專利名稱：用于紫外線掃描規(guī)劃的方法和裝置的制作方法
用于紫外線掃描規(guī)劃的方法和裝置
背景技術(shù)：
在制備的組織樣本用于顯微分析的醫(yī)學成像中，需要首先定位固體載體上的組織。為了最有效地使組織切片(tissue section)成像，系統(tǒng)必須首先確切地知道組織位于該固體載體上什么地方。在最簡單的描述中，系統(tǒng)必須查看整個固體載體并且識別那部分是組織、哪部分是玻璃、標簽和碎片。然后將組織位點轉(zhuǎn)換到區(qū)域包絡(luò)線。然后在顯微鏡載物臺的位置空間中映射該區(qū)域的坐標。這允許對顯微鏡運動編程以覆蓋該固體載體的適當區(qū)域，并且避免浪費沒有組織存在的區(qū)域。該技術(shù)通常稱為掃描規(guī)劃。盡管在分析期間直接提取關(guān)于組織位點的信息可是優(yōu)選的，標準基準的使用由于載玻片到載玻片和操作員到操作員的變化性而成問題。基于組織的掃描規(guī)劃通常是優(yōu)選的，因為它允許更可重復和可靠的規(guī)劃同時避免要求特殊的載玻片或特定的安裝技術(shù)。對于掃描規(guī)劃的典型方法牽涉在相對低的放大率(例如1. 25x)進行完整固體載體的粗掃描以便定位組織，該組織被數(shù)字化并且重構(gòu)以在更詳細的分析之前向用戶提供樣本的放大圖像。目前的方法通常依靠顏色或紋理來區(qū)分組織與固體載體。這些方法存在若干潛在問題，因為它們可能在載玻片上碰到墨水或雜散標記以及在一些載玻片的邊緣上的基準交叉影線。在用熒光染料標記組織的情況下，圖像采集時間通常是慢的；存在可能性是染色的組織樣本可在成像過程完成之前經(jīng)歷光漂白。此外，當用熒光染料對組織染色時，通常染料必定會局部化在組織的特定亞區(qū)并且不完全覆蓋組織，這使得難以準確區(qū)分組織和非組織，這一點當使用例如在明視場成像中可見的蘇木精和曙紅(H&E)等其他染料時是可能的。因此，熒光染料必需其他檢測方法。最終，目前的方法典型地沒有很好地對未染色組織切片起作用，因為薄的組織切片在可見光中基本上是透明的并且因此沒有提供足夠的信號信息來準確處理。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面中，本發(fā)明提供用于定位安置在固體載體上的一個或多個大致上圓形的組織樣本的方法。該方法牽涉以下步驟傳送預選波長的光到組織樣本上，其中該光誘導該組織樣本自發(fā)熒光；使用該自發(fā)熒光的光來識別該組織樣本的中心位點；使用X、y坐標系使在該固體載體上的該組織樣本的中心位點的坐標相關(guān)；并且映射該固體載體上的該組織樣本的坐標以區(qū)分包含組織樣本的區(qū)域與固體載體上的空白區(qū)域。在第二方面中，本發(fā)明提供用于定位安置在固體載體上的一個或多個大致上圓形的組織樣本的裝置。該裝置包括成像顯微鏡，其具有至少一個物鏡以在不同的放大率采集圖像和載物臺以將樣本托在固體載體上；激發(fā)源以照射載物臺上的樣本；連接到該顯微鏡以采集樣本圖像并且使樣本圖像數(shù)字化的數(shù)字圖像裝置；與該數(shù)字圖像裝置通信能夠存儲數(shù)字化的樣本圖像的存儲裝置；和與該存儲裝置通信并且能夠?qū)?shù)字圖像分類以及能夠基于相關(guān)因子產(chǎn)生一個或多個匹配濾波器(match filter)的處理器。


當下列詳細說明參照附圖(其中類似的符號在整個附圖中表示類似的部件)閱讀時，本發(fā)明的這些和其他特征、方面和優(yōu)勢將變得更好理解，其中圖1是體現(xiàn)本發(fā)明的圖像采集和分析的多步驟方法的示意圖。圖2是基于本發(fā)明的實施例示出使用屏蔽濾波器在x、y方向采集圖像的組織微陣列的示意圖示。圖3是能夠定位固體載體上的組織樣本的自動化系統(tǒng)的圖示。
