(kuò)增曲線。通常這樣的信號(hào)是熒光發(fā)射，但是本領(lǐng)域中使用的其他信號(hào)也包含在本發(fā)明中。一些熒光染料具有充分分開的吸收和發(fā)射譜以允許相同樣品中的平行檢測(cè)。為了本發(fā)明的目的，核酸擴(kuò)增，即通過擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生核酸，通過記錄相關(guān)于核酸擴(kuò)增的信號(hào)來檢測(cè)。這可通過例如當(dāng)結(jié)合到靶標(biāo)上時(shí)發(fā)射特異性信號(hào)的熒光標(biāo)記的雜交探針的方法或允許檢測(cè)雙鏈產(chǎn)物的DNA嵌入式熒光染料的方法來達(dá)到。這樣的熒光標(biāo)記雜交探針和DNA嵌入式熒光染料是本領(lǐng)域眾所周知的。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸擴(kuò)增檢測(cè)用以下至少一項(xiàng)的幫助熒光標(biāo)記雜交探針、FRET雜交探針、分子燈塔、蝎尾引物、Lux引物、Taqman探針、DNA結(jié)合染料。本發(fā)明包含分析核酸的方法和手段。單一分析可涉及單一種類的靶核酸或多于一種的靶核酸。在對(duì)多于一種靶核酸進(jìn)行分析的情況下，記錄的以監(jiān)控每一種靶核酸擴(kuò)增的信號(hào)必須是不同的信號(hào)，即可在同時(shí)被分別記錄的信號(hào)。達(dá)到這樣的信號(hào)的方法和手段是本領(lǐng)域眾所周知的。一些熒光染料(例如其展示充分分開的吸收和發(fā)射譜)允許同時(shí)平行記錄它們的熒光信號(hào)。本發(fā)明因此包含樣品中的幾個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)多重分析。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)比用核酸可被用于確定靶核酸相對(duì)定量的參考值。一種或幾種這樣的對(duì)比用核酸可根據(jù)本發(fā)明被使用。分析前樣品中對(duì)比用核酸的絕對(duì)數(shù)量不必須是已知的。例如細(xì)胞中看家基因的mRNA可被用作對(duì)比用核酸。為了通過PCR擴(kuò)增，mRNA通常預(yù)先轉(zhuǎn)錄成DNA。根據(jù)本發(fā)明，已知濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋系列可被用于確定靶核酸絕對(duì)定量的參考值。靶標(biāo)和核酸標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋樣品可在不同的反應(yīng)批中分析或可同時(shí)在一個(gè)反應(yīng)批中分析。如果同時(shí)在一個(gè)反應(yīng)批中分析，稀釋系列的不同核酸和不同樣品必須用不同的信號(hào) (即可同時(shí)分別記錄的信號(hào))檢測(cè)。在實(shí)施本發(fā)明的過程中，背景項(xiàng)從記錄的信號(hào)中減去。為了完成這樣的背景修正， 線性曲線以擴(kuò)增曲線前幾個(gè)循環(huán)為模型建立，即線性回歸。優(yōu)選地，擴(kuò)增曲線的前10個(gè)循環(huán)被用于建立此線性曲線?？蛇x地，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法可被用于確定適于建立此線性曲線的擴(kuò)增曲線的循環(huán)數(shù)，特別是當(dāng)信號(hào)有噪音時(shí)。隨后，此線性曲線從擴(kuò)增曲線中減去。根據(jù)本發(fā)明，使用如下等式計(jì)算循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率fi : E(C) = [ (C+l) / (C)] - 1
其中
-β=循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率
-C=循環(huán)數(shù)
-=對(duì)背景信號(hào)修正的信號(hào)強(qiáng)度
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用多于2個(gè)連續(xù)循環(huán)的值化來計(jì)算擴(kuò)增效率6，即應(yīng)用平滑。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用3、5或7個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)應(yīng)用平滑化。圖2顯示數(shù)字化計(jì)算的三個(gè)以IO6拷貝/25μ1的DNA初始量開始的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的E(C)曲線。根據(jù)本發(fā)明，計(jì)算循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度(measure of randomness) Μ。譜熵是這樣的隨機(jī)性量度的實(shí)例。譜熵可如下計(jì)算
(1)形成6(C)的數(shù)組，如
ff(C) = [ E (C-L), E(C-L+1), ... ， E(C),…，E(C+L_1), E (C+L)] 其中2L+1是以循環(huán)數(shù)C為中心的數(shù)組中β的數(shù)量。優(yōu)選地L取3或4的值，那么W(C) 具有7或9個(gè)元素。為了不使β的指數(shù)小于1或超過最終可用的擴(kuò)增曲線循環(huán)數(shù)Cmax，C必須在如下范圍中
L < C <= (Cmax-L)；
(2)對(duì)W(C)使用離散傅里葉變換(DFT)以獲得通常是復(fù)質(zhì)的數(shù)組S(C) S(C)= DFT (W(C) } = [ s(l), s (2),…，s(2N-l), s (2N)]
其中2N是DFT大小，并可以是例如16或32 ；
(3)取S(C)的模數(shù)并形成具有其元素的部分的新數(shù)組 P(C) = [|s(2)，s (3)，…，s(N-l)，Is(N)]；
