專利名稱：細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)分析的制作方法
細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)分析交叉引用本申請(qǐng)要求2009年9月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/240，613號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)以引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
許多病狀的特征在于細(xì)胞途徑的失調(diào)，其導(dǎo)致，例如，細(xì)胞過(guò)程的異?？刂?，后者具有不受控的生長(zhǎng)和增高的細(xì)胞存活率。這些失調(diào)通常由參與細(xì)胞途徑的分子活性 的變化所導(dǎo)致。例如，特定信號(hào)傳導(dǎo)途徑的改變已被描述于眾多癌癥。現(xiàn)今通過(guò)在單一同源細(xì)胞群體中分析這些失調(diào)而對(duì)病狀進(jìn)行診斷。但是，不同類型的細(xì)胞與其他不同類型的細(xì)胞共存于復(fù)雜的周邊環(huán)境之中，這可能會(huì)影響病狀的病理學(xué)。因此，對(duì)病狀的成功診斷和治療方法的成功使用可能需要對(duì)在多種不同的細(xì)胞和細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中影響所述病狀病理學(xué)的細(xì)胞事件的了解。因此，存在對(duì)病狀失調(diào)的基于生物學(xué)的臨床相關(guān)分析的需求，其可預(yù)測(cè)個(gè)體的疾病階段。這一根據(jù)不同的分離的細(xì)胞群體和/或環(huán)境輸入的分析將提供病狀的病理學(xué)的完整描述，因此，其通過(guò)在個(gè)體患者水平上更為可靠的預(yù)后和療法選擇而對(duì)臨床醫(yī)生進(jìn)行輔助。

發(fā)明內(nèi)容
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及測(cè)定個(gè)體狀態(tài)的方法，其通過(guò)a)使來(lái)自所述個(gè)體的第一細(xì)胞群體的第一細(xì)胞至少與第一調(diào)節(jié)劑進(jìn)行接觸山)使來(lái)自所述個(gè)體的第二細(xì)胞群體的第二細(xì)胞至少與第二調(diào)節(jié)劑進(jìn)行接觸；c)在所述第一細(xì)胞和所述第二細(xì)胞內(nèi)測(cè)定至少一種可激活元件的激活水平；d)為所述個(gè)體創(chuàng)建包括所述可激活元件的測(cè)定的激活水平的響應(yīng)表單(response panel);以及e)辨識(shí)所述個(gè)體的狀態(tài)，其中所述辨識(shí)根據(jù)所述響應(yīng)表單而進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步包括根據(jù)所述響應(yīng)表單而對(duì)所述第一細(xì)胞和所述第二細(xì)胞之間因果關(guān)聯(lián)進(jìn)行的測(cè)定，其中所述因果關(guān)聯(lián)是細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的指征。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步包括對(duì)響應(yīng)表單和/或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)應(yīng)用分類器，其中所述分類器包括一組激活水平值，并且其中所述分類器被用于測(cè)定該響應(yīng)表單和/或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)是否與所述個(gè)體狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括根據(jù)所述響應(yīng)表單產(chǎn)生分類數(shù)值，其中所述分類數(shù)值明確了所述個(gè)體是否與該個(gè)體的狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體的狀態(tài)是病狀的分類、診斷或預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，所述病狀的分類、診斷或預(yù)后中的AUC值高于0. 6。在一些實(shí)施方案中，所述病狀的分類、診斷或預(yù)后中的P值低于0. 05。在一些實(shí)施方案中，所述病狀的分類、診斷或預(yù)后中的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)高于80%。在一些實(shí)施方案中，所述病狀的分類、診斷或預(yù)后中的陰性預(yù)測(cè)值(NPV)高于 80%。在一些實(shí)施方案中，所述第一調(diào)節(jié)劑和所述第二調(diào)節(jié)劑選自生長(zhǎng)因子、絲裂原、細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子調(diào)節(jié)劑、激素、小分子、多核苷酸、抗體、天然化合物、內(nèi)酯、化療齊U、免疫調(diào)節(jié)劑、碳水化合物、蛋白酶、離子、活性氧物質(zhì)和放射物。在一些實(shí)施方案中，所述第一調(diào)節(jié)劑與所述第二調(diào)節(jié)劑相同。在一些實(shí)施方案中，所述第一細(xì)胞的接觸和所述第二細(xì)胞的接觸在同一培養(yǎng)物中進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述第一調(diào)節(jié)劑不同于所述第二調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，所述第一細(xì)胞的接觸和所述第二細(xì)胞的接觸在分開的培養(yǎng)物中進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述第一細(xì)胞的接觸和/或所述第二細(xì)胞的接觸在該第一細(xì)胞和/或第二細(xì)胞從所述個(gè)體中分離之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述激活水平基于選自下列的激活狀態(tài)細(xì)胞外蛋白酶暴露、新異寡聚體形成、糖基化狀態(tài)、磷酸化狀態(tài)、乙?；癄顟B(tài)、甲基化狀態(tài)、生物素化狀態(tài)、谷氨?；癄顟B(tài)、甘氨?；癄顟B(tài)、羥基化狀態(tài)、異構(gòu)化狀態(tài)、異戊烯化狀態(tài)、豆蘧?；癄顟B(tài)、脂化狀態(tài)、磷酸泛酰巰基乙胺基化(phosphopantetheinylation)狀態(tài)、硫酸化狀態(tài)、ISG化狀態(tài)、亞硝基化狀態(tài)、棕櫚酰化狀態(tài)、SUMO化狀態(tài)、泛素化狀態(tài)、類泛素化狀態(tài)、瓜氨酸化狀態(tài)、脫酰胺基狀態(tài)、二硫鍵形成狀態(tài)、蛋白酶水解切割狀態(tài)、轉(zhuǎn)位狀態(tài)、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)(proteinturnover)的變化、多蛋白復(fù)合物狀態(tài)、氧 化狀態(tài)、多脂質(zhì)復(fù)合物、以及細(xì)胞膜的生化變化。在一些實(shí)施方案中，所述激活狀態(tài)是磷酸化狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，所述可激活元件選自蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、核酸和代謝物。在一些實(shí)施方案中，所述可激活元件是能夠被磷酸化和/或去磷酸化的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在所述第一細(xì)胞和/或第二細(xì)胞內(nèi)測(cè)定一種或更多種細(xì)胞表面標(biāo)記物、細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物或其組合的存在與否。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞表面標(biāo)記物和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物獨(dú)立地選自蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、核酸和代謝物。在一些實(shí)施方案中，對(duì)一種或更多種細(xì)胞表面標(biāo)記物或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物存在與否的測(cè)定包括對(duì)所述細(xì)胞表面標(biāo)記物或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的激活和非激活狀態(tài)下的表位的存在與否均進(jìn)行測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體的狀態(tài)基于所述可激活元件的激活水平以及基于一種或更多種細(xì)胞表面標(biāo)記物、細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物或其組合的存在與否兩者。在一些實(shí)施方案中，所述激活水平通過(guò)一種方法而進(jìn)行測(cè)定，該方法包括與特異于所述特定可激活元件的特定激活狀態(tài)的結(jié)合元件進(jìn)行結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合元件包括抗體。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合元件為可識(shí)別標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，所述可識(shí)別標(biāo)記的結(jié)合元件是用可檢測(cè)的標(biāo)記物直接標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，所述可檢測(cè)的標(biāo)記物選自放射性同位素、重同位素、熒光劑、FRET標(biāo)記物、酶、微粒和化學(xué)發(fā)光物。在一些實(shí)施方案中，所述激活水平的檢測(cè)步驟包括使用流式細(xì)胞儀、免疫熒光、共聚焦顯微鏡法、免疫組織化學(xué)、免疫電子顯微鏡法、核酸擴(kuò)增、基因陣列、蛋白質(zhì)陣列、質(zhì)譜、膜片鉗技術(shù)、二維凝膠電泳、差示凝膠電泳、基于微球的多元蛋白質(zhì)分析(microsphere-based multiplex protein assays)、ELISA 以及無(wú)標(biāo)記物細(xì)胞分析，用以在單個(gè)細(xì)胞中測(cè)定一種或更多種細(xì)胞內(nèi)可激活元件的激活水平。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定所述激活水平的步驟包括使用流式細(xì)胞儀。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)定步驟是定量的。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)定步驟是相對(duì)于對(duì)照值進(jìn)行的。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)照值被包括在所述響應(yīng)表單之內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體的狀態(tài)是病狀的分類、診斷、預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，所述病狀是免疫性疾病、惡性或增殖性疾病或其組合。在一些實(shí)施方案中所述病狀是惡性疾病。在一些實(shí)施方案中，所述惡性疾病是實(shí)體腫瘤或惡性血液病。在一些實(shí)施方案中，所述惡性疾病是非B細(xì)胞系來(lái)源的。在一些實(shí)施方案中，所述非B細(xì)胞系來(lái)源的惡性疾病選自急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、非B細(xì)胞淋巴瘤、骨髓增生異常、骨髓增殖失調(diào)、骨髓纖維變性、紅血球增多、血小板增多和非B細(xì)胞非典型性免疫性淋巴細(xì)胞增生(non-B cellatypical immune lymphoproliferation)。在一些實(shí)施方案中，所述非B細(xì)胞系來(lái)源的惡性疾病是AML。
在一些實(shí)施方案中，所述惡性疾病是B細(xì)胞來(lái)源的或B細(xì)胞系來(lái)源的失調(diào)。在一些實(shí)施方案中，所述惡性疾病是選自下列的B細(xì)胞來(lái)源的或B細(xì)胞系來(lái)源的失調(diào)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、B淋巴細(xì)胞系白血病、B淋巴細(xì)胞系淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和漿細(xì)胞失調(diào)。在一些實(shí)施方案中，所述B細(xì)胞來(lái)源的或B細(xì)胞系來(lái)源的失調(diào)是CLL。在一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體的狀態(tài)是對(duì)病理前或病理病狀的治療的預(yù)測(cè)性響應(yīng)，或是對(duì)病理前或病理病狀的治療的響應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)病理前或病理病狀的治療響應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定了所述第一和/或第二細(xì)胞中的多個(gè)細(xì)胞內(nèi)可激活元件的激活水平。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)特征對(duì)來(lái)自細(xì)胞群體的活性狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的方法，所述方法包括提供包括內(nèi)存和處理器的計(jì)算機(jī)；辨識(shí)與個(gè)體相關(guān)聯(lián)的活性狀態(tài)數(shù)據(jù)，其中所述活性狀態(tài)數(shù)據(jù)來(lái)自采樣于個(gè)體的至少兩種分離的細(xì)胞群體；產(chǎn)生分類數(shù)值，其中所述分類數(shù)值明確了該個(gè)體與對(duì)所述激活狀態(tài)所使用的分類器進(jìn)行響應(yīng)的健康狀態(tài)是否具有關(guān)聯(lián)；其中所述分類器包括一組激活狀態(tài)值，所述激活狀態(tài)值被用于測(cè)定不同的分離的細(xì)胞群體中的細(xì)胞是否與所述狀態(tài)相關(guān)聯(lián)；以及將所述分類數(shù)值存儲(chǔ)于該計(jì)算機(jī)的內(nèi)存之中。在一些實(shí)施方案中，所述分類數(shù)值代表以下一種或更多種診斷、預(yù)后和對(duì)治療的預(yù)測(cè)性響應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)來(lái)自于第三方，并且所述方法進(jìn)一步包括將分類數(shù)值傳送給所述第三方。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括根據(jù)可激活元件所關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)的至少第一水平，辨識(shí)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)是否與分離的第一細(xì)胞群體或不同的第二細(xì)胞群體相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)是否與所述分離的第一細(xì)胞群體或所述不同的第二細(xì)胞群體相關(guān)聯(lián)的辨識(shí)包括根據(jù)所述可激活元件所關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)的至少第一水平對(duì)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行門控(gating)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)是否與所述分離的第一細(xì)胞群體或所述分離的第二細(xì)胞群體相關(guān)聯(lián)的辨識(shí)包括根據(jù)可激活元件所關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)的至少第一水平對(duì)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代分組(iteratively binning)。在一些實(shí)施方案中，所述分離的第一細(xì)胞群體是一種稀少的細(xì)胞群體，并且所述分離的第一細(xì)胞群體被識(shí)別為根據(jù)可激活元件所關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)的至少第一水平響應(yīng)于對(duì)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)所進(jìn)行的迭代分組。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括產(chǎn)生所述分類器，其產(chǎn)生根據(jù)來(lái)自已知與所述狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的多個(gè)分離的細(xì)胞群體和已知不與所述狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的多個(gè)分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)一步與多個(gè)時(shí)間點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，并且所述分類器的產(chǎn)生進(jìn)一步包括建立隨不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)的模型，其中所述模型代表所述異源細(xì)胞群體之間隨多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的通訊；根據(jù)所述模型產(chǎn)生一系列的描述性數(shù)值；根據(jù)所述一系列的描述性數(shù)值產(chǎn)生所述分類器。在一些實(shí)施方案中，所述分類器的產(chǎn)生包括對(duì)所述分類器的交叉驗(yàn)證(cross-validating)。引用并入 本說(shuō)明書中所提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均以引用的形式并入本文，其程度正如各出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)被具體地并且各自地以引用的形式被并入。附圖
簡(jiǎn)沭本發(fā)明的新型特征在附上的權(quán)利要求中具體闡明。通過(guò)參考下文詳述可獲得對(duì)本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)的更佳了解，該詳述闡明了應(yīng)用本發(fā)明的原理的示例性實(shí)施方案，并且其附圖為圖I描述了免疫系統(tǒng)細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)的實(shí)例。圖2顯示了在經(jīng)EPO、G-CSF和EP0+G-CSF處理之后淋巴細(xì)胞、nRBCl細(xì)胞、骨髓(pi)細(xì)胞和干細(xì)胞中pStatl、pStat3和pStat5的不同激活水平。圖3顯示了正常樣品中的不同的分離的細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)。發(fā)明詳沭本發(fā)明并入了在其他申請(qǐng)和文本中所公開的信息。下列專利和其他出版物全文以引用的形式并入本文Haskell等人，Cancer Treatment,第五版，ff. B. Saunders和 Co. , 2001 ；Alberts 等人，The Cell,第四版，Garland Science, 2002 ；Vogelstein 和Kinzler, The Genetic Basis of Human Cancer,第二版，McGraw Hill, 2002 ；Michael,Biochemical Pathways, John Wiley 和 Sons,1999 ;Weinberg, The Biology of Cancer,2007 ；Immunobiology, Janeway 等人，第七版，Garland,以及 Leroith 和 Bondy, GrowthFactors And Cytokines in Health And Disease, A Multi Volume Treatise,卷 IA 和IB,Growth Factors, 1996。其他傳統(tǒng)的工藝和描述可見于標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，例如GenomeAnalysis A Laboratory Manual Series (卷 I-IV), Using Antibodies A LaboratoryManual,Cells A Laboratory Manual,PCR Primer A Laboratory Manual,以及MolecularCloning A Laboratory Manual (均來(lái)自于 Cold Spring Harbor Laboratory Press),Stryer, L. (1995)Biochemistry (第四版)Freeman, New York, Gait, “OligonucleotideSynthesis A Practical Approach” 1984, IRL Press, London, Nelson 和 Cox (2000)，Lehninger, Principles of Biochemistry 第三版，ff. H. Freeman Pub. , New York, N. Y.以及 Berg 等人，(2002)Biochemistry,第五版，ff. H. Freeman Pub. , New York, N. Y.;以及Sambrook, Fritsche 和 Maniatis “Molecular Cloning A laboratory Manual，，第三版，Cold Spring Harbor Press (2001),出于所有目的所有這些均全文以引用的形式并入本文。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于對(duì)個(gè)體的狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定的方法，所述測(cè)定通過(guò)測(cè)定獲自所述個(gè)體的不同的分離的細(xì)胞群體中的細(xì)胞激活水平而進(jìn)行。一般情況下，個(gè)體的狀態(tài)是與所述個(gè)體的健康相關(guān)的狀態(tài)(本文稱為“健康狀態(tài)”或“疾病狀態(tài)”)，然而可對(duì)任意類型的狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定，只要它與來(lái)自所述個(gè)體的一個(gè)或更多個(gè)分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞(如單細(xì)胞)的狀態(tài)有關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定個(gè)體狀態(tài)的方法，所述測(cè)定通過(guò)使用兩種或更多種分離的細(xì)胞群體而創(chuàng)建響應(yīng)表單而進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體的狀態(tài)通過(guò)包括以下的方法而進(jìn)行測(cè)定a)使用至少第一調(diào)節(jié)劑接觸來(lái)自所述個(gè)體的分離的第一細(xì)胞群體的第一細(xì)胞山)使用至少第二調(diào)節(jié)劑接觸來(lái)自所述個(gè)體的分離的第二細(xì)胞群體的第二細(xì)胞；d)在所述第一細(xì)胞和所述第二細(xì)胞內(nèi)測(cè)定至少一種可激活元件的激活水平；e)為所述個(gè)體創(chuàng)建包括所述可激活元件的所述被測(cè)定的激活水平的響應(yīng)表單；以及f)根據(jù)所述個(gè)體的狀態(tài)而做出決策，其中所述決策基于所述響應(yīng)表單。因此，本發(fā)明提供了用于通過(guò)分析多個(gè)(如兩個(gè)或更多個(gè))分離的細(xì)胞群體而對(duì)個(gè)體狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法以區(qū)別分離的細(xì)胞群體，所述細(xì)胞群體相關(guān)于疾病的臨床結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了不同的分離的細(xì)胞群體，對(duì)其分析的組合實(shí)現(xiàn)了對(duì)個(gè)體狀態(tài)的測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了不同的分離的細(xì)胞群體，對(duì)其分析的組合實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的細(xì)胞群體之間的因果關(guān)聯(lián)的測(cè)定，其中所述因果關(guān)聯(lián)是細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的指征。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法以測(cè)定作為某細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)部分的一種或更多種細(xì)胞群體是否與一種狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。個(gè)體的狀態(tài)可被關(guān)聯(lián)以診斷、預(yù)后、選擇或修正治療，和/或疾病、監(jiān)測(cè)失調(diào)或病狀。通過(guò)對(duì)個(gè)體狀態(tài)的測(cè)定，醫(yī)療人員可估測(cè)所述個(gè)體是否處于特定病狀的正常范圍之內(nèi)或者所述個(gè)體是否具有應(yīng)當(dāng)監(jiān)測(cè)和/或治療的病理前或病理病狀。因此，在一些實(shí)施方案中，個(gè)體的狀態(tài)涉及病狀的分類、診斷、預(yù)后或施用治療劑來(lái)治療該病狀后的結(jié)果。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及病狀的分類、診斷、預(yù)后或施用治療劑來(lái)治療該病狀后的結(jié)果。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及對(duì)病狀的結(jié)果的監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)。另一個(gè)實(shí)施方案是藥物篩選，其使用本發(fā)明的某些方法以測(cè)定何種藥物對(duì)于特定的病狀是有用的。在一些實(shí)施方案中，分析方法涉及在實(shí)施這些方法中對(duì)不同的分離的細(xì)胞群體內(nèi)的細(xì)胞信號(hào)和/或表達(dá)標(biāo)記物進(jìn)行的評(píng)估。細(xì)胞信號(hào)分析的一個(gè)實(shí)施方案涉及對(duì)不同的分離的細(xì)胞群體中的一種或更多種磷酸化蛋白質(zhì)的分析(如，通過(guò)流式細(xì)胞儀)。隨后根據(jù)不同的分離的細(xì)胞群體中的一種或更多種磷酸化蛋白質(zhì)的分析而測(cè)定病狀的分類、診斷、預(yù)后和/或施用治療劑來(lái)治療該病狀后的結(jié)果。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)使用磷酸化蛋白質(zhì)模式集類或所述不同的分離的細(xì)胞群體的生物識(shí)別標(biāo)志(biosignature)而進(jìn)行基于信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)病狀的分類。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)對(duì)多個(gè)分離的細(xì)胞群體的特征分析而選擇治療方法。在一些實(shí)施方案中，對(duì)多個(gè)分離的細(xì)胞群體的特征分析包括對(duì)該多個(gè)細(xì)胞群體的一種或更多種可激活元件的激活狀態(tài)的測(cè)定。在所述多個(gè)分離的細(xì)胞群體中進(jìn)行分析的所述可激活元件可以是相同元件或不同元件。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于病狀的分類、診斷、預(yù)后或施用治療劑來(lái)治療該病狀后的結(jié)果的方法，其通過(guò)對(duì)不同的分離的細(xì)胞群體中的一種或更多種途徑進(jìn)行特征分析而實(shí)施。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)在不同的分離的細(xì)胞群體中同時(shí)進(jìn)行的對(duì)所述途徑特征分析而選擇治療方法。