具體實施例方式下列詳細說明是示范性的并且不意在限制本申請的發(fā)明和本發(fā)明的使用。此外， 意圖不在于，本發(fā)明被本發(fā)明的前述背景或附圖的下列詳細說明中提出的任何理論限制。根據(jù)一個實施例，描述其中使用自發(fā)熒光來確定大致上圓形的組織樣本在固體載體上的位點的方法。在一個實施例中，該方法包括使用引起自發(fā)熒光的近UV光來照射組織樣本。自發(fā)熒光指當組織或組織樣本內(nèi)的內(nèi)源性化合物在缺乏對任何外源性熒光化合物管理和束縛下暴露于光子的外源時在由這些內(nèi)源性化合物發(fā)射的光子的能量和幅度，這不同于遵循這樣的熒光化合物的管理和束縛并且暴露于光子的外源時發(fā)射的輻射。該光子能量典型地在UV或可見光范圍中。使用標準照相透鏡來獲得經(jīng)歷自發(fā)熒光的組織樣本的宏觀圖像(macro-image) 以便在單個圖像中捕捉整個固體載體，其包括任何識別標記。這些識別標記大體上指固體載體上的指示物，例如安置在固體載體的邊緣或角落處的交叉影線標記。固體載體可包括，但不限于顯微鏡載玻片、組織微陣列載玻片或微量滴定板。在任何熒光標記之前照射樣本。一旦獲得組織圖像，其就被處理以識別組織樣本在固體載體上的位點。圖1圖示可采用以采集用于在本發(fā)明的某些實施例中使用的圖像的示范性技術(shù)。 圖1示出圖像采集和分析的多步驟方法的示意圖，其包括傳送預選波長的光到固體載體上的組織樣本上，其中該光誘導該組織樣本自發(fā)熒光；使用該自發(fā)熒光的光來識別該組織樣本的中心位點；使這些中心位點與該組織樣本的先前存在的模板相關(guān)以創(chuàng)建第二數(shù)字圖像，其對該數(shù)字圖像的每個區(qū)指定像素值；創(chuàng)建二維坐標系；以及使用這些像素值映射固體載體上的該組織樣本的坐標以區(qū)分包含組織樣本的區(qū)域與固體載體上的空白區(qū)域。在第一步驟中，方法包括使用引起自發(fā)熒光的近UV光來照射固體載體上的大致上圓形的組織樣本。在一個實施例中，標準汞鹵化物燈可用作光源。大致上圓形指其中從沿著組織樣本的外邊界的點到樣本內(nèi)的質(zhì)心點的距離是具有類似的長度，造成被認為是圓形圖案的組織樣本。該質(zhì)心點對應(yīng)于組織樣本的中心位點。這樣的圓形圖案在1998年10 月的美國 Proc. Natl. Acad. Sci.的卷 95、頁 12783-12786 中描述。大致上圓形的組織樣本可包括例如包含在組織微陣列(TMA)上的組織樣本、活檢組織樣本或生物樣本等任何組織物質(zhì)。組織樣本可用例如福爾馬林等組織防腐劑來冷凍或固定或另外處理。組織樣本可染色或未染色以便提高在可見光中的對比度。在一些實施例中，組織樣本可以是整個細胞、細胞成分、細胞離心涂片(cytospin)或細胞涂片。組織樣本可包括可具有相似功能的從生物對象的組織獲得的相似細胞的集合。在一些實施例中，組織樣本可包括從人體組織獲得的相似細胞的集合。人體組織的適合的示例包括，但不限于 (1)上皮；( 結(jié)締組織，其包括血管、骨骼和軟骨；C3)肌肉組織；和(4)神經(jīng)組織。組織樣本的源可以是從新鮮、冷凍和/或保存的器官或組織樣本或活檢或抽吸物獲得的固體組織；血液或任何血液成分；例如腦脊髓液、羊水、腹腔液或間質(zhì)液等體液；或在任何時間來自懷孕或?qū)ο蟀l(fā)育中的細胞。在一些實施例中，組織樣本可包括原或培養(yǎng)的細胞或細胞系。在一些實施例中，組織樣本包括來自健康或患病組織的組織切片(例如，來自結(jié)腸、乳腺組織、前列腺的組織切片)。組織樣本可包括組織切片的單部分或片，例如從組織切片切割的組織的薄片或細胞。