(4)歸一化P(C)的元素的總和到一個(gè)以獲得 Pn (C) =P (C)/sum {P (C)}
其中sum{ }是計(jì)算數(shù)組元素的總和的數(shù)組運(yùn)算符；
(5)計(jì)算數(shù)組Pn(C)的譜熵(M)，如 M (C) =sum {Pn (C) *log2 {Pn (C)}}
其中乘法*和對(duì)數(shù)操作都是元素智能的；
(6)通過將其中心定位在循環(huán)C+1以升級(jí)數(shù)組W(C)并重復(fù)步驟(1)到(5)。以上方法將β (C)的譜熵(M)作為C的函數(shù)計(jì)算。譜熵越小，信號(hào)的隨機(jī)性的程度越低。M通過在擴(kuò)增曲線本底階段后和指數(shù)階段中定位的區(qū)別的最小值特征性化。
本發(fā)明包括使用其它隨機(jī)性量度的實(shí)施方案。例如其他的隨機(jī)性量度是(a)多項(xiàng)式曲線擬合的剩余誤差；(b)零交點(diǎn)計(jì)數(shù)；(c)高通濾波后的能量(RMS)計(jì)算。所有這些方法在上述數(shù)組W(C)上操作。前者方法(a)基于多項(xiàng)式函數(shù)能夠擬合確定性的函數(shù)直到某精確度而不是隨機(jī)的精確度的概念。后面兩個(gè)方法(b)和(c)利用噪聲波動(dòng)多于其平均值附近的確定的信號(hào)的觀察以便產(chǎn)生更多零交點(diǎn)及能量。根據(jù)本發(fā)明，循環(huán)數(shù)Cm被確定，其中M具有其最小值。Cm可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的普通運(yùn)算法則數(shù)字地獲得。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，循環(huán)數(shù)Cm被確定為M第一次到達(dá)其最小值的循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明，特征性循環(huán)數(shù)C。從Cm值中計(jì)算出。進(jìn)行此計(jì)算為了修正用于計(jì)算隨機(jī)性測(cè)量的任何窗口的寬度。如果例如M如上描述的以譜熵計(jì)算，C。通過從Cm中減去L而獲得
Cc _。μ _ L
其中L是數(shù)組W(C)的展式的一半。依賴于用于計(jì)算隨機(jī)性的量度的方法，從Cm中獲得Cc的其它方法對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。本發(fā)明進(jìn)一步包括這樣的實(shí)施方案，其中Cm值被用作C。值，即其中 Cc _ Cm °C。值可用于計(jì)算Ct值(閾值循環(huán)數(shù))，Ct值進(jìn)而可以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方式用于核酸定量(參見例如JD Durtschi等人Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，Ct值通過取C。值作為Ct值，即Ct = C。，從C。值中計(jì)算出。根據(jù)本發(fā)明，確定靶核酸(T)相對(duì)于對(duì)比用核酸(#)的相對(duì)量(R)可通過如下計(jì)算
完成
ρ _ 2(CC(T) 一 ccoo)
其中
-R=靶和對(duì)比用核酸量的比例
-Cc(T)=靶核酸的Cc值
-Cc(#)=對(duì)比用核酸的Cc值
可選地，如果關(guān)于擴(kuò)增效率E的信息可獲得，比例R可計(jì)算為 R = (1 + E)(cc⑴—_。根據(jù)本發(fā)明，通過比較靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的C。值確定樣品中每一種靶核酸的初始量可通過如下完成
從標(biāo)準(zhǔn)樣品中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)樣品的初始濃度相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)樣品的C。值)及使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線從靶標(biāo)的C。值中獲得靶標(biāo)的初始濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以是C。值對(duì)濃度值對(duì)數(shù)的線性函數(shù)。但是，可選的本領(lǐng)域已知的方法也包含在本發(fā)明中。本發(fā)明包含允許以自動(dòng)化的方式進(jìn)行本發(fā)明的方法，即無或很少人員交互(human interaction)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及允許無人員交互地進(jìn)行本發(fā)明方法的方法和裝置。本發(fā)明使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域可得的設(shè)備以無或很少人員交互地進(jìn)行本發(fā)明的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域可得的設(shè)備以無人員交互地進(jìn)行本發(fā)明的方法。
機(jī)器可讀介質(zhì)
本發(fā)明涉及其上已儲(chǔ)存用于進(jìn)行本發(fā)明方法的步驟(C)到(h)的指令的機(jī)器可讀介質(zhì)。分析核酸樣品的儀器
本發(fā)明涉及分析核酸樣品的儀器，其包含含有用于進(jìn)行本發(fā)明方法的信息的機(jī)器可讀記憶裝置。
實(shí)施例實(shí)施例1