在一些實(shí)施方案中，不同的分離的細(xì)胞群體中對(duì)一種或更多種途徑進(jìn)行的特征分析包含對(duì)細(xì)胞凋亡途徑、細(xì)胞周期途徑、信號(hào)傳導(dǎo)途徑或DNA損傷途徑在所述不同的分離的細(xì)胞群體中是否具有功能而進(jìn)行的測(cè)定，所述測(cè)定根據(jù)該途徑中的一種或更多種可激活元件的激活水平而進(jìn)行，其中途徑在其可對(duì)處理作出響應(yīng)的情況下是具有功能的。在一些實(shí)施方案中，對(duì)病狀(如癌癥)中的不同的分離的細(xì)胞群體的特征分析顯示了細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)，所示細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)是提高的增殖、提高的存活率、對(duì)細(xì)胞凋亡的逃避、對(duì)抗生長(zhǎng)信號(hào)的失敏和其他機(jī)制的反映。在一些實(shí)施方案中，這些網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)可通過(guò)將多個(gè)分離的細(xì)胞群體暴露于一種或更多種調(diào)節(jié)劑而進(jìn)行揭示，所述調(diào)節(jié)劑模擬了一種或更多種環(huán)境信號(hào)。圖I顯示了免疫系統(tǒng)中的多個(gè)分離的細(xì)胞群體的生物學(xué)特征是如何對(duì)病狀和治療結(jié)果的病理學(xué)進(jìn)行測(cè)定的實(shí)例。例如，并非意在受限于任何理論的情況下，多個(gè)不同的細(xì)胞類型作為所述免疫系統(tǒng)的一部分參與，這些細(xì)胞類型包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞。這些細(xì)胞類型在該免疫系統(tǒng)中各具獨(dú)特功能，并且與其他免疫細(xì)胞使用分泌因子進(jìn)行通訊，所述分泌因子被稱為細(xì)胞因子，包括白介素、TNF和干擾素。巨噬細(xì)胞吞噬異物(foreign body)并且是抗原呈遞細(xì)胞，其使用細(xì)胞因子以刺激B和T細(xì)胞進(jìn)行的特異性抗原依賴響應(yīng)和其他細(xì)胞類型進(jìn)行的非特異性響應(yīng)。T細(xì)胞分泌多種不同的因子以協(xié)調(diào)和刺激針對(duì)特異性抗原的免疫響應(yīng)，例如輔助T細(xì)胞在B細(xì)胞響應(yīng)于抗原的激活中的作用。嗜曙紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的增殖和激活也響應(yīng)于細(xì)胞因子。細(xì)胞因子通訊通常是局部的，在組織內(nèi)或鄰近的細(xì)胞間進(jìn)行。各種細(xì)胞因子各自由一組細(xì)胞所分泌并且在另外一組靶細(xì)胞內(nèi)引起響應(yīng)，所述靶細(xì)胞通常包括分泌所述細(xì)胞因子的細(xì)胞。響應(yīng)于組織損傷，化學(xué)信號(hào)的多因子網(wǎng)絡(luò)起始并維持了設(shè)計(jì)用以治愈所述受損組織的宿主響應(yīng)。當(dāng)諸如癌癥這樣的病癥存在于個(gè)體之中的時(shí)候，諸如組織、器官和/或微環(huán)境的體內(nèi)平衡被擾亂。例如，與腫瘤形成相關(guān)的血管形成和淋巴管形成產(chǎn)生了血管和淋巴管的混亂管體結(jié)構(gòu)，其中成瘤細(xì)胞與其他細(xì)胞類型(間葉細(xì)胞、造血細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞)和重塑的細(xì)胞外基質(zhì)相互作用。成瘤細(xì)胞產(chǎn)生一列細(xì)胞因子和趨化因子，其為粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的絲裂原和/或化學(xué)引誘物。另外，激活的成纖維細(xì)胞和炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞分泌蛋白水解酶、細(xì)胞因子和趨化因子，其為成瘤細(xì)胞的絲裂原以及參與成瘤血管形成和淋巴管形成的細(xì)胞的絲裂原。這些因子可加強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)、刺激血管形成、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞遷移和成熟并且通過(guò)與靜脈或淋巴管網(wǎng)絡(luò)的接合而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。因此，在個(gè)體內(nèi)對(duì)多種細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的測(cè)定提供了該個(gè)體狀態(tài)和/或所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的更好描述。在病狀如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中，樹突細(xì)胞、T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞之間的相互作用均有責(zé)任，并且細(xì)胞因子和趨化因子的局部產(chǎn)生可對(duì)RA的病例發(fā)生具有責(zé)任。這些細(xì)胞進(jìn)一步與局部細(xì)胞(如滑膜細(xì)胞)相互作用。響應(yīng)于局部炎癥和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在未知事件后，樹突細(xì)胞、T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞響應(yīng)于細(xì)胞因子和趨化因子的局部產(chǎn)生而被吸引至所述滑膜處。在一些類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者體內(nèi)，慢性炎癥導(dǎo)致了軟骨、骨骼和韌帶的破壞，這引起該關(guān)節(jié)的畸形。對(duì)所述關(guān)節(jié)的損傷可發(fā)生在該疾病的早期并且是進(jìn)行性的。所述狀態(tài)的測(cè)定(例如，健康狀態(tài)、疾病狀態(tài)和/或顯示個(gè)體的病理生理的任何狀態(tài))還可顯示個(gè)體對(duì)病狀治療的響應(yīng)。這樣的信息實(shí)現(xiàn)了所述病狀和/或另外治療的現(xiàn)行監(jiān)測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在受疾病或病狀治療或曾受疾病或病狀治療的個(gè)體中對(duì)疾病關(guān)聯(lián)細(xì)胞的存在或正常生理必需細(xì)胞的缺失或減少的檢測(cè)。在一些實(shí)施方案 中，所述狀態(tài)也可顯示了對(duì)治療的預(yù)測(cè)性響應(yīng)。 在一些實(shí)施方案中，個(gè)體狀態(tài)的測(cè)定可被用于確認(rèn)先前病狀或治療是否誘發(fā)了需監(jiān)測(cè)和/或治療的新的病理前或病理病狀。例如，對(duì)多種形式癌癥(例如淋巴瘤和幼兒白血病)的治療可誘發(fā)特定的成人白血病，并且本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)這樣白血病的早期檢測(cè)和治療。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，個(gè)體狀態(tài)可顯示個(gè)體的免疫學(xué)狀態(tài)并且可反映基本免疫學(xué)狀態(tài)、器官或組織具體狀態(tài)或疾病相關(guān)狀態(tài)。本發(fā)明還提供了用于測(cè)定個(gè)體狀態(tài)的試劑盒(在下文題為“試劑盒”的部分有所詳述)，所述試劑盒包含信號(hào)傳導(dǎo)分子的一種或更多種特異性結(jié)合元件并且可進(jìn)一步包含一種或更多種治療劑。所述試劑盒可進(jìn)一步包含用于對(duì)不同細(xì)胞群體進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的軟件包，該軟件包可包含參比特征以用于測(cè)試特征的對(duì)比。 下文的討論描述了針對(duì)特定疾病的一些優(yōu)選的實(shí)施方案。然而，應(yīng)當(dāng)了解所述原理也可用于多種其他疾病的分析。介紹細(xì)胞對(duì)環(huán)境和系統(tǒng)信號(hào)作出響應(yīng)以調(diào)整其對(duì)于變化的需求的響應(yīng)。例如，細(xì)胞對(duì)因子作出響應(yīng)，諸如由其他細(xì)胞所產(chǎn)生或來(lái)自其環(huán)境的激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。細(xì)胞還對(duì)損傷和生理變化作出響應(yīng)。其結(jié)果是各個(gè)組織、器官、微環(huán)境(如小環(huán)境(niche))或細(xì)胞具有調(diào)控細(xì)胞活性的能力。另外，細(xì)胞的存在(如癌細(xì)胞)可在周邊組織、器官、微環(huán)境(如小環(huán)境)或細(xì)胞中具有影響。細(xì)胞在與周邊組織、器官、微環(huán)境(如小環(huán)境)或細(xì)胞的通訊中可以是被動(dòng)性的，僅僅根據(jù)所述環(huán)境需求而調(diào)整其活性水平。細(xì)胞可借助后代或諸如細(xì)胞接觸、分泌或膜結(jié)合的因子這樣的信號(hào)而影響周邊組織、器官、微環(huán)境(如小環(huán)境)或細(xì)胞。因此，細(xì)胞與其他類型的細(xì)胞共處于復(fù)雜的周邊環(huán)境之中。在組織、器官或微環(huán)境如小環(huán)境中互相之間相互作用的不同類型的細(xì)胞參與可能決定個(gè)體狀態(tài)(例如，病狀的發(fā)展或發(fā)揮正常功能)的網(wǎng)絡(luò)之中。本發(fā)明所使用的分離的細(xì)胞群體指的是一個(gè)群體的細(xì)胞，其中主要的細(xì)胞為相同的細(xì)胞類型或具有相同的特征。多年以來(lái)，對(duì)多種病狀(如癌癥)的研究專注于辨識(shí)包含單細(xì)胞類型的細(xì)胞的成因性細(xì)胞群體。然而，多種分離的細(xì)胞群體或多種細(xì)胞群體之間的相互作用可能導(dǎo)致病狀的病理學(xué)。例如，對(duì)于癌細(xì)胞，該癌細(xì)胞可對(duì)環(huán)境信號(hào)(如細(xì)胞因子)具有失調(diào)的響應(yīng)從而使所述細(xì)胞進(jìn)行增殖而非進(jìn)行凋亡?；蛘撸黾?xì)胞所處的環(huán)境(如，小環(huán)境、組織、器官)可異常地產(chǎn)生導(dǎo)致所述癌細(xì)胞進(jìn)行失控增殖的因子。另外，所述癌細(xì)胞可產(chǎn)生一種或更多種影響其環(huán)境(如，小環(huán)境、組織、器官)的因子并且結(jié)果是該癌癥的病理學(xué)惡化。因此，病狀的成功診斷和治療的成功應(yīng)用可能需要不同的分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的知識(shí)，所述細(xì)胞群體可在病狀(如癌癥)的病理發(fā)生中起作用。對(duì)可能與網(wǎng)絡(luò)直接或間接相互作用的不同的分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的測(cè)定可發(fā)揮該網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的指標(biāo)的作用。另外，其為所述網(wǎng)絡(luò)中的不同的分離的細(xì)胞群體間的相互作用指出了方向。其對(duì)參與所述網(wǎng)絡(luò)之中的細(xì)胞群體還提供了跨群體信息。因此，與單個(gè)分離的細(xì)胞群體分析相比，不同的分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的測(cè)定可作為更為出色的病狀指標(biāo)發(fā)揮作用。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)分析各個(gè)群體中的多個(gè)單細(xì)胞(如，通過(guò)流式細(xì)胞儀)而測(cè)定了多個(gè)細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。在個(gè)體中對(duì)各個(gè)分離的細(xì)胞群體的多個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行的測(cè)量提供了多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，其隨后實(shí)現(xiàn)了對(duì)所述個(gè)體中的網(wǎng)絡(luò)邊界的測(cè)定。在單細(xì)胞水平測(cè)量受調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)提供了該水平上的生物解析度，其實(shí)現(xiàn)了對(duì)患者內(nèi)克隆異質(zhì)性的估測(cè)，其最終與疾病控制和結(jié)果相關(guān)。當(dāng)所述個(gè)體罹患病理病狀時(shí)或在所述個(gè)體對(duì)治療有所響應(yīng)或不具響應(yīng)的情況下，所述網(wǎng)絡(luò)邊界和/或所述網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)可發(fā)生變化。因此，網(wǎng)絡(luò)邊界和/或所述網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的測(cè)定可被用于病狀的診斷、預(yù)后或確定施用治療劑來(lái)治療該病狀后的結(jié)果。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于測(cè)定個(gè)體狀態(tài)的方法，其通過(guò)分析所述個(gè)體中的不同的分離的細(xì)胞群體而進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的方法。所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)可與個(gè)體狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)個(gè)體狀態(tài)的測(cè)定涉及病狀的分類、診斷、預(yù)后或施用治療劑來(lái)治療該病狀后的結(jié)果。樣品與取樣所述方法涉及來(lái)自個(gè)體的一種或更多種樣品的分析。個(gè)體或患者是任意的多細(xì)胞生物；在一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體是動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體是人。所述樣品可以是任意適當(dāng)?shù)念愋?，其可?shí)現(xiàn)對(duì)不同的分離的細(xì)胞群體的分析。所述樣品可以是任意適當(dāng)?shù)念愋?，其可?shí)現(xiàn)對(duì)單一群體細(xì)胞的分析。所述樣品一次性或分多次從個(gè)體中獲取。多個(gè)樣品可從所述個(gè)體的不同部位獲取(如，血液樣品、骨髓樣品和/或淋巴結(jié)樣品)，在不同的時(shí)間從所述個(gè)體中獲取(如，對(duì)一系列樣品進(jìn)行取樣用以監(jiān)測(cè)對(duì)治療的響應(yīng)或用以檢測(cè)病理病狀的重現(xiàn))，或其任意組合。根據(jù)樣品類型、部位和取樣時(shí)間的這些或其他可能的取樣方式組合實(shí)現(xiàn)了對(duì)病理前或病理細(xì)胞存在的檢測(cè)、對(duì)治療響應(yīng)的測(cè)量以及對(duì)疾病的監(jiān)測(cè)。當(dāng)樣品成系列地獲取的時(shí)候，例如治療后獲取的一系列血液樣品，所述樣品可在固定的間隔下獲取，在由最近一個(gè)或一批樣品或所述個(gè)體其他特征所決定的間隔下獲取，或在所述間隔的組合下獲取。例如，樣品可以在約1、2、3或4周的間隔下獲取，在約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個(gè)月的間隔下獲取，在約1、2、3、4、5或超過(guò)5年的間隔下獲取，或在所述間隔的組合下獲取。應(yīng)當(dāng)了解，根據(jù)個(gè)體進(jìn)行取樣的可行性和取樣設(shè)備的可用性，間隔有可能并不精準(zhǔn)，因此本發(fā)明涵蓋了對(duì)應(yīng)于計(jì)劃間隔安排的近似間隔。例如，進(jìn)行癌癥治療的個(gè)體可在治療后最初六個(gè)月至一年內(nèi)進(jìn)行相對(duì)頻繁(例如每個(gè)月或每三個(gè)月)的取樣(如，通過(guò)取血)，隨后如果未見異常，其后進(jìn)行較不頻繁的取樣(如，六個(gè)月到一年)。但是，如果在任何預(yù)期間或取樣期間發(fā)現(xiàn)任何異?；蚱渌麪顩r，可對(duì)取樣間隔進(jìn)行調(diào)整。—般而言，最容易獲取的樣品是液體樣品。液體樣品包括正常體液和病理體液以及這些液體的吸出物。液體樣品還包括器官和腔室的清洗物(灌洗和灌注)。體液包括全血、骨髓吸出物、滑液、腦脊液、唾液、汗液、淚液、精液、痰液、粘液、經(jīng)血、母乳、尿液、淋巴液、羊水、胎水以及滲出物諸如心包積液、關(guān)節(jié)積液、胸腔積液和腹腔積液(腹水)。清洗物可獲自多種器官、體腔、通路、管道和腺體?？杀磺逑吹奈恢冒ǚ?支氣管灌洗)、胃(胃灌洗)、胃腸道(胃腸道灌洗)、結(jié)腸(結(jié)腸灌洗)、陰道、膀胱(膀胱沖洗)、乳腺導(dǎo)管(乳 腺清洗)、口腔、鼻腔、鼻竇和腹腔(腹腔灌注)。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是血液。也可使用固體組織樣品，單獨(dú)或與液體樣品結(jié)合使用均可。固體樣品可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的方法獲自個(gè)體，包括手術(shù)標(biāo)本、活組織切片和組織刮取物，包括頰部刮取物。手術(shù)標(biāo)本包括在探測(cè)性、整形、重建或治療性手術(shù)期間獲取的樣品。活組織切片可通過(guò)多種方法獲取，包括嚙取、刷取、錐切、鉆心、細(xì)胞學(xué)、吸取、內(nèi)窺鏡檢、割除、探測(cè)性、細(xì)針吸取、切開、經(jīng)皮穿刺、鉆孔、立體定向和表面活組織切片檢測(cè)。
樣品可包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。用于分離CTC的方法在本領(lǐng)域中是已知的。參見，例如Toner M 等人，Nature 450，1235-1239 (2007 年 12 月 20 日)；Lustenberger P 等人，Int J Cancer. 1997 年 10 月 21 日，74 (5) :540-4 ；Reviews in Clinical LaboratorySciences,第 42 卷，第 2 集，2005 年 3 月，155-196 頁(yè)；以及 Biotechno，109-113 頁(yè)，2008International Conference on Biocomputation, Bioinformatics, and BiomedicalTechnologies, 2008 年。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是血液樣品。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是骨髓樣品。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是淋巴結(jié)樣品。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是腦脊液樣品。在一些實(shí)施方案中，使用了血液、骨髓、腦脊液和淋巴結(jié)樣品中的一種或更多種的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品可在例行檢查中獲自外觀健康的個(gè)體并且經(jīng)分析以提供所述個(gè)體總體健康狀態(tài)的評(píng)測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可獲取樣品以進(jìn)行常見疾病的篩選。這樣的篩選可包含對(duì)單一疾病、相關(guān)疾病類屬的測(cè)試或包含對(duì)多種無(wú)關(guān)聯(lián)疾病的總體篩選。篩選可每周進(jìn)行、雙周進(jìn)行、每月進(jìn)行、雙月進(jìn)行、每數(shù)月進(jìn)行、每年進(jìn)行或以數(shù)年的間隔進(jìn)行，并且可取代或補(bǔ)充進(jìn)行中的篩選方式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可對(duì)具有已知發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高的個(gè)體進(jìn)行規(guī)律性監(jiān)測(cè)用以檢測(cè)特定疾病或疾病類屬的出現(xiàn)。發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高可基于家族關(guān)聯(lián)、年齡、先前基因測(cè)試結(jié)果或者對(duì)致病劑的職業(yè)性、環(huán)境性或治療性暴露。與BRCAl和BRCA2基因的先天突變相關(guān)的乳腺癌和卵巢癌是具有家族關(guān)聯(lián)的疾病的實(shí)例，其中易患個(gè)體可通過(guò)基因測(cè)試而鑒別。另一個(gè)實(shí)例為腺瘤樣結(jié)腸息肉基因中的先天突變的存在，其使個(gè)體易患結(jié)腸直腸癌。環(huán)境或治療性暴露的實(shí)例包括職業(yè)性暴露于苯的個(gè)體(其具有升高的發(fā)展出多種形式的白血病的風(fēng)險(xiǎn))，以及治療性暴露于用于早期惡性疾病治療的烷基化劑的個(gè)體。可對(duì)具有特定疾病的升高風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體針對(duì)異常分離的細(xì)胞群體出現(xiàn)的第一信號(hào)進(jìn)行規(guī)律性監(jiān)測(cè)。監(jiān)測(cè)可每周進(jìn)行、雙周進(jìn)行、每月進(jìn)行、雙月進(jìn)行、每數(shù)月進(jìn)行、每年進(jìn)行或以數(shù)年的間隔進(jìn)行，或在所述間隔的組合下進(jìn)行。監(jiān)測(cè)可取代或補(bǔ)充進(jìn)行中的篩選方法。通過(guò)常規(guī)的監(jiān)測(cè)，對(duì)疾病成因或相關(guān)細(xì)胞的存在的早期檢測(cè)可帶來(lái)增多的治療可選項(xiàng)，包括具較低毒性的治療或疾病控制或治愈的幾率提高。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可進(jìn)行測(cè)試以確認(rèn)或排除與疾病風(fēng)險(xiǎn)升高的可疑基因或生理異常的存在。這樣的測(cè)試方法學(xué)可取代其他的確認(rèn)工藝如細(xì)胞發(fā)生分析或原位組織化學(xué)熒光(FISH)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可進(jìn)行測(cè)試以確認(rèn)或排除對(duì)病理前或病理病狀的診斷。在個(gè)體具有已知的病理前或病理病狀的情況下，可對(duì)來(lái)自適當(dāng)部位的多個(gè)分離的細(xì)胞群體進(jìn)行取樣并分析以預(yù)測(cè)所述個(gè)體對(duì)可行的治療選項(xiàng)的響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，接受目的為使相關(guān)于病理前或病理病狀的細(xì)胞降低數(shù)量或消除的治療的個(gè)體可被監(jiān)測(cè)以估測(cè)這些細(xì)胞隨時(shí)間的減少。成因性或相關(guān)性細(xì)胞的降低可與疾病癥狀的消失或減弱相關(guān)聯(lián)或無(wú)關(guān)聯(lián)。如果未發(fā)生預(yù)期的細(xì)胞數(shù)量降低，可能需要以相同或者不同的治療方案進(jìn)行進(jìn)一步治療。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可對(duì)接受治療以逆轉(zhuǎn)或停止病理前病狀的發(fā)展的個(gè)體進(jìn)行監(jiān)測(cè)以估測(cè)所述逆轉(zhuǎn)速度或被停止在該病理前狀態(tài)點(diǎn)的細(xì)胞的百分比。如果未見到預(yù)期的逆轉(zhuǎn)速度或細(xì)胞未被停止在所需的病理前狀態(tài)點(diǎn)，可以考慮使用相同或不同的治療方案進(jìn)行進(jìn)一步治療。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可對(duì)個(gè)體的細(xì)胞進(jìn)行分析以查看使用分化劑進(jìn)行的治療是否按照特異性組織譜系驅(qū)動(dòng)某一細(xì)胞類型并且使之最終分化而隨后失去增殖或更新能力。這樣的治療可被預(yù)防性地用于將與疾病相關(guān)的去分化細(xì)胞的數(shù)量保持于低水平，因而預(yù)防了明顯疾病(overt disease)的發(fā)展?；蛘撸稍谠偕t(yī)學(xué)中使用這樣的治療從而誘導(dǎo)或引導(dǎo)多潛能干細(xì)胞或多能干細(xì)胞分化降至所需的組織或器官特異性譜系，并且因而加速或改善了康復(fù)過(guò)程。還可對(duì)個(gè)體進(jìn)行監(jiān)測(cè)以針對(duì)與良性預(yù)后相關(guān)的另一種分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞的出現(xiàn)或數(shù)量的提高。如果觀測(cè)到有利的分離的細(xì)胞群體，可采取措施以進(jìn)一步提高他們的數(shù)量，例如施用生長(zhǎng)因子?；蛘撸€可對(duì)個(gè)體進(jìn)行監(jiān)測(cè)以針對(duì)與不良預(yù)后相關(guān)的另一種分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞的出現(xiàn)或數(shù)量的提高。在這樣的情況下，可以考慮進(jìn)行更新性治療，其包 括繼續(xù)進(jìn)行、修改當(dāng)前治療或起始另一類型的治療。在這些實(shí)施方案中，根據(jù)本文的描述可從所述個(gè)體獲取一種或更多種樣品，并且使樣品接觸調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，所述樣品可被分成分樣，其各自接觸不同的調(diào)節(jié)齊U。在用所述調(diào)節(jié)劑進(jìn)行治療之后，對(duì)所述樣品或分樣中的不同的分離的細(xì)胞群體進(jìn)行分析以測(cè)定它們的激活狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)所述不同的分離的細(xì)胞群體中的單細(xì)胞進(jìn)行了分析。可使用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞激活水平的測(cè)定的任意適當(dāng)形式的分析。在一些實(shí)施方案中，所述分析包括對(duì)諸如蛋白質(zhì)這樣的細(xì)胞內(nèi)元件的激活水平的測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，所述分析包括對(duì)可激活元件的激活水平的測(cè)定，例如細(xì)胞內(nèi)可激活元件如蛋白質(zhì)，例如磷酸蛋白。根據(jù)本文所述，所述激活水平的測(cè)定的完成可通過(guò)使用激活狀態(tài)特異性結(jié)合元件，例如抗體?？稍谝环N或更多種所述不同的分離的細(xì)胞群體中檢測(cè)多個(gè)可激活元件。特定的液體樣品可在使用或不使用添加稀釋劑或緩沖液的情況下以其天然狀態(tài)而進(jìn)行分析?；蛘撸后w樣品可被進(jìn)一步加工以在分析之前獲得富集的或純化的分離的細(xì)胞群體。用于體液的多種富集或純化方法在本領(lǐng)域是已知的。用于從全血的血漿中分離細(xì)胞的一種常見方法是通過(guò)使用肝素化管進(jìn)行離心。通過(guò)引入密度梯度可完成將淋巴細(xì)胞從紅細(xì)胞中的進(jìn)一步分離。本領(lǐng)域中已知多種密度梯度介質(zhì)，包括蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白(BSA)、FICOLL泛影酸鈉(Pharmacia)、FICOLL甲泛影鈉(Nycomed)、PERCOLL(Pharmacia)、甲泛葡胺以及重鹽類如氯化銫?；蛘撸赏ㄟ^(guò)使用諸如氯化銨這樣的試劑進(jìn)行的裂解在離心前除去紅細(xì)胞。全血也可用濾器進(jìn)行處理，所述濾器經(jīng)工程改造而具有對(duì)所需細(xì)胞類型或種類進(jìn)行選擇的孔徑。例如，根據(jù)美國(guó)專利申請(qǐng)第09/790，673號(hào)中進(jìn)行的公開，在對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行裂解之后，稀少的病原性細(xì)胞可使用孔徑介于5與10 U m之間的濾器從稀釋的全血中濾出?；蛘撸鶕?jù)美國(guó)專利申請(qǐng)第10/529,453號(hào)，可根據(jù)大小、形狀、變形程度或者表面受體或表面抗原通過(guò)微流控裝置將全血分解成其組成的細(xì)胞。還可通過(guò)基于抗體或其他識(shí)別細(xì)胞表面或細(xì)胞質(zhì)組成的實(shí)體的結(jié)合進(jìn)行的陽(yáng)性或陰性選擇對(duì)精選的細(xì)胞群體進(jìn)行針對(duì)全血的富集或從全血中進(jìn)行分離。例如，Schmitz等人的美國(guó)專利第6，190，870號(hào)公開了通過(guò)腫瘤細(xì)胞的磁力分選而進(jìn)行的腫瘤細(xì)胞從外周血中的富集，所述腫瘤細(xì)胞用針對(duì)組織特異性抗原的抗體進(jìn)行磁力標(biāo)記。 固體組織樣品可能需要破壞該細(xì)胞外基質(zhì)或組織基質(zhì)以及對(duì)用于分析的單細(xì)胞的釋放。多種工藝在本領(lǐng)域中是已知的，包括分開或組合使用的酶降解和機(jī)械力降解。利用了膠原酶和蛋白酶的酶學(xué)解離的一個(gè)實(shí)例可見于Wolters GHJ等人，An analysisof the role of collagenase and protease in the enzymatic dissociation of therat pancrease for islet isolation. Diabetologia 35 :735-742,1992 年。機(jī)械力解離的實(shí)例可見于 Singh, NP. Technical Note A rapid method for the preparation ofsingle-cell suspensions from solid tissues. Cytometry 31 :229-232(1998 年)?；蛘撸赏ㄟ^(guò)顯微切割技術(shù)從固體組織中取出單細(xì)胞，所述顯微切割技術(shù)包括Laser CaptureMicrodissection, Emmert-Buck, M. R.等人，Science, 274 (8) :998-1001,1996 年中所公開的激光捕獲顯微切割技術(shù)。在一些實(shí)施方案中，可在諸如組織斷片或切片這樣的組織樣品內(nèi)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行分析，而無(wú)需在進(jìn)行測(cè)定步驟前釋放個(gè)體細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)離心、淘析、密度梯度分離、析離、親和性選擇、盤選、FACS、使用Hypaque進(jìn)行的離心、具有結(jié)合抗體的支持物(磁珠、柱體中的微珠、或其他表面)等等將所述細(xì)胞從身體樣品中分離。通過(guò)使用等同于特定細(xì)胞類型的標(biāo)記物的特異性抗體，可獲得相對(duì)同源的細(xì)胞群體?；蛘呖梢允褂卯愒吹募?xì)胞群體。也可通過(guò)使用濾器而分離細(xì)胞。一旦獲得樣品，其可被直接使用、冷凍或在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行短時(shí)期維持。分離一種或更多種用于根據(jù)本發(fā)明的方法使用的細(xì)胞的方法可根據(jù)本領(lǐng)域所廣為接受的標(biāo)準(zhǔn)工藝和方案而實(shí)施。還可參見U. S. S.第61/048，886號(hào)；第61/048，920號(hào)；和第61/048，657號(hào)。根據(jù)上文的確定，還可參見來(lái)自諸如BD和BCI這樣的公司的商業(yè)產(chǎn)品。還可參見美國(guó)專利第7，381，535號(hào)和第7，393，656號(hào)。根據(jù)上文聲明，上述專利和申請(qǐng)以引用的方式并入本文。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在收集后在適于揭示可激活元件的激活水平的培養(yǎng)基(如RPMI、DMEM)中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)存在或不存在血清，諸如胎牛血清、牛血清、人血清、豬血清、馬血清或山羊血清。當(dāng)所述所述培養(yǎng)基中存在血清的時(shí)候其可處于介于