在一些實施例中，組織樣本的相同切片可在形態(tài)和分子兩者上分析。組織樣本可永久或暫時地粘附在固體載體上以便允許在制備和成像過程中對它分析、轉(zhuǎn)移和使其移動。固體載體可包括載玻片、微量滴定板、盤、皮氏培養(yǎng)皿、凝膠板或卡盒(block cassette) 0固體載體可由玻璃、塑料或其他材料制成。組織樣本還可以是組織微陣列(TMA)的一部分。如此，組織樣本是包含在試驗井 (test well)(其設(shè)置在單個微陣列載玻片上)內(nèi)的多個樣本中的一個。試驗井的數(shù)量以及因此單個載玻片上的個體組織樣本的數(shù)量取決于陣列設(shè)計而變化。例如，TMA可設(shè)計使得每個個體組織樣本包括圓形試驗井，其直徑0. 6mm、間隔0. 7-0. 8mm，這導致每個組織樣本的表面積為0. ^2mm2。在第二步驟中，自發(fā)熒光的光用于捕捉樣本的數(shù)字圖像。在一些實施例中，在低放大率下使用標準照相透鏡在單個圖像中捕捉固體載體上的組織樣本的完整圖像，這可是可取的。在一些備選實施例中，可只捕捉固體載體的一部分。單個圖像還可包括固體載體上的識別標記，例如粘膠標簽或交叉影線標記?？稍跇颖镜娜魏螣晒鈽擞洶l(fā)生前照射樣本。例如DAPI等非熒光染料和指示物可在圖像捕捉過程之前施加于樣本，假設(shè)染料不干擾樣本的自發(fā)熒光。圖像捕捉過程可包括使用照相機，其包括處理器和鏡頭。該處理器配置成從鏡頭接收光從而引起數(shù)字圖像。在第三步驟中，處理來自照相機的組織樣本的數(shù)字圖像以便將數(shù)字圖像與模板圖像(其包含組織樣本的大小和形狀的簡化表示)比較。在組織樣本是組織微陣列的一部分的情況下，模板圖像代表設(shè)置在試驗井中的每個個體組織樣本的數(shù)量和位點。在一個實施例中，比較數(shù)字圖像與模板圖像。將實際組織圖像與模板圖像比較的過程提供二維像素圖像作為輸出，該二維像素圖像可按比例繪制并且記錄，并且其包括組織樣本的中心位點。比較的過程可牽涉在空間域中在數(shù)字圖像和模板圖像之間使用零均值交叉關(guān)聯(lián)、歸一化功率譜密度(PSD)交叉相關(guān)或其的組合。如果組織樣本是由試驗井組成的TMA，因而發(fā)生的二維比較像素圖像可產(chǎn)生位于每個TMA試驗井的中心處的亮點。該亮點中心位點可轉(zhuǎn)換成由顯微鏡載玻片定義的坐標空間中的二維網(wǎng)格。該二維網(wǎng)格可以是笛卡爾坐標系，其中兩個軸互相成直角而定義平面(xy 平面)。如在圖1中進一步示出的，在一個實施例中，在第四步驟中比較過程產(chǎn)生雙色匹配濾波器圖像，其對應(yīng)于固體載體上的組織樣本的像素大小。雙色匹配濾波器是設(shè)計成代表物體(其待識別或從另一個數(shù)字圖像中待提取)的理想化樣式(在空間或譜坐標中)的二維數(shù)字構(gòu)成。在其中組織樣本是由試驗井組成的TMA的一部分的情況下，匹配濾波器可用于處理TMA圖像，創(chuàng)建每個組織樣本的宏觀圖像。雙色匹配濾波器可以是在黑色背景上的白色圖像，其中該白色圖像在像素中的大小對應(yīng)于在組織樣本的像素中的大小。在某些實施例中，組織樣本的宏觀圖像使用零均值交叉相關(guān)創(chuàng)建，其中組織樣本的數(shù)字圖像的空間像素值基于強度而記分并且轉(zhuǎn)換成譜域圖像。適合的譜域變換包括傅里葉變換、小波變換、離散傅里葉變換、離散余弦變換、歸一化功率譜密度計算或相似的系列代表。在某些實施例中，例如快速傅里葉變換(FFT)等圖像變換功能在匹配濾波器和試驗樣本圖像兩者上進行。可生成新的圖像，其中基于對匹配濾波器圖像的最佳適配分析對每個像素指定強度值。