將在25μ1體積中由稀釋獲得的106、105、104、IO3UO2拷貝/25μ1濃度的金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus ) DNA樣品(442 Sau3Al基因組片段的5，部分，256個(gè)堿基對(duì)， 在pCR2. 1-T0P0中，從金黃色葡萄球菌ATCC-25923中克隆)在分別的管中通過40個(gè)PCR 循環(huán)在ABI 7099HT版本2. 3實(shí)時(shí)PCR循環(huán)儀上擴(kuò)增。對(duì)于PCR反應(yīng)，使用ABI的Taqman Universal PCR mastermix 禾口 Taqman 探針 FAM—Black Hole Quencher 1。隨后進(jìn) 亍產(chǎn)物擴(kuò)增。獲得的信號(hào)通過從獲得的PCR前10個(gè)循環(huán)的信號(hào)建立線性函數(shù)模型并從每一個(gè)樣品獲得的擴(kuò)增曲線中減去此線性曲線來對(duì)背景信號(hào)進(jìn)行修正。圖3Α顯示獲得的曲線。對(duì)每一個(gè)擴(kuò)增曲線，使用如下等式計(jì)算循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6 (C) E(C) = [ (C+l) / (C)] - 1 其中
-β=循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率
-C=循環(huán)數(shù)
-=對(duì)背景信號(hào)修正的信號(hào)強(qiáng)度。對(duì)于每一個(gè)擴(kuò)增曲線，計(jì)算譜熵作為循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6 (C)的隨機(jī)性的量度 Μ。計(jì)算沿著6(c)曲線的9點(diǎn)的移動(dòng)窗口，反映窗口內(nèi)的數(shù)據(jù)點(diǎn)的隨機(jī)性程度。結(jié)果顯示在圖:3Β中譜熵M對(duì)每一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率β (C)展示了不同的最小值。對(duì)于106、105、IO4UO3和IO2拷貝/25μ1的濃度，得到的Cm值分別是20、23、26、31和34。對(duì)于 106、105、IO4UO3和IO2拷貝/25μ1的濃度，Cc值由Cc = Cm - 4計(jì)算，因此分別是16、19、 22、27和30。針對(duì)分別的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)獲得的Cc值的線性回歸產(chǎn)生R2 = 0. 9908的皮爾森系數(shù)，表明結(jié)果與預(yù)期的線性關(guān)系的很好的吻合性。
權(quán)利要求
1.用于相對(duì)定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，(b)對(duì)比用核酸的至少一種樣品中的每一種的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與至少一種對(duì)比用核酸中的每一種的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，(c)獲得的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，(d)靶和對(duì)比用核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，(e)靶和對(duì)比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和對(duì)比用核酸是最小的，(g)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(h)通過比較靶和對(duì)比用樣品的Cc，與對(duì)比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對(duì)量。
2.用于絕對(duì)定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，(b)已知濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋系列的樣品的擴(kuò)增和同時(shí)獲得與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的核酸的擴(kuò)增相關(guān)的信號(hào)，(c)獲得的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，(d)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，(e)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品是最小的，(g)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(h)通過比較靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量。
3.用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法，其包括以下步驟(a)包含在樣品中的至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增，(b)同時(shí)獲得關(guān)聯(lián)于至少一種靶核酸中的每一種的擴(kuò)增的信號(hào)，(c)獲得的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，(d)每一種靶核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，(e)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，(f)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于每一種靶核酸是最小的，(g)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(h)從Cc值中計(jì)算Ct值。