0.0001%與30%的之間的水平。分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)的測(cè)定如果使用調(diào)節(jié)劑，在使用一種或更多種調(diào)節(jié)劑進(jìn)行處理之后，一些實(shí)施方案中對(duì)所述樣品進(jìn)行分析以測(cè)定不同的分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)。這產(chǎn)生了不同的分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的測(cè)定通過(guò)將所述細(xì)胞群體接觸一種或更多種調(diào)節(jié)劑并且測(cè)定所述細(xì)胞群體中的至少一種細(xì)胞的可激活元件的激活狀態(tài)或激活水平而進(jìn)行。適用的不同調(diào)節(jié)劑在下文題為“調(diào)節(jié)劑”的部分有所描述。通過(guò)對(duì)所述細(xì)胞中的可激活元件的相對(duì)量進(jìn)行定量(如，使用抗體以對(duì)所述可激活元件進(jìn)行定量)而測(cè)定所述激活水平。根據(jù)下文題為“檢測(cè)”的部分的描述，可以使用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞激活水平的測(cè)定的任意適當(dāng)形式的分析?？杉せ钤谙挛念}為“可激活元件”的部分有所描述。根據(jù)下文題為“結(jié)合元件”和“替代性激活狀態(tài)指示物”的部分的描述，所述激活水平的測(cè)定可通過(guò)使用諸如抗體這樣的激活狀態(tài)特異性結(jié)合元件而完成。
細(xì)胞群體可被分成多種樣品，并且在所述樣品被暴露于一種或更多種調(diào)節(jié)劑之后通過(guò)測(cè)量該樣品中的至少一種可激活元件測(cè)激活水平而測(cè)定所述群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，所述分析在單細(xì)胞中進(jìn)行。可以使用在單細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)可激活元件的激活水平的測(cè)定的任意適當(dāng)分析，所述測(cè)定提供了可用于測(cè)定所述樣品所來(lái)自的分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。實(shí)例包括流式細(xì)胞儀、免疫組織化學(xué)、使用或不使用共聚焦顯微鏡法的免疫熒光組織化學(xué)、免疫電子顯微鏡法、核酸擴(kuò)增、基因陣列、蛋白質(zhì)陣列、質(zhì)譜、膜片鉗技術(shù)、二維凝膠電泳、差示凝膠電泳、基于微球的多元蛋白質(zhì)分析、ELISA、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)以及無(wú)標(biāo)記物細(xì)胞分析。用于在單細(xì)胞間進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分的信息可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法獲得，包括測(cè)定細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的存在與否、測(cè)定代謝物的存在、基因表達(dá)特征、DNA測(cè)序分析和染色體組型分析所述不同的分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可被用于理解與疾病相關(guān)的分離的細(xì)胞群體之間的通訊。這些因果關(guān)聯(lián)可使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行測(cè)定，例如簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)和/或分類算法。這些因果關(guān)聯(lián)可使用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)或時(shí)間模型進(jìn)行建模?；蛘撸@些因果關(guān)聯(lián)可使用無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)工藝進(jìn)行辨識(shí)，例如主成分分析和/或聚類分析?？梢允褂每赡苡绊懸粋€(gè)或多個(gè)分離的細(xì)胞群體的激活劑和抑制劑測(cè)定因果關(guān)聯(lián)。例如，在第一細(xì)胞群體中抑制可激活元件的磷酸化的抑制劑可對(duì)第二細(xì)胞群體中的第二種可激活元件具有的磷酸化具有成因效果。在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞群體之間的因果關(guān)聯(lián)在本領(lǐng)域中是已知的。因此，在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞群體之間的因果關(guān)聯(lián)的測(cè)定涉及到對(duì)本領(lǐng)域中先前測(cè)定的關(guān)聯(lián)的使用。不同的分離的細(xì)胞群體中的激活水平之間的因果關(guān)聯(lián)可以是細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)之間的通訊并且可被用于測(cè)定細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)。細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)可以關(guān)聯(lián)于，例如，藥物響應(yīng)和疾病進(jìn)展。a.動(dòng)力學(xué)激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的生成在一些實(shí)施方案中，繼治療之后可在多個(gè)時(shí)間間隔下測(cè)量分離的細(xì)胞群體或分離的細(xì)胞亞群體的激活水平以生成“動(dòng)態(tài)激活狀態(tài)數(shù)據(jù)”(本文中亦稱為動(dòng)力學(xué)激活狀態(tài)數(shù)據(jù))。在這些實(shí)施方案種，將樣品或分樣(如患者樣品)分成等份，其隨后使用一種或更多種調(diào)節(jié)劑行處理。隨后對(duì)所述不同等份用固定劑在不同時(shí)間間隔下進(jìn)行處理。所述時(shí)間間隔可大幅變化并且應(yīng)處于分鐘(如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分鐘)至小時(shí)(如
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、20、21、22、23 小時(shí))至天(如 24 小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí))或其任意組合的范圍內(nèi)。細(xì)胞還可使用不同濃度的調(diào)節(jié)劑進(jìn)行處理。在這些實(shí)施方案中，所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可進(jìn)行分析以確認(rèn)分離的細(xì)胞群體并且隨后進(jìn)行進(jìn)一步分析以對(duì)不同的分離的細(xì)胞群體隨時(shí)間對(duì)調(diào)節(jié)劑的響應(yīng)進(jìn)行特征分析。所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可進(jìn)行時(shí)間建模以對(duì)所述可激活元件對(duì)調(diào)節(jié)劑的刺激的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)進(jìn)行特征分析。對(duì)調(diào)節(jié)的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)的建?？商峁?duì)疾病的病理生理學(xué)或預(yù)后狀態(tài)或?qū)χ委煹捻憫?yīng)的更好理解。正常細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)劑的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)的建模的一個(gè)實(shí)例顯示于圖3和實(shí)施例6。另外，隨時(shí)間關(guān)聯(lián)于疾病狀態(tài)的分離的細(xì)胞群體的調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)的激活水平可與其他樣品進(jìn)行比較用以對(duì)在特定時(shí)間點(diǎn)顯示了對(duì)調(diào)節(jié)劑的異常響應(yīng)的激活水平進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)調(diào)節(jié)劑的異常響應(yīng)可被關(guān)聯(lián)于健康狀態(tài)、預(yù)后狀態(tài)、細(xì)胞發(fā)生狀態(tài)或預(yù)測(cè)的治療響應(yīng)。在不同的時(shí)間點(diǎn)獲得激活水平是有益處的，因?yàn)殛P(guān)聯(lián)于不同狀態(tài)的樣品之間的最大差異響應(yīng)可能早至用調(diào)節(jié)劑處理后5分鐘后被觀察到并可遲至用調(diào)節(jié)劑處理72小時(shí)后才可被觀察到。
可對(duì)所述不同的分離的細(xì)胞群體的調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)響應(yīng)建模以進(jìn)一步理解與疾病相關(guān)的分離的細(xì)胞群體之間的通訊。例如，在第一細(xì)胞群體中抑制可激活元件在較早時(shí)間點(diǎn)的增高的磷酸化的抑制劑可對(duì)第二細(xì)胞群體中的第二種可激活元件較晚時(shí)間點(diǎn)的磷酸化具有成因效果。這些因果聯(lián)系可使用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)或時(shí)間模型進(jìn)行建模。或者，這些因果聯(lián)系可使用無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)工藝進(jìn)行辨識(shí)，例如主成分分析和/或聚類分析。不同的分離的細(xì)胞群體的激活水平間的因果關(guān)聯(lián)可反映細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)隨時(shí)間的通訊。這些通訊可提供了對(duì)藥物響應(yīng)、癌癥進(jìn)行和癌癥發(fā)生的機(jī)理的深入認(rèn)識(shí)。因此，這些通訊的確認(rèn)和特征分析允許對(duì)可精確地預(yù)測(cè)藥物響應(yīng)的診斷方法、治療方法和早期檢測(cè)的開發(fā)。在一些實(shí)施方案中，在第一時(shí)間點(diǎn)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算分析(如，根據(jù)下文所述通過(guò)分組和門控)以測(cè)定分離的細(xì)胞群體。所述的分離的細(xì)胞群體隨后被各自隨剩余時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析以辨識(shí)對(duì)調(diào)節(jié)劑具有不同響應(yīng)的細(xì)胞亞群體。可對(duì)同一細(xì)胞群體內(nèi)隨時(shí)間的差異響應(yīng)進(jìn)行建模，其使用的方法如美國(guó)專利申請(qǐng)第61/317，817號(hào)和下文所描述的時(shí)間建?；虺臻g建模。這些方法可允許單個(gè)分離的細(xì)胞群體隨時(shí)間的建?；蚨鄠€(gè)分離的細(xì)胞群體隨時(shí)間的建模。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算在所有時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析以測(cè)定分離的細(xì)胞群體。隨后對(duì)分離的細(xì)胞群體建模用以測(cè)定分離的細(xì)胞群體隨時(shí)間的穩(wěn)定成員。通過(guò)該方式，細(xì)胞群體并非根據(jù)調(diào)節(jié)劑在單一時(shí)間點(diǎn)的激活水平而進(jìn)行特征分析，而是根據(jù)調(diào)節(jié)劑在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的激活水平而測(cè)定。門控和分組均可被用于對(duì)細(xì)胞群體在所有時(shí)間點(diǎn)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分類。根據(jù)在多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的被分類的細(xì)胞群體可辨識(shí)分離的細(xì)胞群體。盡管本工藝使用對(duì)分離的細(xì)胞群體的門控或半監(jiān)督辨識(shí)而行之有效，本工藝對(duì)于以分離的細(xì)胞群體的無(wú)監(jiān)督辨識(shí)的應(yīng)用是理想的，這樣的方法的例子如美國(guó)公開號(hào)第2009/0307248號(hào)中所描述的方法和下文的方法。分離的細(xì)胞群體的計(jì)算辨識(shí)在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的測(cè)定通過(guò)將所述細(xì)胞群體接觸于一種或更多種調(diào)節(jié)劑、對(duì)所述細(xì)胞群體生成激活狀態(tài)數(shù)據(jù)并且使用計(jì)算工藝以根據(jù)該數(shù)據(jù)辨識(shí)一個(gè)或多個(gè)分離的細(xì)胞群體而進(jìn)行。使用包括內(nèi)存和硬件的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)這些工藝。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)原始激活狀態(tài)數(shù)據(jù)生成度量的算法被存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)的內(nèi)存之中并且通過(guò)計(jì)算機(jī)的處理器被執(zhí)行。將這些算法與同樣被計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)和執(zhí)行的門控和分組算法組合使用以辨識(shí)所述分離的細(xì)胞群體。所述數(shù)據(jù)可使用多種度量進(jìn)行分析。例如，各個(gè)可激活元件的中位熒光強(qiáng)度(MFI)通過(guò)所述細(xì)胞群體控門(gate)內(nèi)的細(xì)胞的強(qiáng)度水平進(jìn)行計(jì)算。所述MFI值隨后通過(guò)將其與多種基線或背景值進(jìn)行比較而被用于計(jì)算多種度量，基線或背景值的例子如未刺激條件、自體熒光和同位素對(duì)照。下文的度量是可被用于本文所述方法的度量實(shí)例1)測(cè)量未刺激熒光物-抗體染色樣品和未經(jīng)刺激物處理或未經(jīng)染色的樣品之間中位熒光值的對(duì)數(shù)差異的度量(log (MFI未_經(jīng)_) -log (MFI門控未染色))，2)測(cè)量經(jīng)刺激熒光物-抗體染色樣品和未經(jīng)刺激物處理或未經(jīng)染色的樣品之間中位熒光值的對(duì)數(shù)差異的度量(log(MFIgS_g染色)-log(MFIne未染色))，3)測(cè)量所述經(jīng)刺激熒光物-抗體染色樣品和所述未經(jīng)刺激熒光物-抗體染色樣品之間變化的度量Iog(MFIgw^jfeft)-log (MFI未_經(jīng)_)，亦稱為“中位熒光強(qiáng)度變化倍數(shù)”，4)測(cè)量等高線圖的象限門控(Quadrant Gate)中細(xì)胞百分比的度量，其在一個(gè)或更多個(gè)維度下測(cè)量多個(gè)細(xì)胞群體，5)測(cè)量磷陽(yáng)性群體的MFI以獲得陽(yáng)性值超過(guò)背景的百分比的度量，以及6)對(duì)于大樣本群體和亞群體分析的多重性(multimodality)和分散度量(spread metrics)應(yīng)用。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中生成了參比熒光物數(shù)值(ERF)。所述ERF是中位熒光強(qiáng)度值的轉(zhuǎn)換數(shù)值。該ERF值使用校準(zhǔn)線進(jìn)行計(jì)算，所述校準(zhǔn)線通過(guò)將8峰多彩微珠(8-peakrainbow beads)的標(biāo)準(zhǔn)化組合對(duì)所有熒光通道的觀察值與制造商所設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)化值進(jìn)行擬合而測(cè)定。不同細(xì)胞樣品的ERF值可以任意方式進(jìn)行組合以生成不同的激活狀態(tài)度量。不同的度量可包括1)基于用調(diào)節(jié)劑(ERFm)處理的樣品和未經(jīng)調(diào)節(jié)劑處理的樣品(ERFu)的ERF值的倍數(shù)值，log2(ERFm/ERFu) ；2)基于用調(diào)節(jié)劑處理的樣品(ERFm)和來(lái)自自體熒光孔的樣品(ERFa)的ERF值的總磷值，Iog2 (ERFm/EREa) ；3)基于未經(jīng)調(diào)節(jié)劑處理的樣品(ERFu)和來(lái)自自體熒光孔的樣品(ERFa)的ERF值的基礎(chǔ)值，Iog2 (E RFu/ERFa) ；4)比較所述ERFjP ERFu值的曼-惠特尼統(tǒng)計(jì)Uu，其被按比例縮降為允許樣本間比較的單位間隔(0，I)；5)比較所述ERFm和ERFu值的曼-惠特尼統(tǒng)計(jì)Uu，其被按比例縮降為允許樣本間比較的單位間隔(0，1) ；5)比較所述ERFjP ERFm值的曼-惠特尼統(tǒng)計(jì)Ua，其被按比例縮降為單位間隔(0，1);以及6)曼-惠特尼統(tǒng)計(jì)U75。U75是一種線性秩統(tǒng)計(jì)量，其被設(shè)計(jì)用于辨識(shí)ERFm和ERFu值分布的上分位數(shù)的移位。位于或低于ERFm和ERFu值的第75%分位的ERF值被設(shè)為0分。剩余的ERFm和ERFu值根據(jù)所述Uu統(tǒng)計(jì)值被設(shè)為0到I之間。對(duì)于屬于細(xì)胞表面標(biāo)記物的可激活元件，可進(jìn)一步生成下列度量I)根據(jù)染色樣品ERF值(ERFjfeft)和對(duì)照樣品EFR值(ERF對(duì)照)的相對(duì)蛋白表達(dá)度量Iog2 (ERFjfeft)-Iog2 (ERF對(duì)照)；以及2)比較ERFn^PERFi值的曼-惠特尼統(tǒng)計(jì)Ui，其被按比例縮降為單位間隔(0，I)，其中所述ERFi值來(lái)自于同位素對(duì)照。不同標(biāo)記物的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)經(jīng)“門控”以在所述數(shù)據(jù)中辨識(shí)分離的細(xì)胞亞群體。在門控中，激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可被用于辨識(shí)具有某種可激活元件的不同激活水平的細(xì)胞亞群體。這些分離的細(xì)胞亞群體可對(duì)應(yīng)于細(xì)胞類型、細(xì)胞亞型、處于疾病或其他生理狀態(tài)的細(xì)胞和/或具有任何共同特征的細(xì)胞群體。在一些實(shí)施方案中，所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)被顯示為二維分散圖，并且所述分離亞群體在該分散圖中被門控或劃分。根據(jù)本實(shí)施方案，所述分離的亞群體可被自動(dòng)、手動(dòng)或使用自動(dòng)和手動(dòng)門控方法的組合進(jìn)行門控。在一些實(shí)施方案中，使用者可創(chuàng)建或手動(dòng)調(diào)整該分界或“控門”以生成新的分離的亞細(xì)胞群體。門控分離的細(xì)胞亞群體的適當(dāng)方法在美國(guó)專利第12/501295號(hào)中有所描述，出于于所有目的其全文以引用的方式并入本文。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)已知分類不同細(xì)胞類型或細(xì)胞亞型的標(biāo)記物對(duì)分離的細(xì)胞群體進(jìn)行門控。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，使用者可根據(jù)表面標(biāo)記物辨識(shí)分離的細(xì)胞群體。根據(jù)⑶34+⑶38-或⑶34+⑶33-表達(dá)細(xì)胞的“干細(xì)胞群體”;記憶⑶4T淋巴細(xì)胞；例如⑶4+CD45RA+⑶29<￡細(xì)胞；或基于^33、^45、見^-01 、^11&的多個(gè)白血病亞克隆以及對(duì)各個(gè)分離的群體/亞群體進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo)分析。在另一個(gè)替代的實(shí)施方案中，根據(jù)諸如轉(zhuǎn)錄因子或其他細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)這樣的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物；根據(jù)功能分析(如，染料排出分析以測(cè)定藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體陽(yáng)性細(xì)胞或熒光葡萄糖攝取)或根據(jù)其他熒光標(biāo)記物，使用者可辨識(shí)分離的細(xì)胞群體/亞群體。在一些實(shí)施方案中，控門被用于在現(xiàn)有獨(dú)立數(shù)據(jù)中辨識(shí)特定分離的群體和/或亞群體的存在。所述的現(xiàn)有獨(dú)立數(shù)據(jù)可以是存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)中的來(lái)自先前患者的數(shù)據(jù)，或是來(lái)自使用不同患者進(jìn)行的獨(dú)立研究的數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)將所述細(xì)胞分類成為分離的群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)而對(duì)所述分離的細(xì)胞群體/亞群體進(jìn)行自動(dòng)門控。例如，在細(xì)胞中處于“開啟”或“關(guān)閉”狀態(tài)的可激活元件可被用于將所述細(xì)胞群體分類成為兩種分離的亞群體。在對(duì)所述分離的細(xì)胞亞群體進(jìn)行自動(dòng)辨識(shí)的實(shí)施方案中，可以使用不同的算法以根據(jù)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)辨識(shí)分類細(xì)胞亞群體。在特定的實(shí)施方案中，使用多分辨率分組算法通過(guò)區(qū)分所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)對(duì)分離的細(xì)胞亞群體進(jìn)行迭代辨識(shí)。本算法在美國(guó)公開號(hào)第2009/0307248號(hào)中有所詳述，出于所有目的，其全文以引用的方式并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)將激活狀態(tài)數(shù)據(jù)區(qū)分成為更高分辨率級(jí)別的矢量或“超平面”進(jìn)行迭代辨識(shí)，所述多分辨率分組算法被用于辨識(shí)稀有或獨(dú)特分離的細(xì)胞群體。使用諸如多分辨率分組算法這樣的迭代算法，可對(duì)包括稀有細(xì)胞群體的高分辨率分組(bin)進(jìn)行辨識(shí)。例如，可對(duì)一種或更多種標(biāo)記物的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代分組以辨識(shí)具有標(biāo)記物異常高表達(dá)的少量細(xì)胞。正常情況下這些細(xì)胞會(huì)被作為“離群值”數(shù)據(jù)被舍棄或在對(duì)所述數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的時(shí)候被舍棄。但是，多分辨率分組允許對(duì)稀有細(xì)胞群體相應(yīng)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的辨識(shí)。在不同的實(shí)施方案中，門控可以不同方式被用于辨識(shí)分離的細(xì)胞群體。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)個(gè)體樣品或亞類別(如，試驗(yàn)中的患者)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行的“由外而內(nèi)”的比較被用于辨識(shí)分離的細(xì)胞群體。在這些實(shí)施方案中，細(xì)胞群體是同源的或經(jīng)譜系門控的，其門控方式得以創(chuàng)建分離的細(xì)胞類別，所述細(xì)胞類別根據(jù)某些特征(如，細(xì)胞類型、表達(dá)、亞型等)而被認(rèn)為是同源的。在AML患者中的樣品水平的比較的一個(gè)實(shí)例是對(duì)淋巴細(xì)胞(如，CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞和/或B細(xì)胞)、單核細(xì)胞+粒細(xì)胞和白血病細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)特征的辨識(shí)以及將這些群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)與臨床響應(yīng)的非隨機(jī)分布進(jìn)行關(guān)聯(lián)。這被認(rèn)為是由外而內(nèi)的方法，因?yàn)槟康姆蛛x的細(xì)胞群體在將其特征與諸如臨床結(jié)果或正常個(gè)體中的所述群體進(jìn)行映射或比較之間進(jìn)行了預(yù)定義。在其他的實(shí)施方案中，在異源群體的個(gè)體細(xì)胞水平上對(duì)激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的“由內(nèi)而夕卜”的比較被用于辨識(shí)分離的細(xì)胞群體。該比較的一個(gè)實(shí)例是在特定的條件下對(duì)混合的造血細(xì)胞進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo)狀態(tài)映射以及隨后對(duì)經(jīng)計(jì)算而辨識(shí)的細(xì)胞集類與譜系特異性標(biāo)記物進(jìn)行的比較。這被認(rèn)為是單細(xì)胞研究的由內(nèi)而外的方法，因?yàn)槠湓诜诸愔安⑽醇俣ㄌ囟ǚ蛛x的細(xì)胞群體的存在。用于分離的細(xì)胞群體的由內(nèi)而外的辨識(shí)的適當(dāng)方法包括上文所述的多分辨率分組算法。該方法的一個(gè)主要缺點(diǎn)是其創(chuàng)建了細(xì)胞群體，其至少在最初需要多種瞬時(shí)標(biāo)記物以進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且可能不再能接觸某一細(xì)胞表面表位。因此，可能難以測(cè)定這樣的分離的細(xì)胞群體的生物學(xué)意義。這一非傳統(tǒng)方法的主要優(yōu)點(diǎn)是對(duì)分離的細(xì)胞群體的無(wú)偏跟蹤，其在譜系或細(xì)胞類型之間不帶有潛在的主觀區(qū)別，并其具有將所述不同群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)用于測(cè)定個(gè)體狀態(tài)的潛力。這些工藝均利用流式細(xì)胞儀的能力以在單細(xì)胞水平產(chǎn)生大量多參量數(shù)據(jù)。對(duì)于關(guān)聯(lián)于病狀(如癌癥發(fā)生或造血機(jī)能病狀)的分離的細(xì)胞群體，由于關(guān)聯(lián)于病狀的細(xì)胞(如癌癥細(xì)胞)通常被作為單個(gè)實(shí)體處理或根據(jù)先前工藝進(jìn)行分類，因而存在第三種“元水平(meta-level) ”的數(shù)據(jù)。這些工藝已經(jīng)包括器官或組織發(fā)生來(lái)源、分化程度、增殖指數(shù)、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和有關(guān)所述患者的遺傳或代謝數(shù)據(jù)。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明使用了被用于映射病狀信號(hào)傳導(dǎo)空間(conditionsignaling space)的差異映射工藝(variance mapping techniques)。這些方法是病狀生物學(xué)研究的重要進(jìn)展，因?yàn)槠鋵?shí)現(xiàn)了不依賴推定正常對(duì)照(putative normal control)的病狀比較。傳統(tǒng)的差異狀態(tài)分析方法(如，DNA微陣列、削減Northern印跡)一般依賴于將來(lái)自各個(gè)患者的關(guān)聯(lián)于病狀的細(xì)胞與正常對(duì)照進(jìn)行比較，正常對(duì)照一般為鄰近的并且理論上未轉(zhuǎn)型的組織?；蛘?，它們依賴于多聚類或重新集類成組群(group)并且進(jìn)一步根據(jù)表型對(duì)患者樣品分組。與之對(duì)比，病狀狀態(tài)的差異映射將病狀樣品首先與其自身進(jìn)行比較然后與其親本病狀群體進(jìn)行比較。因此，在病狀中具有最大多樣性的活性狀態(tài)在所述差異狀態(tài)分析中提供了核心參量。對(duì)于一個(gè)給定的多樣病狀庫(kù)(pool of diverse conditions),本工藝使得研究人員得以辨識(shí)造成差異病狀病理(如，癌癥對(duì)于化療的響應(yīng))的分子事件，而非病狀與假定正常對(duì)照之間的差異。