知道TMA試驗井的尺寸和數(shù)量，操作員可確定全部捕捉TMA所需要的圖像捕捉或視場的數(shù)量，并且，在如在圖1中示出的第五步驟中，可創(chuàng)建掃描規(guī)劃，其對于來自每個圖像捕捉中的捕捉給出坐標系列。例如，將需要2X2個圖像捕捉集的組織陣列當計算四個圖像捕捉中的每個的坐標時以中心點作為參考。假定(x，y)是TMA的中心并且w是一個捕捉的寬度，輸出坐標將是(x-w/2, y-w/2), (x+w/2, y-w/2), (x+w/2, y+w/2)和(x-w/2, y+w/2) TMA坐標空間中的網(wǎng)格可用于使陣列成像用于定性或定量分析。圖2是示出使用基于笛卡爾坐標系的掃描規(guī)劃的x-y方向的圖像采集的組織微陣列的示意圖示，其中X和y是定義X、y平面的兩個互相垂直的有向直線。在一個實施例中，可通過首先確定閾值以區(qū)分足以強到成為TMA試驗井中心的亮點與不是中心的那些亮點而產(chǎn)生掃描規(guī)劃。起始于最大強度的點，算法可用于迭代挑選區(qū)域并且將其指定為單個試驗井的中心點。環(huán)繞該中心點的區(qū)域(其對應(yīng)于試驗井的預測直徑)被遮光。對接近亮點的區(qū)域遮光的目的是防止對單個點選擇若干“中心”。然后挑選次最高像素強度的區(qū)域并且重復該過程直到對于亮點分析整個顯微鏡載玻片為止。基于關(guān)于來自顯微鏡的圖像捕捉的大小以及亮點的大小與數(shù)量的輸入，算法對于每個預測的TMA試驗井輸出坐標。對這些坐標排序，這創(chuàng)建掃描規(guī)劃使得載物臺移動最小化。例如，該掃描規(guī)劃可從位于TMA左邊的底部上的試驗井開始(當你俯視載玻片時)，并且來回蜿蜒穿過成行的試驗井、向著TMA載玻片的頂部工作。對于每個試驗井，相似的迂回圖案用于節(jié)省運動。如在圖2中示出的，顯微鏡載物臺可基于笛卡爾坐標系(X，y平面)移動以允許 TMA30的掃描成像從左底部32上的試驗井開始并且在迂回圖案36中來回移動穿過這些行、 向著TMA34的頂部工作。圖像采集基于如由實線表示的掃描規(guī)劃而發(fā)生。如在圖3中示出的，自動化系統(tǒng)10可用于實施本文描述的方法。如圖示的，該系統(tǒng)10可包括成像顯微鏡12和激發(fā)源14、數(shù)字圖像裝置16、用于至少暫時存儲一個或多個圖像的存儲裝置18和將圖像分類并且基于相關(guān)因子產(chǎn)生一個或多個匹配濾波器的處理器 20。成像顯微鏡12可具有至少一個物鏡13以在不同的放大率采集圖像以及載物臺15 以托住安裝在固體載體上的組織樣本17。該載物臺用于將要觀察的樣本安置在該固體載體上的特定位點處。激發(fā)源14包括用于使用近UV光來照射該固體載體上的該組織樣本從而引起自發(fā)熒光的光源。數(shù)字圖像裝置16可由數(shù)字照相機(未示出)組成以在自發(fā)熒光期間采集組織樣本的圖像。圖像裝置16優(yōu)選地能夠自動對焦并且然后在整個處理中根據(jù)需要維持和跟蹤焦點特征。存儲裝置18可包括，但不必限于與處理器20關(guān)聯(lián)的任何適合的硬驅(qū)動存儲器，例如R0M(只讀存儲器)、RAM(隨機存取存儲器)或DRAM (動態(tài)隨機存取存儲器)，或任何適合的盤驅(qū)動存儲裝置，例如DVD或CD，或zip驅(qū)動器或存儲器卡等。存儲裝置可遠離處理器 20設(shè)置并且仍可通過任何適合的連接裝置或通信網(wǎng)絡(luò)訪問，這些連接裝置或通信網(wǎng)絡(luò)包括但不限于局域網(wǎng)、電纜網(wǎng)、衛(wèi)星網(wǎng)絡(luò)和因特網(wǎng)，無論是硬連線或無線均可。處理器20可以是CPU(中央處理單元)并且可包括微處理器、微控制器和數(shù)字信號處理器(DSP)。