4.用于相對(duì)定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟(a)獲得的用于至少一種靶核酸和至少一種對(duì)比用核酸的擴(kuò)增曲線的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，(b)靶和對(duì)比用核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，(c)靶和對(duì)比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和對(duì)比用核酸是最小的，(e)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(f)通過比較靶和對(duì)比用樣品的Cc，與對(duì)比用核酸相比，確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的相對(duì)量。
5.用于絕對(duì)定量樣品中至少一種靶核酸的方法，其包括以下步驟(a)獲得的用于至少一種靶核酸和已知濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋系列的樣品的擴(kuò)增曲線的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，(b)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，(c)靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品是最小的，(e)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(f)通過比較靶和標(biāo)準(zhǔn)樣品的C。確定樣品中至少一種靶核酸中的每一種的初始量。
6.用于確定樣品中至少一種靶核酸的Ct值的方法，其包括以下步驟(a)獲得的用于至少一種靶核酸的擴(kuò)增曲線的信號(hào)對(duì)背景信號(hào)做修正，(b)每一種靶核酸的每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的計(jì)算，(c)每一種靶核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率6(C)的隨機(jī)性的量度M的計(jì)算，(d)循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于每一種靶核酸是最小的，(e)從Cm值中計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)Cc，(f)從Cc值中計(jì)算Ct值。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6的方法，其中特征性循環(huán)數(shù)C。被定義為等于相應(yīng)的Cm值(C。=CM) ο
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7的方法，其中所述步驟“循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)于每一種靶核酸是最小的”由以下步驟替代“初始循環(huán)數(shù)Cm的確定，其中M對(duì)靶和對(duì)比用核酸達(dá)到最小值”。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8的方法，其中計(jì)算的隨機(jī)性量度選自譜熵、多項(xiàng)式曲線擬合的剩余誤差、零交點(diǎn)計(jì)數(shù)、高通濾波后的能量(RMS)計(jì)算。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9的方法，其中獲得的信號(hào)是熒光信號(hào)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10的方法，其中核酸擴(kuò)增檢測(cè)用以下至少一項(xiàng)的幫助熒光標(biāo)記雜交探針、FRET雜交探針、分子燈塔、蝎尾引物、Lux引物、TaqMan探針、DNA結(jié)合染料。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11的方法，其中同時(shí)分析樣品中多于一種靶核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到11的方法，其中同時(shí)分析樣品中的一種靶核酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到13的方法，其中所有步驟以完全自動(dòng)化方式進(jìn)行，即無人員交互。
15.機(jī)器可讀介質(zhì)，其上已儲(chǔ)存用于進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求1到3的方法的步驟(c)到(h) 和/或根據(jù)權(quán)利要求4到6的方法的步驟(a)到(f)的指令。
16.用于分析核酸樣品的儀器，其包含含有用于進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求1到14的方法的信息的機(jī)器可讀記憶裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于定量擴(kuò)增的核酸的方法，其包括以下步驟計(jì)算靶和對(duì)比用核酸的循環(huán)到循環(huán)擴(kuò)增效率ê(C)的隨機(jī)性的量度M，-確定循環(huán)數(shù)CM，其中M對(duì)于靶和對(duì)比用核酸是最小的，從CM值計(jì)算特征性循環(huán)數(shù)CC。
文檔編號(hào)G06F19/24GK102395977SQ201080016744
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2010年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月16日
發(fā)明者尹 B., A. 卡爾曼 J., 尼森 T. 申請(qǐng)人:皇家飛利浦電子股份有限公司