在一些實(shí)施方案中，當(dāng)差異映射被用于對(duì)患者樣品的信號(hào)傳導(dǎo)空間進(jìn)行特征化的時(shí)候，對(duì)調(diào)節(jié)劑具有信號(hào)傳導(dǎo)響應(yīng)的病狀被集合成一個(gè)組群，無(wú)論其組織或細(xì)胞類型的來(lái)源。類似地，根據(jù)譜系標(biāo)記物或組織來(lái)源而被認(rèn)為相對(duì)類似的兩種病狀(如，兩種腫瘤)可具有差別巨大的反映環(huán)境刺激的能力并且應(yīng)為特征化成為兩種不同的類別。根據(jù)關(guān)聯(lián)于分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)而對(duì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的分類和特征分析當(dāng)關(guān)聯(lián)于多個(gè)分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)已被辨識(shí)，測(cè)定激活狀態(tài)數(shù)據(jù)是否在所述類別中非隨機(jī)分布通常是有用的，該類別的例子如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、臨床響應(yīng)、基因突變的存在和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。與具有特定特征(如，基因突變和疾病狀態(tài))的一個(gè)或多個(gè)分離的細(xì)胞群體緊密關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可被兼用于根據(jù)所述特征對(duì)細(xì)胞分類和對(duì)造成所述特征的病理生理的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)通訊進(jìn)一步進(jìn)行特征分析和了解。對(duì)關(guān)聯(lián)于細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的分離的細(xì)胞群體進(jìn)行匹配辨識(shí)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可作用于強(qiáng)化或補(bǔ)充對(duì)關(guān)聯(lián)于所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的另外分離的細(xì)胞群體進(jìn)行匹配辨識(shí)的其他激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。如果對(duì)于多種分離的細(xì)胞群體可獲得激活狀態(tài)數(shù)據(jù)，可使用簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)辨識(shí)對(duì)分離的細(xì)胞群體進(jìn)行匹配辨識(shí)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)，例如學(xué)生t檢驗(yàn)和X2檢驗(yàn)。類似地，如果所述實(shí)驗(yàn)內(nèi)的兩種分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)被認(rèn)為是相關(guān)的，來(lái)自線性回歸的r2相關(guān)系數(shù)可被用于表述這一相關(guān)性的程度。其他方法包括皮爾森和斯皮爾曼秩相關(guān)(rankcorrelation)。在一些實(shí)施方案中，相關(guān)和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)算法被存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)的內(nèi)存之中并且被所述計(jì)算機(jī)的處理器執(zhí)行。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定不同的分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)是否與細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和/或特征相關(guān)聯(lián)的方法，這些方法可潛力相互補(bǔ)充以提高分類的精確度。在一些實(shí)施方案中，所述分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可被用于生成對(duì)關(guān)聯(lián)于所述分離的細(xì)胞群體的一種或更多種特征的分類器，所述特征包括但不限于治療響應(yīng)、疾病狀態(tài)和疾病預(yù)后。本文所述的分類器是任意類型的統(tǒng)計(jì)模型，其可被用于對(duì)一個(gè)樣品和一類樣品之間的相似性進(jìn)行特征分析。正如所述術(shù)語(yǔ)分類器的傳統(tǒng)用法，分類器可包括二元和多元分類器。分類器還可包括僅在一類樣品(如，正常個(gè)體)內(nèi)的激活水平和差異的統(tǒng)計(jì)模型。這些單類分類器可被應(yīng)用于數(shù)據(jù)，例如來(lái)自未診斷的樣品，從而生成相似性數(shù)值，該值可被用于測(cè)定所述未診斷樣品是否屬于該類樣品(如，通過(guò)使用一種閾值相似性數(shù)值)。本領(lǐng)域中已知的任意適當(dāng)?shù)姆椒杀挥糜诋a(chǎn)生所述分類器。例如，簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)可被用于產(chǎn)生分類器?？杀挥糜诋a(chǎn)生分類器的分類算法的實(shí)例包括但不限于，線性分類器、費(fèi)雪線性判別(Fisher' s linear discriminant)、ANOVA、邏輯回歸、樸素貝葉斯分類器、感知器(Perceptron)、支持向量機(jī)(Support vector machines)、二次分類器、核估計(jì)法(Kernel estimation)、k緊鄰算法、增強(qiáng)算法(Boosting)、決策樹、隨機(jī)森林法、類神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、貝葉斯網(wǎng)絡(luò)、隱馬爾可夫模型和學(xué)習(xí)向量量化。因此，在一些實(shí)施方案中，不同類型的分類算法可被用于產(chǎn)生所述分類器，其包括但不限于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、支持向量機(jī)(SVM)、裝袋算法(bagging)、增強(qiáng)算法和邏輯回歸。在一些實(shí)施方案中，與相同網(wǎng)絡(luò)和/或特征相關(guān)聯(lián)的不同分離的群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可在產(chǎn)生分類器之前被匯集，所述分類器明確了與分離的細(xì)胞群體相關(guān)聯(lián)的哪一激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的組合可被用于根據(jù)可激活元件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行匹配辨識(shí)和分類。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，如果關(guān)聯(lián)于所述分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)量較小，可采用直接的角分類器，其用于檢出對(duì)不同的分離的細(xì)胞群體進(jìn)行匹配辨識(shí)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的組合。也可通過(guò)下文所述的自舉法(bootstrapping approach)對(duì)分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的組合進(jìn)行針對(duì)其穩(wěn)定性的檢驗(yàn)。在本實(shí)施方案中，角分類算法可被用與所述數(shù)據(jù)。所述角分類器是一種基于規(guī)則的算法，其用于使用一種或更多種數(shù)字變量(如，群體/節(jié)點(diǎn)組合)將對(duì)象分成兩類(如，對(duì)于治療的二分反應(yīng))。本方法通過(guò)對(duì)各變量設(shè)置 閾值并且隨后將產(chǎn)生的間隔(如，X <10或Y >50)同與(邏輯與)操作(參比)相組合而進(jìn)行。這產(chǎn)生了一個(gè)矩形區(qū)間，其被預(yù)期涵蓋先前被辨識(shí)為目標(biāo)的類別的多數(shù)成員(如，治療的響應(yīng)者或無(wú)響應(yīng)者)。通過(guò)在各類之中根據(jù)評(píng)定轉(zhuǎn)換錯(cuò)誤分類率(logit-transformedmisclassification rate)對(duì)誤差標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的最小化而選擇閾值。所述方法假定所述二元類別(如，對(duì)治療有響應(yīng)或無(wú)響應(yīng))傾向于隨所使用的變量而具有不同定位，并且在這些變量的單調(diào)轉(zhuǎn)換下是無(wú)變化的。在一些實(shí)施方案中，在分類器生成期間使用了交叉驗(yàn)證的計(jì)算方法以測(cè)量所述分類器的精確度并且防止所述分類器對(duì)所述數(shù)據(jù)的過(guò)度擬合。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，裝袋算法，亦稱為自舉集成法，被用于對(duì)上述統(tǒng)計(jì)模型的結(jié)果進(jìn)行交叉驗(yàn)證。在本實(shí)施方案中，從原始數(shù)據(jù)中迭代抽取復(fù)樣本(re-sample)并將之用于對(duì)所述分類器進(jìn)行驗(yàn)證。各個(gè)分類器，如群體/節(jié)點(diǎn)組合，被用于對(duì)所述復(fù)樣本進(jìn)行擬合并且用于對(duì)被排除于所述復(fù)樣本之外的患者的類別歸屬關(guān)系(class membership)進(jìn)行預(yù)測(cè)。對(duì)各個(gè)分類器的假陽(yáng)性和假陰性分類的精確度進(jìn)行測(cè)定。在對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代再取樣之后，各個(gè)患者獲得了根據(jù)使用其他患者進(jìn)行擬合的分類器而預(yù)測(cè)的類別歸屬關(guān)系列單。各個(gè)患者的列單被簡(jiǎn)化成為目標(biāo)類別預(yù)測(cè)的分?jǐn)?shù)；所述目標(biāo)類別的成員應(yīng)具有接近I的分?jǐn)?shù)，與其他類別的成員相區(qū)別。這樣的分?jǐn)?shù)群組，與所述患者的實(shí)際類別歸屬關(guān)系，被用于創(chuàng)建接收者操作特征曲線(Receiver OperatorCurve)并且被用于計(jì)算該ROC曲線下的面積(本文稱為“AUC”)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)高于60、70、80、90、95或99. 9%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述PPV等于或高于95%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述陰性預(yù)測(cè)值(NPV)高于60、70、80、90、95或99. 9%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述NPV高于85%。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)2年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述PPV高于60、70、80、90、95或99. 9%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)2年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述PPV等于或高于95%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)2年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述NPV高于60、70、80、90、95或99. 9%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)2年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述NPV高于80%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)5年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述PPV高于60、70、80、90、95或99. 9%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)5年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述PPV等于或高于95%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)5年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述NPV高于60、70、80、90、95或99. 9%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)5年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述NPV高于80%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)10年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述PPV高于60、70、80、90、95或99. 9%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)10年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述PPV等于或高于95%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)10年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述NPV高于60、70、80、90、95或99. 9%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測(cè)10年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述NPV高于80%。在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法的分析中的p值低于0. 05,04,0. 03,0. 02、0. 01、0. 009、0. 005或0. 001。在一些實(shí)施方案中，所述p值低于0. 001。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述P值低于0. 05,04,0. 03,0. 02,0. 01,0. 009,0. 005或0. 001。在一些實(shí)施方案中，所述P值低于0. 001。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述AUC值高于0. 5,0. 6,07,0. 8或0.9。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述AUC值高于0.7。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述AUC值高于0. 8。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述AUC值高于0. 9。在另一個(gè)實(shí)施方案中，隨一系列時(shí)間點(diǎn)而對(duì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可被用于辨識(shí)在所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)內(nèi)隨時(shí)間顯示獨(dú)特的通訊的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。在所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)內(nèi)顯示獨(dú)特的通訊的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可被用于對(duì)關(guān)聯(lián)于細(xì)胞群體的其他激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類以測(cè)定它們是否關(guān)聯(lián)于與所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)相同的特征或測(cè)定是否存在對(duì)于細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)是獨(dú)特的特定時(shí)間階段或狀態(tài)。例如，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中的不同的分離的細(xì)胞群體可用相同的調(diào)節(jié)劑進(jìn)行處理并隨一系列時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行次級(jí)取樣，以測(cè)定對(duì)所述調(diào)節(jié)劑的刺激是獨(dú)特的細(xì)胞分離的群體之間的通訊。類似地，不同的分離的細(xì)胞群體的樣品可來(lái)自于療程內(nèi)的患者并被用于辨識(shí)對(duì)于所述療程是獨(dú)特的分離的細(xì)胞群體之間的通訊。在一個(gè)實(shí)施方案中，可對(duì)所述細(xì)胞群體在不同時(shí)間點(diǎn)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模以顯示細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中該分離的細(xì)胞群體之間隨時(shí)間的動(dòng)力學(xué)相互作用。所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可使用時(shí)間模型、貝葉斯網(wǎng)絡(luò)或一些組合進(jìn)行建模。生成貝葉斯網(wǎng)絡(luò)的適當(dāng)方法在11/338,957中有所描述，出于所有目的其全文以引用的方式并入本文。生成激活狀態(tài)的時(shí)間模型的適當(dāng)方法在美國(guó)專利申請(qǐng)第61/317，817號(hào)中有所描述，以引用的方式并入本文?？缮刹煌亩攘恳悦枋鏊鰟?dòng)力學(xué)相互作用，其包括導(dǎo)數(shù)、積分、變化率度量、仿樣(splines)、激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的狀態(tài)表示以及激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的布爾表示。在生成了描述動(dòng)力學(xué)相互作用的度量和其他數(shù)值的實(shí)施方案中，這些數(shù)值和度量被用于生成分類器。如上文所述，任何適當(dāng)?shù)姆诸愃惴杀挥糜跍y(cè)定對(duì)具有相同特征的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配辨識(shí)的度量和數(shù)值。在一些實(shí)施方案中，所述描述值和度量將根據(jù)兩個(gè)獨(dú)特的數(shù)據(jù)組而生成1)關(guān)聯(lián)于一種特征的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)以及2)與一種特征無(wú)關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。例如在用調(diào)節(jié)劑進(jìn)行刺激后由分離的細(xì)胞群體中生成的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)和從由未刺激的分離的細(xì)胞群體生成的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。在這些實(shí)施方案中，所述描述值和度量將被用于生成一種二元分類器。在其他實(shí)施方案中，描述值和度量將從關(guān)聯(lián)于不同特征的大量活性狀態(tài)數(shù)據(jù)組中生成，并且將生成多元分類器。所產(chǎn)生的分類器將被用于測(cè)定細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)是否是所述數(shù)據(jù)組的一部分。在一些實(shí)施方案中，上述分類器被用于對(duì)來(lái)自諸如患者這樣的個(gè)體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行特征分析。在這些實(shí)施方案中，與一種或更多種細(xì)胞群體的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)相關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)來(lái)自于患者。在一些實(shí)施方案中，與來(lái)自患者的不同細(xì)胞群體相關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可通過(guò)獲取具有不同特征的患者樣品而進(jìn)行辨識(shí)。在一些實(shí)施方案中，與來(lái)自患者的不同細(xì)胞群體相關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可根據(jù)可激活元件的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算辨識(shí)，所述可激活元件已知能區(qū)分分離的細(xì)胞群體。對(duì)來(lái)自被不同的分離的細(xì)胞群體的用于測(cè)定所述細(xì)胞是否具有相同特征的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明的分類器被應(yīng)用于與所述個(gè)體相關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)以生成分類數(shù)值，該數(shù)值明確了所述個(gè)體(或來(lái)自該個(gè)體的細(xì)胞)與所述特征相關(guān)聯(lián)的可能性。在多數(shù)實(shí)施方案中，所述分類器以數(shù)值組或可執(zhí)行代碼的形式被存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)存或可被計(jì)算機(jī)讀取的存儲(chǔ)介質(zhì)之中，并且所述分類器的應(yīng)用包含了執(zhí)行代碼，所述代碼將該分類器應(yīng)用于關(guān)聯(lián)于所述個(gè)體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。所述分類數(shù)值可對(duì)使用者輸出、轉(zhuǎn)移至請(qǐng)求所述分類數(shù)值的實(shí)體和/或存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)的內(nèi)存之中。所述分類數(shù)值可以是相關(guān)于或代表了所述個(gè)體的諸如診斷、預(yù)后或?qū)χ委煹念A(yù)測(cè)性響應(yīng)這樣的生理狀態(tài)的信息。在一些實(shí)施方案中，在正常個(gè)體或者未罹患或未被懷疑罹患病狀的個(gè)體中測(cè)定了多個(gè)細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可被用于創(chuàng)建來(lái)自樣品的細(xì)胞群體中所觀察到的激活水平范圍的統(tǒng)計(jì)模型(如，回歸模型，方差模型)，所述樣品獲自正?；颊?。該范圍和/或模型可被用于測(cè)定來(lái)自未診斷個(gè)體的樣品是否表現(xiàn)出正常樣品中所觀察到的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)范圍(如，正常激活水平的范圍)。這可被用于創(chuàng)建用于正常個(gè)體的分類器。在一些實(shí)施方案中，所述模型可被用于生成相似度數(shù)值和/或概率值，所述相似度數(shù)值顯示了關(guān)聯(lián)于所述未診斷個(gè)體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)與正常激活水平范圍(如，相關(guān)系數(shù)、擬合度量)的相似度，所述概率值顯示了所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)偶然地與正常激活水平相似的概率(即，概率值和/或相關(guān)置信值)。在其他的實(shí)施方案中，來(lái)自正常個(gè)體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可被與來(lái)自已知患有疾病的患者的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)合以創(chuàng)建二元或多元分類器。