系統(tǒng)10可進一步包括用于顯示一個或多個圖像的顯示裝置22和用于傳送數(shù)字信息的傳送裝置(未示出)。該顯示裝置22可包括能夠顯示數(shù)字圖像的任何適合的裝置，例如但不限于包含LCD或CRT的裝置。該傳送裝置可包括用于在通信網(wǎng)絡(luò)(其包括但不限于硬連線或無線數(shù)字通信系統(tǒng))上傳送數(shù)字信息的任何適合的部件。在實施例的一個中，系統(tǒng)可被包含作為自動化高吞吐量系統(tǒng)等分析裝置(其能夠在一個系統(tǒng)中使TMA染色和成像并且仍進一步分析圖像)的組成部分。如此，在一個實施例中，系統(tǒng)能夠使用各種光學系統(tǒng)(其包括自發(fā)熒光范圍外的那些，例如明場成像)來照射樣本并且捕捉數(shù)字圖像。在再另一個實施例中，自動化系統(tǒng)可包括計算機可讀介質(zhì)，其可包括用于分析自發(fā)熒光的自動化技術(shù)的指令。盡管本文僅圖示和描述本發(fā)明的某些特征，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將想到許多修改和改變。因此，要理解附上的權(quán)利要求意在涵蓋所有這樣的修改和改變，它們落入本發(fā)明的真正精神內(nèi)。
權(quán)利要求
1.用于定位安置在固體載體上的大致上圓形的組織樣本的方法，其包括傳送預選波長的光到組織樣本上，其中所述光誘導所述組織樣本自發(fā)熒光；使用所述自發(fā)熒光的光來識別所述組織樣本的中心位點；使用二維坐標系使所述固體載體上的所述組織樣本的所述中心位點的坐標相關(guān)；和映射所述固體載體上的所述組織樣本的所述坐標以區(qū)分包含組織樣本的區(qū)域與所述固體載體上的空白區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述識別步驟包括捕捉來自所述組織樣本的所述自發(fā)熒光的光以創(chuàng)建所述組織樣本的數(shù)字圖像。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述相關(guān)步驟包括對來自所述組織樣本的所述自發(fā)熒光的光的像素值記分。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中像素值的所述記分包括將所述組織樣本的所述數(shù)字圖像的空間像素信息轉(zhuǎn)換成譜域圖像。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述譜域圖像使用所述組織樣本的所述數(shù)字圖像的快速傅里葉變換而生成。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述相關(guān)步驟進一步包括將所述組織樣本的所述數(shù)字圖像與所述固體載體的模板圖像比較。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述固體載體的所述模板圖像是譜域圖像。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述固體載體的所述譜域圖像使用陣列的空間圖像的快速傅里葉變換而生成。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述相關(guān)步驟包括將所述組織樣本的所述數(shù)字圖像的空間像素信息轉(zhuǎn)換成譜域圖像；將所述固體載體的所述數(shù)字圖像的所述空間像素信息轉(zhuǎn)換成所述固體載體的譜域圖像；使用所述組織樣本的譜域圖像和所述固體載體的譜域圖像的倍增因子創(chuàng)建復合譜域圖像。