在一些實(shí)施方案中，來(lái)自未診斷個(gè)體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)將與正常細(xì)胞內(nèi)所觀察到的激活狀態(tài)范圍一起以圖形方式顯示。這使得某些人們，例如醫(yī)生，得以直觀地獲得關(guān)聯(lián)于未診斷患者的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)與來(lái)自正常個(gè)體的樣品中所觀察到的激活狀態(tài)范圍之間的相似度。對(duì)獲自正?；颊叩臉悠匪a(chǎn)生的細(xì)胞群體中觀察到的激活水平范圍的統(tǒng)計(jì)模型或特征進(jìn)行創(chuàng)建以及它們?cè)趯?duì)個(gè)體進(jìn)行分類中的應(yīng)用的實(shí)例在題為“Benchmarks for Normal CellIdentification”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)中有所描述，其提交于2010年9月8日，律師檔案號(hào)為134. 001，出于所有目的其全文以引用的方式并入本文。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括了用于對(duì)可能癌化的細(xì)胞進(jìn)行估測(cè)的方法。所述細(xì)胞根據(jù)本文描述被用于所述方法并且與正常細(xì)胞群體進(jìn)行對(duì)比。所述對(duì)比可使用本文所述的任意算法而完成。在一些實(shí)施方案中，所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)以圖像方式顯示。一般情況下，當(dāng)以圖形顯示的時(shí)候，正常細(xì)胞具有一致的群體并且緊密成組具有狹窄邊界。當(dāng)癌化細(xì)胞或前癌化細(xì)胞被用于與正常細(xì)胞相同的方法(如，一種或更多種調(diào)節(jié)劑進(jìn)行的處理)并且以相同圖形顯示之時(shí)，與該圖顯示的標(biāo)準(zhǔn)的差異顯示出更為異源化的群體。圖2和實(shí)施例5中展示了一個(gè)實(shí)例。該變化是所述細(xì)胞可能癌化的跡象，其癌化的方式是變化程度的函數(shù)。形態(tài)學(xué)變化可顯示了處于從輕度到具有轉(zhuǎn)移性的發(fā)展中的癌化群體。如果較之正常細(xì)胞無(wú)形狀變化，則所述細(xì)胞表型中可能無(wú)變化。異源細(xì)胞群體的存在可表示需要治療。所述治療的結(jié)果可通過(guò)參比該圖而進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在圖表中更具異源性的群體向更為緊密成組的群體的變化可能表示所述細(xì)胞群體正向正常狀態(tài)回歸。變化的缺乏可能表示所述治療無(wú)效并且所述細(xì)胞群體是頑固的或?qū)χ委熡锌剐?。其還表示不同的分離的細(xì)胞群體已經(jīng)變成了所述癌化表型。返回正常的變化的缺乏是對(duì)治療的負(fù)關(guān)聯(lián)指征。這些變化可能是基因水平或基因外水平(epigenetic)的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是，通過(guò)分析正常細(xì)胞群體以創(chuàng)建可以通過(guò)圖形方式與可能癌化的細(xì)胞群體進(jìn)行比較的模式或數(shù)據(jù)庫(kù)，從而實(shí)施本發(fā)明所述的方法。所述分析可通過(guò)多種方法進(jìn)行，但一種優(yōu)選的方法是使用流式細(xì)胞儀。在所有這些實(shí)施方案中，所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可在中心實(shí)驗(yàn)室生成并且所述分類器可在所述中心實(shí)驗(yàn)室被應(yīng)用于所述數(shù)據(jù)?；蛘撸黾せ顮顟B(tài)數(shù)據(jù)可通過(guò)第三方生成并且傳遞至中心實(shí)驗(yàn)室以用于分類，例如通過(guò)安全網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行傳遞。傳遞用于分類和分析的數(shù)據(jù)的適當(dāng)方法在美國(guó)專利申請(qǐng)第12/688，851號(hào)中有所描述，出于于所有目的其全文以引用的方式并入本文。方法在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及方法和組合物，以及實(shí)現(xiàn)對(duì)個(gè)體狀態(tài)和/或包含至少兩種分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的測(cè)定的試劑盒。本文所述的用于任意病狀的方法和組合物以及試劑盒，對(duì)于所述病狀可在來(lái)自個(gè)體的樣品中探知所述病狀、其預(yù)后、治療進(jìn)程或其他相關(guān)特征與細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)和/或多元細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)如一種或更多種可激活元件在該群體中的激活水平之間的關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于對(duì)疾病治療和預(yù)測(cè)方法進(jìn)行分析、藥物篩選、診斷、預(yù)后的方法和組合物以及試劑盒。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法。在一些實(shí)施方案中，樣品中的不同的分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)被用于(例如在病癥的診斷和預(yù)后中，在使用某些上文所辨識(shí)出的藥劑的治療所進(jìn)行的患者選擇中)監(jiān)測(cè)治療、調(diào)整治療方案和/或進(jìn)一步優(yōu)化治療劑的選擇，所述治療劑以一種或治療劑的組合進(jìn)行施用。因此，根據(jù)治療前和治療進(jìn)程中的不同時(shí)間所獲得的數(shù)據(jù)治療方案可被個(gè)體化并且進(jìn)行定制，由此提供了適用于個(gè)體的方案。在一些實(shí)施方案中，化合物被與細(xì)胞接觸從而分析其對(duì)所述化合物的響應(yīng)。可通過(guò)在所述細(xì)胞群體的一種或更多種細(xì)胞內(nèi)定量對(duì)至少一種調(diào)節(jié)劑響應(yīng)的至少一種可激活元件的激活水平而產(chǎn)生分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了包含兩個(gè)或更多分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)的測(cè)定。本發(fā)明的方法提供了可用于對(duì)罹患疾病的個(gè)體的治療的工具，其包括但不限于用于設(shè)定風(fēng)險(xiǎn)組的方法、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的升高風(fēng)險(xiǎn)的方法、預(yù)測(cè)發(fā)展次級(jí)并發(fā)癥的升高風(fēng)險(xiǎn)的方法、為個(gè)體選擇治療方法的方法、預(yù)測(cè)性響應(yīng)持續(xù)時(shí)間、個(gè)體對(duì)治療的響應(yīng)的方法、在個(gè)體中測(cè)定療效的方法、以及對(duì)個(gè)體測(cè)定預(yù)后的方法。細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)可作為預(yù)后指征發(fā)揮作用以預(yù)測(cè)病狀進(jìn)程，如個(gè)體中的癌癥或造血機(jī)能病狀將是進(jìn)展迅速的還是慢性的，由此而在管理患者和評(píng)測(cè)將使用的治療方式中對(duì)臨床醫(yī)生進(jìn)行輔助。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明向醫(yī)生提供了信息以在對(duì)患者的臨床管理中進(jìn)行輔助，從而使所述信息可被轉(zhuǎn)化成為措施，包括治療、預(yù)后或預(yù)測(cè)。在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法被用于篩選可用于病狀治療的候選化合物， 或被用于辨識(shí)新的藥物目標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體的狀態(tài)或所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)可被用于確認(rèn)或排除關(guān)聯(lián)于疾病的升高風(fēng)險(xiǎn)的可疑基因或生理異常的存在。這樣的測(cè)試方法學(xué)可取代其他的確認(rèn)工藝如細(xì)胞發(fā)生分析或原位組織化學(xué)熒光(FISH)。在另一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體的狀態(tài)或所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)可被用于確認(rèn)或排除前病理或病理病狀的診斷。在個(gè)體具有已知的病理前或病理病狀的情況下，所述個(gè)體的狀態(tài)或所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)可被用于預(yù)測(cè)所述個(gè)體對(duì)可行的治療選項(xiàng)的響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，受到目的為使起因于或相關(guān)于病理前或病理病狀的細(xì)胞數(shù)量降低或消除的治療的個(gè)體可被監(jiān)測(cè)以估測(cè)這些細(xì)胞隨時(shí)間的減少和細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)。成因性或相關(guān)性細(xì)胞的降低可與疾病癥狀的消失或減弱相關(guān)聯(lián)或無(wú)關(guān)聯(lián)，例如，取決于所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)。如果未發(fā)生預(yù)期的細(xì)胞數(shù)量降低和/或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的改善，可能需要以相同或者不同的治療方案進(jìn)行進(jìn)一步治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可對(duì)接受治療以逆轉(zhuǎn)或停止病理前病狀的發(fā)展的個(gè)體進(jìn)行監(jiān)測(cè)以估測(cè)所述逆轉(zhuǎn)速度或被停止在該病理前狀態(tài)點(diǎn)的細(xì)胞的百分比。如果未見到預(yù)期的逆轉(zhuǎn)速度或細(xì)胞未被停止在所需的病理前狀態(tài)點(diǎn)，可以考慮使用相同或不同的治療方案進(jìn)行進(jìn)一步治療。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可對(duì)個(gè)體的細(xì)胞進(jìn)行分析以查看使用分化劑進(jìn)行的治療是否按照特異性組織譜系驅(qū)動(dòng)某一細(xì)胞類型，并且以使之最終分化而隨后失去增殖或更新能力。這樣的治療可被預(yù)防性地用于將與疾病相關(guān)的去分化細(xì)胞的數(shù)量保持于低水平，因而預(yù)防了明顯疾病(overt disease)的發(fā)展。或者，可在再生醫(yī)學(xué)中使用這樣的治療從而誘導(dǎo)或引導(dǎo)多潛能干細(xì)胞或多能干細(xì)胞分化降至所需的組織或器官特異性譜系并且因而加速或改善了康復(fù)過(guò)程。還可監(jiān)測(cè)個(gè)體的與良性預(yù)后相關(guān)的分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞的出現(xiàn)或數(shù)量的提高。如果觀測(cè)到有利的分離的細(xì)胞群體，可采取措施以進(jìn)一步提高他們的數(shù)量，例如施用生長(zhǎng)因子。或者，還可對(duì)個(gè)體進(jìn)行監(jiān)測(cè)以針對(duì)與不良預(yù)后相關(guān)的分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞的出現(xiàn)或數(shù)量的提高。在這樣的情況下，可以考慮進(jìn)行更新性治療，其包含繼續(xù)進(jìn)行、修改當(dāng)前治療或起始另一類型的治療。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體狀態(tài)的測(cè)定可被用于確認(rèn)先前病狀或治療是否已經(jīng)誘發(fā)了需要監(jiān)測(cè)和/或治療的新的病理前或病理病狀。例如，對(duì)多種形式癌癥(如淋巴瘤和幼JL白血病)的治療可誘發(fā)特定的成人白血病，并且本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)這樣的白血病的早期檢測(cè)和治療。本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如個(gè)體疾病狀態(tài)這樣的特征的方法，其通過(guò)分析所述個(gè)體中的不同的分離的細(xì)胞群體而進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體的疾病狀態(tài)通過(guò)包括以下的方法而進(jìn)行測(cè)定使用至少第一調(diào)節(jié)劑接觸來(lái)自所述個(gè)體的分離的第一細(xì)胞群體的第一細(xì)胞、使用至少第二調(diào)節(jié)劑接觸來(lái)自所述個(gè)體的分離的第二細(xì)胞群體的第二細(xì)胞、在所述第一細(xì)胞和所述第二細(xì)胞內(nèi)測(cè)定至少一種可激活元件的激活水平、為所述個(gè)體創(chuàng)建包含所述可激活元件的所述被測(cè)定的激活水平的響應(yīng)表單、以及根據(jù)所述個(gè)體的疾病狀態(tài)而做出決策，其中所述決策基于所述響應(yīng)表單。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本文的描述可從所述個(gè)體獲取一種或更多種包含不同的分離的細(xì)胞群體的樣品并且使其接觸調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，所述樣品可被分成分樣，其各自接觸不同的調(diào)節(jié)劑。在以所述調(diào)節(jié)劑進(jìn)行處理之后，對(duì)所述樣品或分樣中的不同的分離的細(xì)胞群體進(jìn)行分析以測(cè)定它們的激活狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)所述不同的分離的細(xì)胞群體中的單細(xì)胞進(jìn)行了分析?？墒褂脤?shí)現(xiàn)對(duì)激活水平的測(cè)定的任意適當(dāng)形式的分析。在一些實(shí)施方案中，所述分析包括對(duì)諸如蛋白質(zhì)這樣的細(xì)胞內(nèi)元件的激活水平的測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，所述分析包括對(duì)可激活元件的激活水平的測(cè)定，例如細(xì)胞內(nèi)可激活元件如蛋白質(zhì)，例如磷酸蛋白。根據(jù)本文所述，所述激活水平的測(cè)定的完成可通過(guò)使用激活狀態(tài)特異性結(jié)合元件，例如抗體?？稍谝环N或更多種所述不同的分離的細(xì)胞群體中檢測(cè)多個(gè)可激活元件。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定個(gè)體的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的方法，其通過(guò)分析所述個(gè)體中的不同的分離的細(xì)胞群體而進(jìn)行。不同的分離的細(xì)胞群體的分析實(shí)現(xiàn)了在參與細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的不同的分離的細(xì)胞群體中測(cè)定方向性(如，向量)。所述不同的分離的細(xì)胞群體的分析可通過(guò)在該不同的分離的細(xì)胞群體中測(cè)定至少一種可激活元件響應(yīng)于調(diào)節(jié)劑的激活水平而實(shí)施。在一些實(shí)施方案中，所述不同的分離的細(xì)胞群體的分析通過(guò)將各個(gè)分離的細(xì)胞群體分解成為多元樣品并且在該樣品中測(cè)定至少一種可激活元件響應(yīng)于調(diào)節(jié)劑的激活水平而實(shí)施。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明針涉及通過(guò)對(duì)來(lái)自所述個(gè)體的多個(gè)不同的分離的細(xì)胞群體使用調(diào)節(jié)劑而測(cè)定病狀在個(gè)體中存在與否的方法，在所述多個(gè)分離的細(xì)胞群體中測(cè)定可激活元件的激活水平的方法，以及根據(jù)使用調(diào)節(jié)劑進(jìn)行的治療下的激活水平而測(cè)定所述病狀的存在與否的方法。在一些實(shí)施方案中，各個(gè)分離的細(xì)胞群體在分開的培養(yǎng)物中接觸不同的調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，各個(gè)分離的細(xì)胞群體在同一培養(yǎng)物或分開的培養(yǎng)物中接觸相同的調(diào)節(jié)劑。本文所述的與調(diào)節(jié)劑相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“相同的調(diào)節(jié)劑”包括所述調(diào)節(jié)劑的活性片段或部分、與該調(diào)節(jié)劑結(jié)合相同目標(biāo)的調(diào)節(jié)劑和/或與該調(diào)節(jié)劑調(diào)控相同信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)劑。例如，當(dāng)根據(jù)本文所述用調(diào)節(jié)劑處理分離的細(xì)胞群體時(shí)，用所述相同的調(diào)節(jié)劑進(jìn)行處理的另一種分離的細(xì)胞群體的處理可使用所述的活性片段或部分、與該調(diào)節(jié)劑結(jié)合相同目標(biāo)的調(diào)節(jié)劑和/或與該調(diào)節(jié)劑調(diào)控相同信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)劑而進(jìn)行。在一些實(shí)施 方案中，一些分離的細(xì)胞群體在同一或分開的培養(yǎng)物中接觸所述相同的調(diào)節(jié)劑，而其他分離的細(xì)胞群體接觸不同的調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞群體的接觸在所述第一細(xì)胞與所述第二細(xì)胞從所述個(gè)體中分離之前進(jìn)行，例如，當(dāng)諸如化學(xué)品這樣的所述調(diào)節(jié)劑是處于所述個(gè)體體內(nèi)的細(xì)胞環(huán)境之中的時(shí)候進(jìn)行。因此，在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)劑存在于所述個(gè)體體內(nèi)并且所述分離的細(xì)胞群體在該個(gè)體體內(nèi)的細(xì)胞環(huán)境中接觸所述調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的測(cè)定包括對(duì)特異地相關(guān)于自體免疫疾病的病理發(fā)生的免疫細(xì)胞的激活狀態(tài)的監(jiān)測(cè)和測(cè)定。特定免疫細(xì)胞可在其處于體外或體內(nèi)的治療壓力之下的時(shí)候隨時(shí)間進(jìn)行監(jiān)測(cè)以提供指導(dǎo)患者管理的信息。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)高于60、70、80、90、95或99. 9%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述PPV等于或高于95%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述陰性預(yù)測(cè)值(NPV)高于60、70、80、90、95或99. 9%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述NPV高于85%。在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法的分析中的p值低于0. 05,04,0. 03,0. 02、0. 01,0. 009,0. 005或0. 001。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定諸如疾病狀態(tài)、治 療響應(yīng)、和/或臨床響應(yīng)這樣的個(gè)體狀態(tài)的方法，其中所述AUC值高于0. 5、0. 6、07、0. 8或0.9。在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞群體是細(xì)胞的群體，其中每一個(gè)細(xì)胞具有相同或基本相同的細(xì)胞外標(biāo)記物組或細(xì)胞外標(biāo)記物范圍，其被用于辨識(shí)該分離的細(xì)胞群體。所述的細(xì)胞外標(biāo)記物組可以是一種細(xì)胞外標(biāo)記物。例如，“干細(xì)胞群體”的特征在于⑶34+⑶38-或⑶34+⑶33-表達(dá)細(xì)胞，記憶⑶4T淋巴細(xì)胞的特征在于⑶4+0045狀+0029<￡細(xì)胞，并且多白血病亞克隆可根據(jù)⑶33、⑶45、HLA-DR、⑶Ilb進(jìn)行辨識(shí)。除細(xì)胞外標(biāo)記物之夕卜，諸如蛋白質(zhì)這樣的細(xì)胞內(nèi)生物分子的表達(dá)水平可被單獨(dú)使用或與所述細(xì)胞外標(biāo)記物組合使用以辨識(shí)細(xì)胞群體。另外，另外的細(xì)胞元件，如生物分子或分子復(fù)合物，如RNA、DNA、碳水化合物、代謝物等等，可與細(xì)胞外標(biāo)記物和/或在辨識(shí)本文所包含的細(xì)胞群體中的表達(dá)水平組合使用。在一些實(shí)施方案中，影響細(xì)胞組成的狀態(tài)的生物過(guò)程可被用于辨識(shí)細(xì)胞群體。實(shí)例包括生物分子的轉(zhuǎn)位或其周轉(zhuǎn)數(shù)的變化以及生物分子復(fù)合物的形成和解離。這樣的復(fù)合物可包括，多蛋白質(zhì)復(fù)合物、多脂質(zhì)復(fù)合物、同二聚物或異二聚物或寡聚物，及其組合。其他的特征包括蛋白酶解切割，如將細(xì)胞暴露于細(xì)胞外蛋白酶或生物分子的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶解切割。另外，分離的細(xì)胞群體可被進(jìn)一步分解成為亞群體，其本身是根據(jù)其他因素的分離的細(xì)胞群體，如細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的表達(dá)水平、核抗原、酶學(xué)活性、蛋白質(zhì)表達(dá)和定位、細(xì)胞周期分析、染色體分析、細(xì)胞容積和形態(tài)學(xué)特征如顆粒性以及細(xì)胞核大小或其他區(qū)別特征。例如，如果B細(xì)胞是一種預(yù)定義類別，則它們可根據(jù)諸如CD19、CD20或CD22這樣的細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)分。另外，分離的細(xì)胞群體可根據(jù)共有的特征而被匯總，所述共有特征可包含在一種或更多種另外的分離的細(xì)胞群體內(nèi)的內(nèi)含物或存在細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物、類似的基因表達(dá)特征、核抗原、酶學(xué)活性、蛋白質(zhì)表達(dá)和定位、細(xì)胞周期分析、染色體分析、細(xì)胞容積和形態(tài)學(xué)特征如顆粒性以及細(xì)胞核大小或其他區(qū)別特征。
分離的細(xì)胞亞群體的缺乏本身就是激活狀態(tài)數(shù)據(jù)，其可用于了解分離的細(xì)胞群體的病理生理。例如，當(dāng)需要測(cè)定分離的細(xì)胞群體總數(shù)中屬于某一特定亞細(xì)胞群體的百分比時(shí)，其是有用的。所述分離的細(xì)胞群體可根據(jù)來(lái)自于個(gè)體的經(jīng)驗(yàn)特征進(jìn)行辨識(shí)，所述經(jīng)驗(yàn)特征顯示了個(gè)體的狀態(tài)，如健康狀態(tài)。例如，來(lái)自臨床和/或來(lái)自臨床試驗(yàn)的血液樣品可被反向分析以辨識(shí)細(xì)胞分離的群體；特定群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)或所述細(xì)胞群體的定量特征可被關(guān)聯(lián)于所述患者的確定的已知結(jié)果。例如，可隨治療進(jìn)程從癌癥患者獲取血液樣品。可記錄多種不同的結(jié)果，從多年的病情完全好轉(zhuǎn)直至死于癌癥或治療后癌癥復(fù)發(fā)。在 使用或未使用調(diào)節(jié)劑的情況下，可從回溯性樣品中獲得多個(gè)分離的細(xì)胞群體中的可激活元件的狀態(tài)特征以測(cè)定所述樣品中存在的分離的細(xì)胞群體、各個(gè)分離的細(xì)胞群體中的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)、各個(gè)分離的細(xì)胞群體中的細(xì)胞數(shù)量、不同的分離的細(xì)胞群體和/或亞群體中的細(xì)胞相對(duì)數(shù)量或比例等等。這些分離的細(xì)胞群體與其對(duì)于多種健康狀態(tài)的預(yù)測(cè)值可一同被置于用于對(duì)其他樣品進(jìn)行分析的數(shù)據(jù)庫(kù)中。隨著獲得更多的樣品以及測(cè)定所關(guān)聯(lián)的健康狀態(tài)，所述數(shù)據(jù)庫(kù)可被調(diào)整。在一些實(shí)施方案中，所述不同的分離的細(xì)胞群體是造血細(xì)胞群體。造血細(xì)胞群體的實(shí)例包括但不限于，多潛能造血干細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞、NK細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞、粒細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞、單核細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞、巨核細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞以及紅細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞。因此，例如，在一些實(shí)施方案中，通過(guò)分析分離的B淋巴細(xì)胞衍生的細(xì)胞群體和分離的T淋巴細(xì)胞衍生的細(xì)胞群體中的可激活元件響應(yīng)于調(diào)節(jié)劑的激活水平而測(cè)定了個(gè)體的狀態(tài)，其中用于所述不同的分離的細(xì)胞群體的調(diào)節(jié)劑可以是相同的或不同的。在一些實(shí)施方案中，所述不同的分離的細(xì)胞群體是分離的細(xì)胞群體的亞群體。例如，在所述分離的細(xì)胞群體是造血細(xì)胞群體的一些實(shí)施方案中，通過(guò)分析分離的初始B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞群體和分離的記憶B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞群體中的可激活元件響應(yīng)于調(diào)節(jié)劑的激活水平而測(cè)定了個(gè)體的狀態(tài)，其中用于所述不同的分離的細(xì)胞群體的調(diào)節(jié)劑可以是相同的或不同的。在另一個(gè)實(shí)例中，在一些實(shí)施方案中，通過(guò)分析⑶4+T淋巴細(xì)胞群體和⑶8+T淋巴細(xì)胞衍生的群體中的可激活元件響應(yīng)于調(diào)節(jié)劑的激活水平而測(cè)定了個(gè)體的狀態(tài)，其中用于所述不同的分離的細(xì)胞群體的調(diào)節(jié)劑可以是相同的或不同的。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)創(chuàng)建響應(yīng)表單而測(cè)定個(gè)體狀態(tài)或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)，所述響應(yīng)表單通過(guò)對(duì)不同的分離的細(xì)胞群體中的響應(yīng)于一種或更多種調(diào)節(jié)劑的一種或更多種可激活元件進(jìn)行分析而創(chuàng)建。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將不同的分離的細(xì)胞群體各自接觸于至少一種調(diào)節(jié)劑并且對(duì)所述分離的細(xì)胞群體中的至少一種可激活元件的激活水平進(jìn)行測(cè)定而創(chuàng)建響應(yīng)表單。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將不同的分離的細(xì)胞群體分為多個(gè)樣品并將所述樣品接觸于至少一種調(diào)節(jié)劑并且對(duì)所述樣品中的至少一種可激活元件的激活水平進(jìn)行測(cè)定而創(chuàng)建響應(yīng)表單。在一些實(shí)施方案中，各個(gè)分離的細(xì)胞群體在分開的培養(yǎng)物中接觸不同的調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，各個(gè)分離的細(xì)胞群體在同一培養(yǎng)物或分開的培養(yǎng)物中接觸相同的調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，一些分離的細(xì)胞群體在同一或分開的培養(yǎng)物中接觸所述相同的調(diào)節(jié)劑，而其他細(xì)胞群體接觸不同的調(diào)節(jié)劑。例如，如果被分析的不同的分離的群體是初始⑶4T細(xì)胞、記憶⑶4T細(xì)胞、初始⑶8T細(xì)胞和記憶⑶8T細(xì)胞，初始⑶4和記憶CD4細(xì)胞可在同一培養(yǎng)物中接觸相同的第一調(diào)節(jié)劑，而初始CD8T細(xì)胞和記憶CD8T細(xì)胞可在分開的培養(yǎng)物中分別接觸第二種和第三種調(diào)節(jié)劑?？舍槍?duì)相同可激活元件或不同可激活元件對(duì)所述不同的分離的細(xì)胞群體進(jìn)行分析。所述分離的細(xì)胞群體可同時(shí)或依次進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，在各個(gè)分離的細(xì)胞群體中進(jìn)行分析的可激活元件是不同的。在一些實(shí)施方案中，在各個(gè)分離的細(xì)胞群體中進(jìn)行分析的可激活元件是相同的。在一些實(shí)施方案中，在所述分離的細(xì)胞群體中對(duì)多種可激活元件進(jìn)行了分析，其中在所述不同的分離的細(xì)胞群體中所述可激活元件可以是相同或不同的。在一些實(shí)施方案中，在各個(gè)細(xì)胞群體中進(jìn)行分析的可激活元件的數(shù)量是不同的。例如，在一些實(shí)施方案中，在一種細(xì)胞群體中僅僅對(duì)一種可激活元件進(jìn)行分析，而在其他細(xì)胞群體中對(duì)多種(如，兩種或更多種)可激活元件進(jìn)行分析。當(dāng)在分離的細(xì)胞 群體中分析多種可激活元件的時(shí)候，所述可激活元件可依次進(jìn)行分析或同時(shí)進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了用于生成不同的分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的方法，其通過(guò)在分開的培養(yǎng)物中將各個(gè)分離的細(xì)胞群體接觸多種調(diào)節(jié)劑(本文所詳述的)，對(duì)來(lái)自各個(gè)分開的培養(yǎng)物的分離的細(xì)胞群體中可激活元件的激活水平的提高存在與否進(jìn)行測(cè)定以及根據(jù)各個(gè)分開的培養(yǎng)物的分離的細(xì)胞群體中可激活元件的激活水平的提高存在與否對(duì)所述分離的細(xì)胞群體進(jìn)行分類來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，激活狀態(tài)數(shù)據(jù)被用于在每個(gè)所述細(xì)胞群體中對(duì)多個(gè)途徑進(jìn)行特征研究。所述不同細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可被用于測(cè)定個(gè)體狀態(tài)或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)。個(gè)體或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)可被用于選擇治療方法。治療方法包括但不限于，化療、生物療法、放療、骨髓移植、外周血干細(xì)胞移植、臍帶血移植、自體干細(xì)胞移植、異源干細(xì)胞移植、同源干細(xì)胞移植、手術(shù)、誘導(dǎo)治療、維持治療、觀察等待以及其他療法。除可激活元件的激活水平之外，生物分子如蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)水平可單獨(dú)使用或結(jié)合可激活元件的激活狀態(tài)進(jìn)行使用以測(cè)定個(gè)體或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)。另外，其他的細(xì)胞元件，如生物分子或分子復(fù)合物，如RNA、DNA、碳水化合物、代謝物等等，可結(jié)合可激活狀態(tài)或表達(dá)水平而被用于分析本文所包含的不同的分離的細(xì)胞群體。在一些實(shí)施方案中，也可在不同的分離的細(xì)胞群體中測(cè)量表達(dá)標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法中還可使用表達(dá)標(biāo)記物或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，如⑶34、⑶33、⑶45、HLADR、⑶IlB FLT3配體、c-KIT、ABCG2、MDRU BCRP, MRPU LRP和下文指出的其他分子。表達(dá)標(biāo)記物可使用多種不同工藝進(jìn)行檢測(cè)，例如使用來(lái)自流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)的節(jié)點(diǎn)。其他常用工藝使用了表達(dá)陣列(由 Affymetrix, Santa Clara CA 市售)、taqman (由 ABI,Foster City CA 市售)、SAGE (由Genzyme, Cambridge MA 市售)、測(cè)序工藝(參見來(lái)自 Helicos、454、US Genomics 以及 ABI的商業(yè)產(chǎn)品)和其他常見已知分析。參見Golub等人，Science 286 :531-537 (1999年)。在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)標(biāo)記物包括基于表位的標(biāo)記物、RNA> mRNA、siRNA或代謝標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法以實(shí)施多參量流式細(xì)胞儀技術(shù)用以在不同的分離的細(xì)胞群體中監(jiān)測(cè)磷酸蛋白對(duì)多種因素的響應(yīng)。在細(xì)胞中起始和調(diào)控增殖信號(hào)需要信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)中的磷酸蛋白成員以及與其相互作用的激酶和磷酸酶。流式細(xì)胞儀技術(shù)在臨床中是有用的，因?yàn)橄鄬?duì)較小的樣品大小，少至10，000個(gè)細(xì)胞，可產(chǎn)生數(shù)量可觀的統(tǒng)計(jì)上可追蹤的多維信號(hào)傳導(dǎo)數(shù)據(jù)。(參見美國(guó)專利第7，381，535號(hào)和第7，393，656號(hào)。亦可參見 Krutzik 等人，2004 年)。在對(duì)個(gè)體的諸如預(yù)后或疾病狀態(tài)這樣的特征進(jìn)行測(cè)定中可考慮其他要素?？墒褂脼楸疚乃龅牟煌姆蛛x的細(xì)胞群體的分析提供額外的預(yù)測(cè)或診斷能力的任意要素。這些要素在本領(lǐng)域是眾所周知的。這些要素包括個(gè)體的性別；種族；當(dāng)前年齡；疾病出現(xiàn)時(shí)的年齡；疾病的臨床階段；基因信息(genetic result)，先前治療數(shù)量；先前治療類型；對(duì)先前治療的響應(yīng)；距上次治療的時(shí)間；血細(xì)胞計(jì)數(shù)；骨髓儲(chǔ)量；以及機(jī)能狀態(tài)(performancestatus)、患者過(guò)去醫(yī)療史、家族病史、患者社交史以及術(shù)語(yǔ)為“系統(tǒng)回顧”的任何當(dāng)前有效醫(yī)療史，以及體檢的發(fā)現(xiàn)。其他的要素對(duì)被評(píng)估的具體病狀更具特異性，例如作為確定某種白血病的指征的骨髓中胚細(xì)胞(blast)百分比。對(duì)于特定疾病和病狀這些要素在本領(lǐng)域中是眾所周知的。可與本文所述的方法共同實(shí)施的測(cè)試的實(shí)例包括但不限于，免疫表型測(cè)定、形態(tài)學(xué)、傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)、分子細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和HLA分型。調(diào)節(jié)劑在一些實(shí)施方案中，所述方法和組合物使用了調(diào)節(jié)劑。調(diào)節(jié)劑可以是激活劑、治療化合物、抑制劑或能夠影響細(xì)胞途徑的化合物。調(diào)節(jié)劑還可以采取環(huán)境信號(hào)和輸入的形式。調(diào)節(jié)劑可以未經(jīng)特征分析或經(jīng)特征分析為已知化合物。調(diào)節(jié)劑可以是來(lái)自個(gè)體的生物標(biāo)本或者細(xì)胞或生理環(huán)境樣品，其可為未經(jīng)完整化學(xué)或生物特征分析的異源樣品。調(diào)節(jié)劑標(biāo)本的收集可直接在所述個(gè)體上直接進(jìn)行，或被間接獲取。一個(gè)示例性的實(shí)例是從所述個(gè)體取出細(xì)胞樣品并隨后對(duì)該樣品進(jìn)行培養(yǎng)以獲得調(diào)節(jié)劑。調(diào)節(jié)劑可存在于所述個(gè)體體內(nèi)，如所述個(gè)體體內(nèi)的生理環(huán)境的一種化學(xué)品。調(diào)控可在多種環(huán)境下實(shí)施。在一些實(shí)施方案中，在進(jìn)行收集之后，包含分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞被立即暴露于調(diào)節(jié)劑。在存在細(xì)胞混合群體的一些實(shí)施方案中，在進(jìn)行調(diào)控之后進(jìn)行了細(xì)胞的純化。在一些實(shí)施方案中，對(duì)添加了調(diào)節(jié)劑的全血進(jìn)行了收集。在一些實(shí)施方案中，在對(duì)單細(xì)胞或單細(xì)胞的純化組分進(jìn)行加工處理后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。作為一個(gè)示例性的實(shí)例，對(duì)全血進(jìn)行了收集并且針對(duì)淋巴細(xì)胞的富集組分進(jìn)行加工處理，該組分隨后被暴露于調(diào)節(jié)劑。調(diào)控還包括將細(xì)胞暴露于超過(guò)一種調(diào)節(jié)劑。例如，在一些實(shí)施方案中，包含分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞被暴露于至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10種調(diào)節(jié)劑。參見美國(guó)專利申請(qǐng)第61/048，657號(hào),其以引用的方式并入本文。在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞群體在其還在所述個(gè)體體內(nèi)的時(shí)候被暴露于調(diào)節(jié)劑。例如，所述個(gè)體被暴露于存在于生理環(huán)境中的化學(xué)品，并且因此分離的細(xì)胞群體被暴露于該化學(xué)品。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行收集后包含分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞在暴露于調(diào)節(jié)劑之前被培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中。在一些實(shí)施方案中所述培養(yǎng)基是生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基是復(fù)合培養(yǎng)基，其可包含血清。在一些實(shí)施方案中，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含血清。在一些實(shí)施方案中，所述血清選自胎牛血清、牛血清、人血清、豬血清、馬血清和山羊血清。在一些實(shí)施方案中，所述血清水平介于0. 0001%與30%之間。在一些實(shí)施方案中， 所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基是經(jīng)化學(xué)定義的培養(yǎng)基，其不含血清。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞被培養(yǎng)于分化培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)劑包括化學(xué)和生物學(xué)實(shí)體，以及物理或環(huán)境刺激物。調(diào)節(jié)劑可在細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)作用?；瘜W(xué)和生物學(xué)調(diào)節(jié)劑包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、離子、神經(jīng)遞質(zhì)、粘附分子、激素、小分子、無(wú)機(jī)化合物、多核苷酸、抗體、天然化合物、血凝素、內(nèi)酯、化療齊U、生物響應(yīng)調(diào)節(jié)物、碳水化合物、蛋白酶和自由基。調(diào)節(jié)劑包括復(fù)合物和未限定的生物組合物，其可包含細(xì)胞或植物提取物、細(xì)胞或腺體分泌物、生理液體如血清、羊水或毒液。物理或環(huán)境刺激物包括電磁、紫外、紅外、或微粒輻射、氧化還原電位以及pH、營(yíng)養(yǎng)物的存在與否、溫度變化、氧分壓變化、離子濃度變化和氧化應(yīng)激的使用。調(diào)節(jié)劑可以是內(nèi)源性或外源性的并且根據(jù)對(duì)所述單細(xì)胞的暴露濃度和持續(xù)時(shí)間或是否與其他調(diào)節(jié)劑結(jié)合使用或依次使用而可產(chǎn)生不同效果。調(diào)節(jié)劑可直接作用于所述可激活元件或通過(guò)與一種或更多種中介生物分子的相互作用而間接作用。間接調(diào)控包括基因表達(dá)的改造，其中該被表達(dá)的基因產(chǎn)物是可激活元件或是所述可激活元件的調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施方案中所述調(diào)節(jié)劑選自生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、粘附分子、藥物、激素、小分子、多核苷酸、抗體、天然化合物、內(nèi)酯、化療劑、免疫調(diào)節(jié)劑、碳水化合物、蛋白酶、離子、活性氧物質(zhì)、肽和蛋白質(zhì)片段，其可單獨(dú)存在或存在于細(xì)胞內(nèi)容物、細(xì)胞自身、病毒以及生物和非生物復(fù)合物中(如，珠粒、平板、病毒包膜、抗原呈遞分子如主要組織相容性復(fù)合物)。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)劑是物理刺激物如熱、冷、UV照射和輻射。調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括但不限于，SDF-I a、IFN- a、IFN- y、IL-10、IL-6、IL-27、G-CSF, FLT-3L、IGF-UM-CSF、SCF、PMA、毒胡蘿卜內(nèi)酯、H2O2、依托泊苷、AraC、柔紅霉素、十字孢堿、芐氧羰基-纈氨酰-丙氨酰-天冬氨酰氟甲基酮(ZVAD)、來(lái)那度胺、EP0、阿扎胞苷、地西他濱、IL-3、IL-4、GM-CSF、EPO、LPS、TNF- a 以及 CD40L。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)劑是激活劑。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)劑是抑制齊U。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞被暴露于一種或更多種調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，包含分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞被暴露于至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10種調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，包含分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞被暴露于至少兩種調(diào)節(jié)劑，其中一種調(diào)節(jié)劑是激活劑并且一種調(diào)節(jié)劑是抑制劑。在一些實(shí)施方案中，包含分離的細(xì)胞群體的細(xì)胞被暴露于至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10種調(diào)節(jié)劑，其中至少一種所述調(diào)節(jié)劑是抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述不同的分離的細(xì)胞群體被暴露于相同調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，所述不同的分離的細(xì)胞群體被暴露于不同調(diào)節(jié)劑。例如，在一些實(shí)施方案中，所述不同細(xì)胞群體被暴露于一種或更多種調(diào)節(jié)劑，其中該不同的分離的細(xì)胞群體間的一種或更多種調(diào)節(jié)劑是相同的。在其他的實(shí)施方案中，所述不同細(xì)胞群體被暴露于一種或更多種調(diào)節(jié)劑，其中該不同的分離的細(xì)胞群體間的一種或更多種調(diào)節(jié)劑是不同的。在一些實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑是分子結(jié)合實(shí)體。在一些實(shí)施方案中，所述分子結(jié)合實(shí)體是單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)，其通過(guò)連接于固體表面或固定于納米顆粒表面以增加該表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的局部?jī)r(jià)態(tài)從而被制備成更高價(jià)。在一些實(shí)施方案中，所述抑制劑是一種細(xì)胞因子或多種細(xì)胞因子的抑制劑，其在該細(xì)胞中參與細(xì)胞途徑(如，信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián))。在一些實(shí)施方案中，所述抑制劑是磷酸酶抑制劑。磷酸酶抑制劑的實(shí)例包括但不限于H202、siRNA、miRNA、斑蝥素、(-)-p-對(duì)溴四咪唑、微囊藻毒素LR、正釩酸鈉、過(guò)礬酸鈉、硫酸氧釩、二環(huán)過(guò)氧化(1，10-菲羅啉)釩酸鈉、雙(麥芽醇)氧f凡(IV)、鑰酸鈉、Sodium Perm olybdate、酒石酸鈉、咪唑、氟化鈉、P _甘油磷酸、十水合焦磷酸鈉、花萼海綿體誘癌素A、Discodermia calyx、bpV (phen)、mpV (pic)、DMHV、氯氛菊酷、Depho s tat in、網(wǎng)田酸、NIPP-1、N- (9，10- _■氧-9，10- _■氧-菲 ~2~ 基)-2，2- _■甲基-丙酸酯、a -溴-4-羥基苯乙酮、4-羥基苯乙酰溴、a -溴_4_甲氧基苯乙酮、4_甲氧基苯乙酰溴、a-溴-4-(羧甲氧基)苯乙酮、4_(羧甲氧基)苯乙酰溴以及雙(4-三氟甲基磺酰胺基苯基)-1，4_ 二異丙苯、氧化苯胂、二硫代氨基甲酸吡咯烷和氟化鋁。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸酶抑制劑是H2O2。在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞 群體中的可激活元件的激活水平通過(guò)將所述分離的細(xì)胞群體接觸至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10種調(diào)節(jié)劑而進(jìn)行測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞群體中的可激活元件的激活水平通過(guò)將所述分離的細(xì)胞群體接觸至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10種調(diào)節(jié)劑而進(jìn)行測(cè)定，其中至少一種調(diào)節(jié)劑是抑制劑。在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞群體中的可激活元件的激活水平通過(guò)將所述分離的細(xì)胞群體接觸抑制劑和調(diào)節(jié)劑而進(jìn)行測(cè)定，其中所述調(diào)節(jié)劑可以是抑制劑或激活劑。在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞群體中的可激活元件的激活水平通過(guò)將所述分離的細(xì)胞群體接觸抑制劑和激活劑而進(jìn)行測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞群體中的可激活元件的激活水平通過(guò)將所述分離的細(xì)胞群體接觸兩種或更多種調(diào)節(jié)劑而進(jìn)行測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，在不同的分離的細(xì)胞群體中測(cè)定了相同可激活元件的激活水平。在一些實(shí)施方案中，在不同的分離的細(xì)胞群體中測(cè)定了不同的可激活元件的激活水平。例如，在一些實(shí)施方案中，當(dāng)不同的分離的細(xì)胞群體被暴露于一種或更多種調(diào)節(jié)劑的時(shí)候在所述不同的分離的細(xì)胞群體中測(cè)定了相同可激活元件的激活水平，其中所述不同的分離的細(xì)胞群體之間的所述一種或更多種調(diào)節(jié)劑是相同的。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)不同的分離的細(xì)胞群體被暴露于一種或更多種調(diào)節(jié)劑的時(shí)候在所述不同的分離的細(xì)胞群體中測(cè)定了相同可激活元件的激活水平，其中所述不同的分離的細(xì)胞群體之間的所述一種或更多種調(diào)節(jié)劑是不同的。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)不同的分離的細(xì)胞群體被暴露于一種或更多種調(diào)節(jié)劑的時(shí)候在所述不同的分離的細(xì)胞群體中測(cè)定了不同可激活元件的激活水平，其中所述不同的分離的細(xì)胞群體之間的所述一種或更多種調(diào)節(jié)劑是相同的。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)不同的分離的細(xì)胞群體被暴露于一種或更多種調(diào)節(jié)劑的時(shí)候在所述不同的分離的細(xì)胞群體中測(cè)定了不同可激活元件的激活水平，其中所述不同的分離的細(xì)胞群體之間的所述一種或更多種調(diào)節(jié)劑是不同的。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)細(xì)胞群體被暴露于一種或更多種調(diào)節(jié)劑的時(shí)候通過(guò)測(cè)量可激活元件的激活水平而測(cè)定了分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)。細(xì)胞群體可被分成多個(gè)樣品，并且在所述樣品被暴露于一種或更多種調(diào)節(jié)劑之后通過(guò)測(cè)量該樣品中的至少一種可激活元件測(cè)激活水平而測(cè)定所述分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)各個(gè)細(xì)胞群體被暴露于調(diào)節(jié)劑的時(shí)候。通過(guò)在各個(gè)細(xì)胞群體中測(cè)量可激活元件的激活水平而測(cè)定了所述不同的分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)。所述不同細(xì)胞群體可被暴露于相同或不同的調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)劑包括H2O2、PMA, SDFl a、CD40L、IGF-U IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡蘿卜內(nèi)酯和/或其組合。例如，細(xì)胞群體可被暴露于下列調(diào)節(jié)劑組合的一種或更多種、全部或組合H202、PMA、SDF1 a、CD40L、IGF-1、IL-7、IL_6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL_3、毒胡蘿卜內(nèi)酯。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本文所述不同的分離的細(xì)胞群體的生理狀態(tài)被用于測(cè)定個(gè)體狀態(tài)?？杉せ钤景l(fā)明的方法和組合物可被用于對(duì)細(xì)胞途徑中的任意可激活元件的狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)和特征化。單個(gè)或多個(gè)不同的途徑可被特征化(依次地或同時(shí)地)，或者單個(gè)途徑中或覆蓋多個(gè)途徑的可激活元件的亞組可被檢測(cè)(亦為依次地或同時(shí)地)。單個(gè)可激活元件的激活狀態(tài)是處于或開啟開或關(guān)閉的狀態(tài)。作為示例性的實(shí)例，并且不期望受任何理論的限制，蛋白質(zhì)中單可憐酸化位點(diǎn)應(yīng)或者被磷酸化而處干“開啟”狀態(tài)，或者不被磷酸化而因此處于“關(guān)閉”狀態(tài)。參見Blume-Jensen和Hunter, Nature,第411卷，2001年5月17日，355-365頁(yè)。當(dāng)用于屬于細(xì)胞組成的一部分的可激活元件之時(shí)，術(shù)語(yǔ)“開啟”和“關(guān)閉”在此被用于描述所述可激活元件的狀態(tài)(如，被磷酸化是“開啟”并且非磷酸化是“關(guān)閉”)，并非其所屬于的細(xì)胞組成的整體狀態(tài)。一般地，細(xì)胞具有含特定可激活元件的多種特定蛋白質(zhì)或其他組成，并且該多種蛋白質(zhì)或組成通常具有個(gè)體可激活元件處于開啟狀態(tài)的某些蛋白質(zhì)或組成，以及個(gè)體可激活元件處于關(guān)閉狀態(tài)的其他蛋白質(zhì)或組成。由于各個(gè)可激 活元件的激活狀態(tài)一般通過(guò)使用識(shí)別特定激活狀態(tài)的結(jié)合元件進(jìn)行測(cè)量，僅僅被所述結(jié)合元件所識(shí)別的處于該特定激活狀態(tài)的可激活元件將被所述結(jié)合元件所結(jié)合以產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)，所述被識(shí)別的可激活元件代表了可激活元件總數(shù)的某一部分。對(duì)應(yīng)于單細(xì)胞中被激活的特定類型個(gè)體可激活元件總數(shù)的可測(cè)量信號(hào)是該細(xì)胞中的該可激活元件的“激活水平”。特定可激活元件的激活水平可在個(gè)體細(xì)胞中有所變化，從而使在對(duì)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析時(shí)所述激活水平遵循某種分布。所述分布可以是正態(tài)分布，亦稱高斯分布，或其可以是另ー類型的分布。不同的細(xì)胞群體可具有不同的激活水平分布，該分布可在區(qū)分所述群體中發(fā)揮作用。在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞中測(cè)定一種或更多種可激活元件的激活水平的基礎(chǔ)可以利用在不同表型中有所不同的ー種或更多種特定可激活元件的激活水平的分布。見于細(xì)胞或細(xì)胞群體的一種或更多種可激活元件的確定的激活水平，或者更為典型的情況下為激活水平的范圍，是該細(xì)胞或細(xì)胞群體屬于某一獨(dú)特表型的指征。除可激活元件的激活水平之外，其他的測(cè)量方法，諸如不包含可激活元件的生物分子的細(xì)胞水平(如表達(dá)水平)，也可被用于測(cè)定細(xì)胞的激活水平數(shù)據(jù)，應(yīng)當(dāng)了解這些水平也遵循某種分布，類似于可激活元件。因此，分離的細(xì)胞群體中的一種或更多種細(xì)胞的一種或更多種可激活元件的激活水平或水平，可選地結(jié)合不包含可激活元件的生物分子的ー種或更多種水平，可被用于測(cè)定所述分離的細(xì)胞群體的激活水平數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)可利用細(xì)胞在等高線或密度圖中的位置。所述等高線或密度圖代表了共有某些特征的細(xì)胞數(shù)量，所述特征的例子如可激活蛋白質(zhì)響應(yīng)于調(diào)節(jié)劑的激活水平。例如，當(dāng)涉及可激活元件響應(yīng)于ー種或更多種調(diào)節(jié)劑的激活水平的時(shí)候，正常個(gè)體和患有病狀的患者可顯示出具有響應(yīng)于所述ー種或更多種調(diào)節(jié)劑的升高激活水平的群體。然而，具有特定激活水平(如，特定量的可激活元件)的細(xì)胞的數(shù)量在正常個(gè)體與患有病狀的個(gè)體間可能是不同的。因此，細(xì)胞的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)可根據(jù)其在所述等高線或密度圖的給定區(qū)域中的位置而進(jìn)行測(cè)定。除可激活元件的激活水平之外，生物分子如蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)水平可単獨(dú)使用或結(jié)合可激活元件的激活狀態(tài)進(jìn)行使用以測(cè)定細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。另外，其他的細(xì)胞元件，如生物分子或分子復(fù)合物，如RNA、DNA、碳水化合物、代謝物等等，可結(jié)合可激活狀態(tài)或表達(dá)水平或激活狀態(tài)和表達(dá)水平的任意組合而被用于測(cè)定本文所包含的細(xì)胞群體的生理狀態(tài)。