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述倍增因子包括零均值交叉相關(guān)、歸一化功率譜密度(PSD)交叉相關(guān)或其組合。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其進一步包括將所述復合譜域圖像變換為空間域圖像。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其進一步包括將所述空間域圖像變換為由水平和垂直軸定義的二維坐標系。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組織樣本安裝在組織微陣列上。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述組織微陣列包含超過一個組織樣本。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中掃描整個固體載體。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中預選波長是365nm。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括將熒光標簽施加到所述組織樣本并且使用在所述映射步驟中獲得的所述組織樣本的所述坐標來掃描所述組織樣本。
18.一種用于定位安置在固體載體上的大致上圓形的組織樣本的裝置，其包括成像顯微鏡，其具有至少一個物鏡以在不同的放大率采集圖像，以及具有載物臺以托住組織樣本；激發(fā)源，用于照射所述載物臺上的所述組織樣本；連接到所述顯微鏡以采集所述組織樣本的所述圖像并且使所述組織樣本的所述圖像數(shù)字化的數(shù)字圖像裝置；與所述數(shù)字圖像裝置通信而能夠存儲所述組織樣本的數(shù)字化圖像的存儲裝置；和與所述存儲裝置通信并且能夠?qū)⑺鰯?shù)字圖像分類以及基于相關(guān)因子產(chǎn)生一個或多個匹配濾波器的處理器。
19.如權(quán)利要求18所述的裝置，其進一步包括用于顯示所述圖像中的一個或多個的顯示裝置和用于傳送數(shù)字信息到遠程位點的傳送裝置中的至少一個。
20.如權(quán)利要求18所述的裝置，其進一步包括控制器和機器可讀介質(zhì)，其包括指令，該指令當由所述控制器執(zhí)行時使裝置定位安置在固體載體上的大致上圓形的組織樣本。
21.如權(quán)利要求18所述的裝置，其中所述裝置被包含作為分析裝置的組成部分。
22.如權(quán)利要求21所述的裝置，其中所述分析裝置能夠使組織微陣列染色和成像。
全文摘要
本發(fā)明提供用于定位安置在固體載體上的一個或多個大致上圓形的組織樣本的方法。該方法包括以下步驟傳送預選波長的光到組織樣本上，其中該光誘導該組織樣本自發(fā)熒光；使用該自發(fā)熒光的光來識別該組織樣本的中心位點；使用x、y坐標系使該固體載體上的該組織樣本的中心位點的坐標相關(guān)；和映射該固體載體上的該組織樣本的坐標以區(qū)分包含組織樣本的區(qū)域與該固體載體上的空白區(qū)域。在第二方面中，本發(fā)明提供用于定位安置在固體載體上的一個或多個大致上圓形的組織樣本的裝置。
文檔編號G06T7/00GK102449529SQ201080024617
公開日2012年5月9日 申請日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月29日
發(fā)明者C·C·羅伊斯, K·B·肯尼, R·W·泰特, R·費爾金斯 申請人:通用電氣公司