在一些實(shí) 施方案中，影響細(xì)胞組成的狀態(tài)的其他特征可被用于測(cè)定分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。實(shí)例包括生物分子的轉(zhuǎn)位或其周轉(zhuǎn)數(shù)的變化以及生物分子復(fù)合物的形成和解離。這樣的復(fù)合物可包括，多蛋白質(zhì)復(fù)合物、多脂質(zhì)復(fù)合物、同ニ聚物或異ニ聚物或寡聚物，及其組合。其他的特征包括蛋白酶解切割，如將細(xì)胞暴露于細(xì)胞外蛋白酶或生物分子的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶解切割。另外的元件也可被用于測(cè)定分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)，例如，細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的表達(dá)水平、核抗原、酶學(xué)活性、蛋白質(zhì)表達(dá)和定位、細(xì)胞周期分析、染色體分析、細(xì)胞容積和形態(tài)學(xué)特征如顆粒性以及細(xì)胞核大小或其他區(qū)別特征。例如，可根據(jù)諸如⑶14、⑶15或⑶33、⑶34以及⑶45細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)對(duì)髓系細(xì)胞進(jìn)ー步細(xì)分。另外，細(xì)胞群體可根據(jù)相同的特征而被匯總，所述相同特征可包含在一種或更多種另外的細(xì)胞群體內(nèi)的內(nèi)含物或存在細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物、類似的基因表達(dá)特征、核抗原、酶學(xué)活性、蛋白質(zhì)表達(dá)和定位、細(xì)胞周期分析、染色體分析、細(xì)胞容積和形態(tài)學(xué)特征如顆粒性以及細(xì)胞核大小或其他區(qū)別特征。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)細(xì)胞途徑中的一種或更多種可激活元件的激活水平進(jìn)行檢測(cè)和特征化而測(cè)定一種或更多種細(xì)胞的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，來(lái)自分離的第一細(xì)胞群體的細(xì)胞的一種或更多種可激活元件的激活水平與來(lái)自分離的第二細(xì)胞群體的細(xì)胞的一種或更多種可激活元件的激活水平與病狀相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，所述第一種分離的細(xì)胞群體和第二種分離的細(xì)胞群體是造血細(xì)胞群體。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本文所述來(lái)自分離的第一造血細(xì)胞細(xì)胞群體的細(xì)胞的一種或更多種可激活元件的激活水平與來(lái)自分離的第二造血細(xì)胞細(xì)胞群體的細(xì)胞的一種或更多種可激活元件的激活水平與成瘤的、自體免疫的或造血機(jī)能的病狀相關(guān)聯(lián)。不同的分離的造血細(xì)胞群體的實(shí)例包括但不限于，多潛能造血干細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞、NK細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞、粒細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞、單核細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞、巨核細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞以及紅細(xì)胞系祖細(xì)胞或衍生細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定了該樣品中的單細(xì)胞內(nèi)的一種或更多種可激活元件的激活水平?？赡馨杉せ钤募?xì)胞組成包括但不限于蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、核酸和代謝物。所述可激活元件可能是所述細(xì)胞組成的一部分，例如蛋白質(zhì)中的可經(jīng)過(guò)磷酸化的氨基酸殘基，或者其可能是所述細(xì)胞組成自身，例如通過(guò)轉(zhuǎn)位、構(gòu)象變化(由于，如PH或離子濃度變化)、蛋白酶解切割等被激活的蛋白質(zhì)。被激活后，所述激活元件發(fā)生了變化，例如可激活元件的共價(jià)修飾(如分子或基團(tuán)對(duì)該可激活元件的結(jié)合，例如磷酸化)或構(gòu)象變化。這樣的變化一般歸因于包含所述可激活元件的細(xì)胞組成的特定生物、生化或物理特性的變化。包含所述可激活元件的細(xì)胞組成的狀態(tài)通過(guò)該細(xì)胞組成的特定可激活元件的狀態(tài)而在一定程度上被測(cè)定，盡管不一定被完全地測(cè)定。例如，蛋白質(zhì)可具有多個(gè)可激活元件，并且這些元件的特定激活狀態(tài)可總體地決定該蛋白質(zhì)的激活狀態(tài)；單一可激活元件的狀態(tài)不一定是決定性的。另外的因素也可影響所述細(xì)胞組成的狀態(tài)，如其他蛋白質(zhì)的結(jié)合、pH、離子濃度、與其他細(xì)胞組成的相互作用等。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定了單細(xì)胞中的多元細(xì)胞內(nèi)可激活元件的激活水平。本文使用的術(shù)語(yǔ)“多元”指的是兩種或更多種。在一些實(shí)施方案中，至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10種細(xì)胞內(nèi)可激活元件被測(cè)定。
可激活元件的激活狀態(tài)可由生物分子的化學(xué)加成或修飾而造成并導(dǎo)致，且包括生化加工過(guò)程，諸如糖基化、磷酸化、こ?；?、甲基化、生物素化、谷氨酰化、甘氨?；⒘u基化、異構(gòu)化、異戊烯化、豆蘧?；?、脂化、磷酸泛酰巰基こ胺基化、硫酸化、ISG化、亞硝基化、棕櫚?；?、SUMO化、泛素化、類泛素化、瓜氨酸化、酰胺化以及ニ硫鍵形成、ニ硫鍵還原。生物分子的其他可能的化學(xué)加成或修飾包括蛋白質(zhì)羰基的形成，蛋白質(zhì)側(cè)鏈的直接修飾如O-酪氨酸、氯代、硝基酪氨酸以及ニ酪氨酸，以及通過(guò)與碳水化合物和脂質(zhì)衍生物之間的反應(yīng)而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)加成物。其他修飾可以是非共價(jià)的，例如配體的結(jié)合或變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的結(jié)合。 在一些實(shí)施方案中，所述可激活元件是蛋白質(zhì)?？砂杉せ钤牡鞍踪|(zhì)的實(shí)例包括但不限于，激酶、磷酸酶、脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)分子、接頭/骨架蛋白、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)物、泛素化酶、粘附分子、細(xì)胞骨架/收縮蛋白、G蛋白異三聚體、小分子量GTP酶、鳥嘌呤核苷酸交換因子、GTP酶激活蛋白、胱天蛋白酶、參與凋亡的蛋白質(zhì)、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、分子伴侶、代謝酶、膜泡運(yùn)輸?shù)鞍?、羥化酶、異構(gòu)酶、去こ酰酶、甲基化酶、去甲基化酶、腫瘤抑制子基因、蛋白酶、離子通道、分子轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)錄因子/DNA結(jié)合因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控劑以及翻譯調(diào)控劑?？杉せ钤?、激活狀態(tài)和測(cè)定可激活元件的激活水平的方法的實(shí)例在題為“Methods and compositions for detecting the activation state of multipleproteins in single cells” 的美國(guó)公開號(hào)第 20060073474 號(hào)以及題為 “Methods andcompositions for risk stratification” 的美國(guó)公開號(hào)第 20050112700 號(hào)中有所描述，其內(nèi)容以引用的方式并入本文。同樣參見U.S. S.第61/048，886號(hào)、第61/048，920號(hào)以及Shulz 等人，Current Protocols in Immunology 2007 年，7 :8.17 1-20 頁(yè)。在一些實(shí)施方案中，可被激活的蛋白質(zhì)選自，HER受體、PDGF受體、FLT3受體、Kit受體、FGF受體、Eph受體、Trk受體、IGF受體、胰島素受體、Met受體、Ret、VEGF受體、促紅細(xì)胞生成素受體、血小板生成素受體、CD114、CD116、TIE1、TIE2、FAK、JakU Jak2、Jak3、Tyk2> Src> Lyn、Fyn、Lck、Fgr、Yes、Csk、Abl、Btk、ZAP70、Syk、IRAK、cRaf > ARaf、BRAF>Mos、Lim 激酶、ILK、TpI、ALK、TGF ^ 受體、BMP 受體、MEKK、ASK、MLK、DLK、PAK、Mek I、Mek2、MKK3/6、MKK4/7、ASK I、Co t、NIK、Bub、My t I、Wee I、酪蛋白激酶、PDKI、SGKI、SGK2、SGK3、AktU Akt2、Akt3、p90Rsk、p70S6 激酶、Prks, PKC, PKA, ROCK I、ROCK 2、極光激酶、CaMK,MNK、AMPK、MELK、MARK、Chkl、Chk2、LKB-1、MAPKAPK、Piml、Pim2、Pim3、IKK、Cdk、Jnk、Erk、IKK、GSK3a、GSK3P、Cdk、CLK、PKR、PI3-激酶 I 型、2 型、3 型、mTor、SAPK/JNK1，2，3、p38、PKR、DNA-PK, ATM、ATR、受體蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)、LAR磷酸酶、CD45、非受體蛋白酪氨酸磷酸酶(NPRTP)、SHP、MAP激酶磷酸酶(MKP)、雙特異性磷酸酶(DUSP)、CDC25磷酸酶、低分子量酪氨酸磷酸酶、眼缺陷蛋白(EYA)酪氨酸磷酸酶、Slingshot磷酸酶(SSH)、絲氨酸磷酸酶、PP2A、PP2B、PP2C、PP1、PP5、肌磷酸酶、PTEN、SHIP、肌管素、磷酸肌醇激酶、磷脂酶、前列腺素合成酶、5-脂氧合酶、鞘氨醇激酶、鞘磷脂酶、接頭/骨架蛋白、Shc、Grb2、BLNK、LAT、PI3-激酶 B 細(xì)胞接頭蛋白(BCAP)、SLAP、Dok、KSR、MyD88、Crk, CrkL, GAD、Nek、Grb2 相關(guān)結(jié)合蛋白(GAB)、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)、TRADD、TRAF2、RIP、T細(xì)胞白血病、IL-2、IL-4、IL-8、IL-6、干擾素Y、干擾素a、細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白(SOC)、Cbl、SCF泛素連接酶復(fù)合物、APC/C、粘附分子、整合素、免疫球蛋白樣粘附分子、選擇素、鈣黏素、聯(lián)蛋白、局部粘著斑激酶、pl30CAS、胞襯蛋白、肌動(dòng)蛋白、粧蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白結(jié)合蛋白、微管蛋白、eg5/KSP、CENP、^ -腎上腺能受體、毒蕈堿性受體、腺苷酸環(huán)化酶受體、小分子量GTP酶、H-Ras、K-Ras、N-Ras、Ran、Rac、Rho、Cdc42、Arf、RAB、RHEB、Vav、Tiam、Sos、Dbl、PRK、TSCl，2、Ras-GAP、Arf-GAP、Rho_GAP、胱天蛋白酶 、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶 7、胱天蛋白酶 8、胱天蛋白酶 9、Bcl-2、Mcl-l、Bcl-XL、Bcli、Bcl-B、Al、Bax、Bak、Bok、Bik、Bad、Bid、Bim、Bmf、Hrk> Noxa、Puma、IAP> XIAP、Smac、Cdk4、Cdk 6、Cdk 2、Cdkl、Cdk7、細(xì)胞周期蛋白D、細(xì)胞周期蛋白E、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B、Rb、pl6、pl4Arf、P27KIP、p21CIP、分子伴侶、Hsp90、Hsp70、Hsp27、代謝酶類、こ酰輔酶A羧化酶、ATP-檸檬酸裂解酶、一氧化氮合成酶、細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白、內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)裝置(ESCRT)蛋白、膜泡蛋白分選蛋白(Vsps)、羥化酶、脯氨酸羥化酶PHD-1、2和3、天冬氨酸羥化酶FIH轉(zhuǎn)移酶、Pinl脯氨酸異構(gòu)酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、去こ酰酶、組蛋白去こ酰酶、sirtuins、組蛋白こ?；浮BP/P300家族、MYST家族、ATF2、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白H3K4去甲基酶、H3K27、JHDM2A、UTX、VHL、WT-1、p53、Hdm, PTEN、泛素蛋白酶、尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)與uPA受體(uPAR)系統(tǒng)、組織蛋白酶、金屬蛋白酶、酯酶、水解酶、分離酶、鉀通道、鈉通道、多藥抗性蛋白、？-糖蛋白、核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體、￡七8、已讓、5獻(xiàn)0、1^1-八&65-即1 )、CREB、NFAT、ATF-2、AFT、Myc、Fos、Spl、Egr-I、T-bet、3 -聯(lián)蛋白、HIF、FOXO, E2F、SRF、TCF、Egr-U 3 -聯(lián)蛋白、FOXOSTATUSTAT 3,STAT 4,STAT 5、STAT6、p53、WT-l、HMGA、pS6、4EPB_l、eIF4E-結(jié)合蛋白、RNA聚合酶、起始因子、延伸因子。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本文所述的方法被用于測(cè)定可激活元件的激活水平，例如，在細(xì)胞途徑中的可激活元件。提供了方法和組合物以用于根據(jù)細(xì)胞途徑中的可激活元件的激活水平來(lái)測(cè)定細(xì)胞的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。提供了方法和組合物以用于根據(jù)各個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞途徑的可激活元件的激活水平來(lái)測(cè)定第一種分離的細(xì)胞群體中和第二種分離的細(xì)胞群體中的細(xì)胞的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。所述細(xì)胞可為造血細(xì)胞并且實(shí)例見于本文。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)可激活元件的激活水平，如細(xì)胞途徑中的可激活元件，而對(duì)不同的分離的細(xì)胞群體中的細(xì)胞的激活數(shù)據(jù)進(jìn)行的測(cè)定包括將所述細(xì)胞中的至少ー種歸類為關(guān)聯(lián)于臨床結(jié)果的細(xì)胞。臨床結(jié)果、階段以及患者響應(yīng)的實(shí)例也見于本文。(a)信號(hào)傳導(dǎo)途徑在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用于測(cè)定信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的可激活元件的激活水平。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本文所述，根據(jù)ー種或更多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的ー種或更多種可激活元件的激活水平測(cè)定細(xì)胞的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。信號(hào)傳導(dǎo)途徑及其成員已被廣泛地描述。參見(Hunter T. Cell 2000 年 I 月 7 日；100(1) :13-27 頁(yè)；Weinberg，2007 年；以及上文引用的 Blume-Jensen 和 Hunter, Nature,第 411 卷，2001 年 5 月 17 日，355-365頁(yè))。示例性的信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括下列途徑及其成員包括JAK、STAT2、3、4和5在內(nèi)的JAK-STAT途徑，F(xiàn)LT3L信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括Ras、Raf、MEK、ERK和elk在內(nèi)的MAP激酶途徑，包括PI-3-激酶、PDKl、Akt和Bad在內(nèi)的PI3K/Akt途徑，包括IKK、IkB和NF- k B在內(nèi)的NF- K B途徑以及包括卷曲受體、^ -聯(lián)蛋白、APC和其他輔因子與TCF在內(nèi)的Wnt途徑(參見 Cell Signaling Technology, Inc. 2002 年產(chǎn)品目錄第 231-279 頁(yè)和此前 Hunter T.的引用)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，被分析的相關(guān)聯(lián)可激活元件(或被檢測(cè)的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì))是MAP激酶、Akt, NFkB, WNT、STAT和/或PKC信號(hào)傳導(dǎo)途徑的成員。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用于測(cè)定包括上述在內(nèi)的本領(lǐng)域已知的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的激活水平。本發(fā)明范圍內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的類型的實(shí)例包括但不限于激酶、激酶底物(即磷酸化底物)、磷酸酶、磷酸酶底物、結(jié)合蛋白(如14-3-3)、受體配體和受體(細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶和核受體)。例如，激酶和蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域已被詳盡描述(例見 Cell Signaling Technology, Inc. , 2002 年目錄 “The Human ProteinKinases”和“Protein Interaction Domains”第 254-279 頁(yè))。示例性的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)包括但不限于激酶，HER受體、PDGF受體、Kit受體、FGF受體、Eph受體、Trk受體、IGF受體、胰島素受體、Met受體、Ret、VEGF受體、!'^1、1'1￡2、？八1(、Jakl、Jak2、Jak3、Tyk2、Src、Lyn、Fyn、Lck、Fgr、Yes、Csk、AbI、Btk、ZAP70、Syk、IRAK> cRaf>ARaf、BRAF、Mos、Lim 激酶、ILK、Tpl、ALK、TGF ^ 受體、BMP 受體、MEKK、ASK、MLK、DLK、PAK、Mek UMek 2、MKK3/6、MKK4/7、ASK1、Cot、NIK、Bub、Myt I、Weel、酪蛋白激酶、PDK1、SGK1、SGK2、SGK3、Akt I、Akt2、Akt3、p90Rsk、p70S6 激酶、Prks、PKC, PKA、ROCK I、ROCK 2、極光激酶、CaMK、MNK、AMPK、MELK、MARK、Chkl、Chk2、LKB-U MAPKAPK, Piml、Pim2、Pim3、IKK、Cdk、Jnk、Erk、IKK、GSK3a、GSK3P、Cdk、CLK、PKR、PI3-激酶 I 型、2 型、3 型、mTor、SAPK/JNKl，2，3、p38、PKR、DNA-PK、ATM、ATR、磷酸酶、受體蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)、LAR磷酸酶、CD45、非受體蛋白酪氨酸磷酸酶(NPRTP)、SHP、MAP激酶磷酸酶(MKP)、雙特異性磷酸酶(DUSP)、 CDC25磷酸酶、低分子量酪氨酸磷酸酶、眼缺陷蛋白(EYA)酪氨酸磷酸酶、Slingshot磷酸酶(SSH)、絲氨酸磷酸酶、PP2A、PP2B、PP2C、PPU PP5、肌磷酸酶、PTEN、SHIP、肌管素，脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)，磷酸肌醇激酶、磷脂酶、前列腺素合成酶、5_脂氧合酶、鞘氨醇激酶、鞘磷脂酶、接頭 / 骨架蛋白、She、Grb2、BLNK, LAT, PI3-激酶 B 細(xì)胞接頭蛋白(BCAP)、SLAP、Dok、KSR、MyD88、Crk, CrkL, GAD、Nek、Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白(GAB)、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)、TRADD, TRAF2、RIP、T細(xì)胞白血病家族、細(xì)胞因子，IL_2、IL_4、IL_8、IL-6、干擾素ベ、干擾素a，細(xì)胞因子調(diào)控物、細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白(S0C)、泛素化酶、Cbl、SCF泛素連接酶復(fù)合物、APC/C、粘附分子、整合素、免疫球蛋白樣粘附分子、選擇素、鈣黏素、聯(lián)蛋白、局部粘著斑激酶、p130CAS，細(xì)胞骨架/收縮蛋白、胞襯蛋白、肌動(dòng)蛋白、樁蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白結(jié)合蛋白、微管蛋白、eg5/KSP、CENP, G蛋白異三聚體、P _腎上腺能受體、毒蕈堿性受體、腺苷酸環(huán)化酶受體、小分子量 GTP 酶、H-Ras, K-Ras, N-Ras, Ran、Rac、Rho、Cdc42、Arf、RAB,RHEB、鳥嘌呤核苷酸交換因子、Vav、Tiam、Sos、Dbl、PRK、TSCl，2、GTP 酶激活蛋白、Ras-GAP、Arf-GAP、Rho-GAP、胱天蛋白酶、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、凋亡參與蛋白、8(31-2、1(1-1、8(31-父し8(311、8(31-8、六1、8&叉、Bak> Bok、Bik、Bad、Bid、Bim、Bmf、Hrk> Noxa、Puma、IAP> XIAP、Smac、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋劑、Cdk4、Cdk 6、Cdk 2、CdkU Cdk 7、細(xì)胞周期蛋白D、細(xì)胞周期蛋白E、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白 B、Rb、pl6、pl4Arf、p27KIP、p21CIP、分子伴侶、Hsp90、Hsp70、Hsp27、代謝酶類、こ酰輔酶A羧化酶、ATP-檸檬酸裂解酶、一氧化氮合成酶、膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白、內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)裝置(ESCRT)蛋白、膜泡蛋白分選蛋白(Vsps)、羥化酶、脯氨酸羥化酶PHD-1、2和3、天冬氨酸羥化酶FIH轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶、Pinl脯氨酸異構(gòu)酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、去こ酰酶、組蛋白去こ酰酶、sirtuins、こ酰酶、組蛋白こ?；?、CBP/P300家族、MYST家族、ATF2、甲基化酶、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶、組蛋白H3K4去甲基酶、H3K27、JHDM2A、UTX、腫瘤抑制蛋白基因、VHL, WT-I、p53、Hdm, PTEN、蛋白酶、泛素蛋白酶、尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)與uPA受體(uPAR)系統(tǒng)、組織蛋白酶、金屬蛋白酶、酯酶、水解酶、分離酶、離子通道、鉀通道、鈉通道、分子轉(zhuǎn)運(yùn)體、多藥抗性蛋白、P-糖蛋白、核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)錄因子/DNA結(jié)合蛋白、EtS、Elk、SMAD、Rel-A(p65_NFKB)、CREB、NFAT、ATF-2、AFT、Myc、Fos、Spl、Egr-1、T-bet、P -聯(lián)蛋白、HIF、F0X0、E2F、SRF、TCF、Egr-l、3 -聯(lián)蛋白、FOXO STATl、STAT 3、STAT
4、STAT 5、STAT 6、p53、WT-I、HMGA、翻譯調(diào)控劑、pS6、4EPB_l、eIF4E_ 結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、RNA聚合酶、起始因子以及延伸因子。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白選自PI3-激酶(p85、pllOa、pllOb、pllOd)、Jakl、Jak2、SOC, Rac、Rho、Cdc42、Ras-GAP, Vav、Tiam、Sos、Dbl、Nek、Gab、PRK、SHPl 和 SHP2、SHIPl、SHIP2、sSHIP、PTE N、She、Grb2、PDKl、SGK、Aktl、Akt2、Akt3、TSCl，2、Rheb, mTor、4EBP-1、p70S6 激酶、S6、LKB-U AMPK, PFK,こ酰輔酶 A 羧化酶、DokS、Rafs, Mos, Tpl2、MEK1/2、MLK3、TAK, DLK, MKK3/6、MEKK1，4、MLK3、ASKU MKK4/7、SAPK/JNKI, 2, 3, p38s、Erkl/2、Syk、Btk、BLNK、LAT、ZAP70、Lck、Cbl、SLP-76、PLCyi、PLCy 2、STATl、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、FAK、p130CAS、PAKs、UMK1/2、Hsp90、Hsp70、Hsp27、SMADs、Rel-A(p65_NFKB)、CREB、組蛋白H2B、HATs、HDACs、PKR、Rb、細(xì)胞周期蛋白D、細(xì)胞周期蛋白E、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白 B、P16、pl4Arf、p27KIP、p21CIP、Cdk4、Cdk6、Cdk7、Cdkl、Cdk2、Cdk9、Cdc25、A/B/C、Abl、E2F、FADD、TRADD、TRAF2、RIP、Myd88、BAD、Bcl-2、Mcl-l、Bcl-XL、胱天蛋白酶 2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、IAPs、Smac、胞襯蛋白、肌動(dòng)蛋白、31^、1^11、卩711、1^1^州11(、I K B、p65 (RelA)、IKKa、PKA、PKCa、PKC0、PKC 0、PKC 8、CAMK、Elk、AFT、Myc、Egr-U NFAT, ATF-2, Mdm2、p53、DNA-PK、Chkl、Chk2、ATM、ATR、3 聯(lián)蛋白、CrkL, GSK3 a、GSK3 ^、以及 FOXO0在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本文所述的方法被用于測(cè)定信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的可激活元件的激活水平。參見u. S. S.第61/048，886號(hào)和第61/048，920，其被并入本文。提供了方法和組合物以用于根據(jù)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的可激活元件的狀態(tài)來(lái)測(cè)定細(xì)胞的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。提供了方法和組合物以用于根據(jù)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的可激活元件的狀態(tài)來(lái)測(cè)定不同細(xì)胞群體中的細(xì)胞的生理狀態(tài)。所述細(xì)胞是造血細(xì)胞。造血細(xì)胞的實(shí)例見于本文。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的可激活元件的激活水平而對(duì)不同的分離的細(xì)胞群體中的細(xì)胞的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行的測(cè)定包括將所述細(xì)胞群體歸類為關(guān)聯(lián)于臨床結(jié)果的細(xì)胞。臨床結(jié)果、階段、患者響應(yīng)和分類的實(shí)例見于上文。結(jié)合元件在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中測(cè)定了可激活元件的激活水平。一個(gè)實(shí)施方案通過(guò)將來(lái)自細(xì)胞群體的細(xì)胞接觸特異于所述可激活元件的激活水平的結(jié)合元件而實(shí)施該測(cè)定。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合元件”包括任意分子，如肽、核酸、有機(jī)小分子，其對(duì)于可激活元件的ー種激活狀態(tài)的檢測(cè)能夠超過(guò)對(duì)該可激活元件的另ー種激活狀態(tài)的檢測(cè)。結(jié)合元件和用于結(jié)合元件的標(biāo)記物見于 U. S. S. N. /048，886 ;61/048，920 以及 61/048，657。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合元件是肽、多肽、寡肽或蛋白質(zhì)。所述肽、多肽、寡肽或蛋白質(zhì)可以由天然氨基酸和肽鍵所構(gòu)成，或由合成的模擬肽結(jié)構(gòu)所構(gòu)成。因此本文所使用的“氨基酸”或“肽殘基”包括天然和合成氨基酸。例如，高苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被考慮為用于本發(fā)明目的的氨基酸。所述側(cè)鏈可以是(R)或(S)構(gòu)型。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸是(S)或L-構(gòu)型。在使用了非天然側(cè)鏈的情況下，非氨基酸取代物可被用干，例如，防止或延遲體內(nèi)降解。包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)可被合成或在某些情況下進(jìn)行重組制備，參見 van Hest 等人，F(xiàn)EBS Lett 428 (1-2)68-70 頁(yè) 1998 年 5 月 22 日以及 Tang等人，Abstr. Pap Am. Chem. S218 :U138第2部分1999年8月22日，兩者均明確地以引用的方式并入本文。本發(fā)明的方法可被用于在樣品中檢測(cè)任意特定的可激活元件，所述可激活元件具有作為抗原的可檢測(cè)性并且作為抗原可與存在于所述樣品中的其他可激活元件相區(qū)分。例如，本發(fā)明的激活狀態(tài)特異性抗體可被用于本方法以辨識(shí)復(fù)合細(xì)胞群體的亞組或亞群體的不同信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，以及蛋白質(zhì)激活(如，激酶激活)在潛在的信號(hào)傳導(dǎo)層級(jí)中的次序。因此，在一些實(shí)施方 案中，使用本發(fā)明的方法對(duì)ー種更多種多肽的表達(dá)和磷酸化進(jìn)行了檢測(cè)和定量。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法對(duì)ー種更多種多肽的表達(dá)和磷酸化進(jìn)行了檢測(cè)和定量，所述多肽是細(xì)胞途徑的細(xì)胞組分。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“激活狀態(tài)特異性抗體”或“激活狀態(tài)抗體”或其語(yǔ)法上的等價(jià)物指的是特異地結(jié)合于對(duì)應(yīng)和特定抗原的抗體。在優(yōu)選的情況下，所述對(duì)應(yīng)和特定抗體是特定形式的可激活元件。同樣是優(yōu)選的情況下，所述激活狀態(tài)特異性抗體的結(jié)合是特定可激活元件的特定激活狀態(tài)的指征。在一些實(shí)施方案中,所述結(jié)合元件是抗體。在一些實(shí)施方案中,所述結(jié)合元件是激活狀態(tài)特異性抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括全長(zhǎng)抗體和抗體片段，并且可能指的是根據(jù)下文進(jìn)ー步定義用于實(shí)驗(yàn)、治療或其他目的的來(lái)自任意生物體的天然抗體、工程改造抗體或重組產(chǎn)生的抗體。正如本領(lǐng)域所知，抗體片段的實(shí)例如，通過(guò)對(duì)完整抗體的修飾所產(chǎn)生的或通過(guò)使用重組DNA技術(shù)進(jìn)行從頭合成的Fab、Fab' >F(ab/ ) 2、Fv、scFv或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括單克隆和多克隆抗體。抗體可以是拮抗劑、激動(dòng)劑、具中和能力、具抑制性或具刺激性。其可被人源化、糖基化、結(jié)合固體支持物并且具有其他變體。更多關(guān)于抗體作為結(jié)合元件的信息參見U. S. S.第61/048，886號(hào)；第61/048，920號(hào)以及第61/048，657號(hào)。激活狀態(tài)特異性抗體可被用于檢測(cè)激酶活性，但是本發(fā)明提供了另外的手段用于檢測(cè)激酶的激活。例如，被蛋白質(zhì)激酶特異地識(shí)別并因此被磷酸化的底物是已知的。特異地結(jié)合于這些磷酸化底物但不結(jié)合于未磷酸化底物的抗體(磷酸化底物抗體)可被用于在樣品中檢測(cè)激活的激酶的存在。可激活元件的激活異構(gòu)型的抗原性可與可激活元件的非激活異構(gòu)型的抗原性相區(qū)分或與不同的激活狀態(tài)的異構(gòu)型的抗原性相區(qū)分。在一些實(shí)施方案中，元件的激活異構(gòu)型具有元件的非激活異構(gòu)型所不具有的表位，或是相反的情況。在一些實(shí)施方案中，這種區(qū)別是由于諸如磷酸根基團(tuán)這樣的基團(tuán)與元件的加合，或由于元件的結(jié)構(gòu)變化，如通過(guò)蛋白質(zhì)切割，或由于元件中在其他情況下會(huì)被誘導(dǎo)出的構(gòu)象變化，其以作為抗原可區(qū)別的方式使所述元件呈現(xiàn)相同的序列。在一些實(shí)施方案中，這樣的構(gòu)象變化使元件的激活異構(gòu)型呈遞至少ー種在非激活異構(gòu)型中不存在的表位，或不呈遞至少ー種在該元件的非激活異構(gòu)型中被呈遞的表位。在一些實(shí)施方案中，用于區(qū)分抗體的表位圍繞所述元件的活性位點(diǎn)為中心而分布，盡管本領(lǐng)域已知元件的ー個(gè)區(qū)域的構(gòu)象變化也可導(dǎo)致所述元件不同區(qū)域的改變。已經(jīng)產(chǎn)生了多種特異地結(jié)合于蛋白質(zhì)的磷酸化異構(gòu)體但不特異地結(jié)合蛋白質(zhì)的非磷酸化異構(gòu)體的抗體、其中多種抗體是市售的(如、參見Cell Signaling Technology、www. cellsignal. com 或 Becton Dickinson、www. bd. com)。已產(chǎn)生許多這樣的抗體，其用于對(duì)可逆磷酸化的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)的研究。特別地，已產(chǎn)生許多這樣的抗體，其特異地結(jié)合于磷酸化的激活異構(gòu)型蛋白質(zhì)?？墒褂帽疚乃龅姆椒ㄟM(jìn)行分析的蛋白質(zhì)包括但不限于激酶、HER受體、PDGF受體、FLT3受體、Kit受體、FGF受體、Eph受體、Trk受體、IGF受體、胰島素受體、Met受體、Ret、VEGF受體、TIEl、TIE2、促紅細(xì)胞生成素受體、血小板生成素受體、CD114、CD116、FAK> Jakl、Jak2、Jak3、Tyk2> Src> Lyn> Fyn、Lck、Fgr、Yes、Csk、Abl> Btk、ZAP70、Syk、IRAK、cRaf、ARaf、BRAF, Mos, Lim 激酶、ILK、Tpl、ALK、TGF^ 受體、BMP 受體、MEKKs、ASK、MLKs、DLK、PAKs、Mek I、Mek 2、MKK3/6、MKK4/7、ASK1、Cot、NIK、Bub、Myt I、Weel、酪蛋白激酶、PDKl、SGKl、SGK2、SGK3、Aktl、Akt2、Akt3、p90Rsks、p70S6 激酶、Prks,PKC、PKA、ROCK I、ROCK 2、極光激酶、CaMKs、MNKs、AMPKs、MELK、MARKs、Chkl、Chk2、LKB-1、MAPKAPKs、Piml、Pim2、Pim3、IKK、Cdk、Jnk, Erks、IKK、GSK3 a、GSK3 P、Cdk、CLK、PKR、PI3-激酶 I 型、2 型、3 型、mTor、SAPK/JNKI, 2, 3, p38s、PKR、DNA-PK, ATM、ATR、磷酸酶、受體蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(RPTP)、LAR磷酸酶、CD45、非受體酪氨酸磷酸酶(NPRTP)、SHP、MAP激酶磷酸酶(MKP)、雙特異性磷酸酶(DUSP)、CDC25磷酸酶、低分子量酪氨酸磷酸酶、眼缺陷蛋白(EYA)酪氨酸磷酸酶、Slingshot磷酸酶(SSH)、絲氨酸磷酸酶、PP2A、PP2B、PP2C、PP1、PPS、肌醇磷酸酶、PTEN、SHIPs、肌管素、脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)、磷酸肌醇激酶、磷脂酶、前列腺素合成酶、5-脂氧合酶、鞘氨醇激酶、鞘磷脂酶、接頭/骨架蛋白、She、Grb2、BLNK、LAT, PI3-激酶 B 細(xì)胞接頭蛋白(BCAP)、SLAP、Dok、KSR、MyD88、Crk, CrkL, GAD、Nek、Grb2 相關(guān)結(jié)合蛋白(GAB)、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)、TRADD、TRAF2、RIP、T細(xì)胞白血病家族、細(xì)胞因子、1し-2、1レ4、1し-8、1レ6、干擾素Y、干擾素a、細(xì)胞因子調(diào)控物，細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白(SOC)、泛素化酶、Cbl、SCF泛素連接酶復(fù)合物、APC/C、粘附分子、整合素、免疫球蛋白樣粘附分子、選擇素、鈣黏素、聯(lián)蛋白、局部粘著斑激酶、P130CAS、細(xì)胞骨架/收縮蛋白、胞襯蛋白、肌動(dòng)蛋白、樁蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白結(jié)合蛋白、微管蛋白、eg5/KSP、CENP、G蛋白異三聚體、P -腎上腺能受體、毒蕈堿性受體、腺苷酸環(huán)化酶受體、小分子量GTP酶、H-Ras, K-Ras,N-Ras, Ran、Rac、Rho、Cdc42、Arf、RAB, RHEB、鳥嘌呤核苷酸交換因子、Vav、Tiam、Sos、Dbl、PRK、TSCI，2、GTP酶激活蛋白、Ras-GAP、Arf-GAP、Rho-GAP、胱天蛋白酶、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、凋亡參與蛋白、Bcl-2、Mcl-K Bcl-XL、Bcl_w、Bcl_B、Al、Bax、Bak、Bok、Bik、Bad、Bid、Bim、Bmf、Hrk、Noxa、Puma、1八卩31ル？、311^(3、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋劑、0(11^4、0(11^ 6、Cdk 2、Cdkl、Cdk 7、細(xì)胞周期蛋白D、細(xì)胞周期蛋白E、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B、Rb、pl6、pl4Arf、p27KIP、p21CIP、分子伴侶、Hsp90、Hsp70、Hsp27、代謝酶類、こ酰輔酶A羧化酶、ATP-檸檬酸裂解酶、一氧化氮合成酶、膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白、內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)裝置(ESCRT)蛋白、膜泡蛋白分選蛋白(Vsps)、羥化酶、脯氨酸羥化酶PHD-1、2和3、天冬氨酸羥化酶FIH轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶、Pinl脯氨酸異構(gòu)酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、去こ酰酶、組蛋白去こ酰酶、sirtuins、こ酰酶、組蛋白こ?；?、CBP/P300家族、MYST家族、ATF2、甲基化酶、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶、組蛋白 H3K4 去甲基酶、H3K27、JHDM2A、UTX、腫瘤抑制蛋白基因、VHL、WT-I、p53、Hdm, PTEN、蛋白酶、泛素蛋白酶、尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)與uPA受體(uPAR)系統(tǒng)、組織蛋白酶、金屬蛋白酶、酯酶、水解酶、分離酶、離子通道，鉀通道、鈉通道、分子轉(zhuǎn)運(yùn)體、多藥抗性蛋白、 P-糖蛋白、核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)錄因子/DNA結(jié)合蛋白、Ets、Elk、SMAD、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、NFAT、ATF-2、AFT、Myc、Fos、SpI、Egr-I、T_bet、P -聯(lián)蛋白、HIFs、FOXOs、E2Fs、SRFs、TCFs、Egr-U ^ -FOXO STATUSTAT 3,STAT 4,STAT 5,STAT 6、p53、WT_l、HMGA、翻譯調(diào)控劑、pS6、4EPB-l、eIF4E-結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、RNA聚合酶、起始因子以及延伸因子。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是S6。在一些實(shí)施方案中，使用的是活性狀態(tài)抗體的表位識(shí)別片段而非完整所述抗體。在一些實(shí)施方案中，所述表位識(shí)別片段被固定。在一些實(shí)施方案中，使用了識(shí)別表位的抗原輕鏈。可使用編碼識(shí)別表位的輕鏈基因產(chǎn)物的重組核酸通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的手段來(lái)制備這樣的抗體片段。在本發(fā)明的替代性實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)結(jié) 合元件的芳香族氨基酸被其他分子所取代。參見 U. S. S.第 61/048，886 號(hào)；第 61/048，920 號(hào)和第 61/048，657 號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述激活狀態(tài)特異性結(jié)合元件是包含識(shí)別結(jié)構(gòu)的肽，其結(jié)合于可激活蛋白質(zhì)之上的靶結(jié)構(gòu)。多種識(shí)別結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域中被熟知并且可使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行制備，所述方法包括曬菌體展示文庫(kù)(Gururaja等人，Chem. Biol. (2000年)7 515-27 頁(yè)；Houime I 等人，Eur. J. Tmmuno I. (2001 年)31 :3535-45 頁(yè)；Cochran 等人，J. Am.Chem. Soc. (2001 年)123 :625-32 頁(yè)；HouimeI 等人，Int. J. Cancer (2001 年)92 :748_55，各文獻(xiàn)均已引用的方式并入本文)。另外，熒光團(tuán)可被連接于這些抗體以用于本發(fā)明的方法。本領(lǐng)域已知多種識(shí)別結(jié)構(gòu)(例如Cochran等人，J. Am. Chem. Soc. (2001年)123 625-32頁(yè)；Boer等人，Blood(2002年)100 :467-73頁(yè)，均明確地以引用的形式并入本文)并且可使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行制備(例如，參見Boer等人，Blood (2002年)100 :467-73頁(yè)；Gualillo等人，Mol. Cell Endocrinol. (2002) 190 :83_9頁(yè),均明確地以引用的形式并入本文)，其包括例如，組合化學(xué)方法，其用于制備諸如多聚物這樣的對(duì)可激活蛋白質(zhì)的靶結(jié)構(gòu)具親和性的識(shí)別結(jié)構(gòu)(例如，參見Barn等人，J. Comb. Chem. (2001年)3 :534-41頁(yè)Ju等人，Biotechnol. (1999年)64 :232_9頁(yè)，均明確地以引用的形式并入本文)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，激活狀態(tài)特異性抗體是僅結(jié)合于磷酸化的特定可激活蛋白質(zhì)的某一種異構(gòu)型的蛋白質(zhì)，并且其不結(jié)合于該可激活蛋白質(zhì)處于未磷酸化或非磷酸化時(shí)的異構(gòu)型。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述激活狀態(tài)特異性抗體是ー種蛋白質(zhì)，其僅結(jié)合于可激活蛋白質(zhì)處于細(xì)胞內(nèi)而非細(xì)胞外時(shí)的異構(gòu)型，或者與之相反的情況。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述識(shí)別結(jié)構(gòu)是抗層粘連蛋白單鏈抗體片段(scFV)(例如，參見Sanz等人，Gene Therapy (2002年)9 :1049-53頁(yè)；Tse等人，J. Mol. Biol. (2002年)317 :85-94頁(yè)，均明確地以引用的形式并入本文)。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合元件是核酸。術(shù)語(yǔ)“核酸”包括核酸類似物，例如憐酸胺(Beaucage 等人，Tetrahedron 49(10) :1925(1993 年)及其中引文；Letsinger,J. Org. Chem. 35 :3800 頁(yè)(1970 年)；Sprinzl 等人，Eur. J. Biochem. 81 :579 頁(yè)(1977 年)；Letsinger 等人，Nucl. Acids Res. 14 :3487 頁(yè)(1986 年)；Sawai 等人，Chem. Lett. 805 頁(yè)(1984 年)，Letsinger 等人，J. Am. Chem. Soc. 110 :4470 頁(yè)(1988 年)；以及 Pauwels 等人，Chemica Scripta 26:141 91986 頁(yè))、硫代憐酸酯(Mag等人,Nucleic Acids Res. 19:1437頁(yè)(1991年);以及美國(guó)專利第5，644，048號(hào))、ニ硫代磷酸酯(Briu等人，J. Am. Chem.Soc. Ill :2321 頁(yè)(1989 年))、0-甲基亞憐酸胺連接物(參見 Eckstein, Oligonucleotidesand Analogues A Practical Approach, Oxford University Press)以及妝核酸骨架和連接物(參見 Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114 :1895 頁(yè)(1992 年);Meier 等人，Chem. Int.Ed. Engl. 31 :1008 頁(yè)(1992 年);Nielsen, Nature, 365 :566 頁(yè)(1993 年);Carlsson 等人，Nature 380 :207頁(yè)(1996年)，以上這些其以引用的方式并入本文)。其他核酸類似物包括具有正電骨架的類似物(Denpcy 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :6097 (1995 年))、非離子骨架的類似物(美國(guó)專利第5，386，023號(hào)、第5，637，684號(hào)、第5，602，240號(hào)、第
5,216, 141 號(hào)和第 4，469, 863 號(hào)；Kiedrowshi 等人，Angew. Chem. Intl. Ed. English 30 423 頁(yè)(1991 年)；Letsinger 等人，J. Am. Chem. Soc. 110 :4470 頁(yè)(1988 年)；Letsinger等人，Nucleoside & Nucleotide 13 :1597 頁(yè)(1994 年)；ASC Symposium Series 580,“Carbohydrate Modifications in Antisense Research，，,第 2 和第 3 章,Y. S. Sanghui 和P. Dan Cook編；Mesmaeker等人，Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4 :395頁(yè)(1994年)；Jeffs等人，J. Biomolecular NMR 34 :17頁(yè)(1994年)；Tetrahedron Lett. 37 :743頁(yè)(1996年))和非核糖骨架的類似物，包括美國(guó)專利第5，235,033號(hào)和第5，034，506號(hào)，以及ASCSymposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research,果6和第7章，Y. S. Sanghui和P. Dan Cook編。包含一種或更多種碳環(huán)糖類的核酸也包含在 核酸的定義之內(nèi)(參見Jenkins等人,Chem. Soc. Rev. (1995年)169-176頁(yè))。多種核酸類似物的描述見于Rawls，C & E News，1997年6月2日，35頁(yè)。所有這些文獻(xiàn)均明確地以引用的方式并入本文?？蓪?shí)施所述核糖磷酸骨架的這些修飾用以輔助諸如標(biāo)記物這樣的另外基團(tuán)的添加，或者用以提高這些分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。 在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合元件是有機(jī)小化合物。結(jié)合元件可合成自一系列可被化學(xué)修飾的底物?！盎瘜W(xué)修飾”在此包括傳統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)以及酶學(xué)反應(yīng)。這些底物一般包括，但不限于，烷基基團(tuán)(包括烷烴、烯烴、炔烴和雜烷基)、芳基基團(tuán)(包括芳烴和雜芳烴)、醇、醚、胺、醛、酮、酸、酷、氨基化合物、環(huán)狀化合物、雜環(huán)化合物(包括嘌呤、嘧啶、苯并ニ氮革、^ -內(nèi)酰胺、四環(huán)素、頭孢菌素和氨水化合物)、留體(包括雌激素、雄激素、可的松、蛻皮留酮等等)、生物堿(包括麥角堿、長(zhǎng)春花堿、箭毒堿、吡咯聯(lián)啶生物堿和絲裂霉素)、有機(jī)金屬化合物、攜帶雜原子的化合物、氨基酸和核苷。化學(xué)(包括酶學(xué))反應(yīng)可在這些基團(tuán)上進(jìn)行以形成新的底物或結(jié)合元件，其可隨后被用于本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合元件是碳水化合物。本文所使用的術(shù)語(yǔ)碳水化合物意在包括任何具有通式(CH2O)n的化合物。碳水化合物的實(shí)例是ニ糖、三糖和寡糖，以及多聚糖如糖原、纖維素和淀粉。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合元件是脂質(zhì)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)脂質(zhì)在此意在包含任何水不溶的有機(jī)分子，其可溶于非極性有機(jī)溶剤。脂質(zhì)的實(shí)例是諸如膽固醇這樣的甾體以及諸如鞘磷脂這樣的磷脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合元件在對(duì)所述可激活元件進(jìn)行激活之前將其分離，例如，通過(guò)質(zhì)譜?？杉せ钤?、激活狀態(tài)和測(cè)定可激活元件的激活水平的方法的實(shí)例在題為“Methods and compositions for detecting the activation state oi multipleproteins in single cells” 的美國(guó)專利申請(qǐng)第 20060073474 號(hào)以及題為 “Methods andcompositions for risk stratification”的美國(guó)專利申請(qǐng)第20050112700號(hào)中有所描述，其內(nèi)容以引用的方式并入本文。標(biāo)記物本發(fā)明的方法和組合物提供了包含標(biāo)記物或標(biāo)簽的結(jié)合元件。標(biāo)記物指的是可被直接(即，初級(jí)標(biāo)記物)或間接(即，次級(jí)標(biāo)記物)檢測(cè)的分子，例如標(biāo)記物可被可視化和/或測(cè)量或在其他情況下被辨識(shí)以獲知其存在與否。結(jié)合元件和用于結(jié)合元件的標(biāo)記物見于 U. S. S. N. /048，886 ;61/048，920 以及 61/048，657?；衔锟芍苯拥鼗蜷g接地連接于標(biāo)記物或，該標(biāo)記物提供可檢測(cè)信號(hào)，如，放射性同位素、熒光劑、酶、抗體、顆粒物如磁性顆粒物、化學(xué)發(fā)光劑、可通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)的分子、或特異性結(jié)合分子等。特異性結(jié)合分子包括分子對(duì)，諸如生物素和鏈霉親和素、地高辛和地高辛抗體等。標(biāo)記物的實(shí)例包括但不限于，光學(xué)熒光物和生色染料，包括標(biāo)記物，標(biāo)記酶和放射性同位素。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，這些標(biāo)簽可被連接于所述結(jié)合元件。在一些實(shí)施方案中，一 種或更多種結(jié)合元件被獨(dú)特地標(biāo)記。在使用兩種激活狀態(tài)特異性抗體的實(shí)例中，“獨(dú)特地標(biāo)記”指的是識(shí)別第一激活元件的ー種激活狀態(tài)抗體包含第ー標(biāo)記物，并且識(shí)別第二激活元件的第二激活狀態(tài)抗體包含第二標(biāo)記物，其中所述第一和第二標(biāo)記物是可檢測(cè)的以及可區(qū)分的，這使得第一抗體和第二抗體被獨(dú)特地標(biāo)記。一般情況下，標(biāo)記物分為四類a)同位素標(biāo)記物，其可為放射性同位素或重同位素山)磁、電、熱標(biāo)記；c)生色的光學(xué)標(biāo)記，包括發(fā)光的、含磷的和熒光染料或基團(tuán)；以及d)結(jié)合分子對(duì)。標(biāo)記物還可包括酶(辣根過(guò)氧化酶等)和磁性顆粒。在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)標(biāo)記物是初級(jí)標(biāo)記物。初級(jí)標(biāo)記物是可以被直接檢測(cè)的標(biāo)記物，如熒光劑。標(biāo)記物包括光學(xué)標(biāo)記，如熒光染料或基團(tuán)。熒光劑可是“小分子”突光物(fluors)或蛋白質(zhì)性熒光物(如綠色熒光蛋白和其所有變體)。在一些實(shí)施方案中，用量子點(diǎn)標(biāo)記激活狀態(tài)特異性抗體,其根據(jù)Chattopadhyay,P. K. 人，Quantum aot semiconductor nanocrystals ior immunophenotypmg bypolychromatic flow cytometry. Nat. Med. 12,972-977頁(yè)(2006年)中所公布的內(nèi)容進(jìn)行。星于兒 ロf通過(guò) Invitrogen 市售，http://probes. invitrogen. com/products/qdot/。經(jīng)量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體可被単獨(dú)使用或其可與結(jié)合有機(jī)熒光染料的抗體組合使用以提高有效標(biāo)記物數(shù)量。隨著被標(biāo)記抗體數(shù)量的提高，對(duì)已知細(xì)胞群體進(jìn)行細(xì)化分型的能力同時(shí)提高。另外，激活狀態(tài)特異性抗體可以使用螯合或籠合(caged)鑭系元素進(jìn)行十不id，其豐艮據(jù) Erkki, J. %=人，Lanthaniae chelates as new fluorocnrome labels forcytochemistry. J. Histochemistry Cytochemistry, 36 :1449-1451,1988 年，以及題為^Salicylamide-Lanthanide Complexes for Use as Luminescent Markers，，的美固專矛[I第7，018850號(hào)中所公布的內(nèi)容進(jìn)行。也可使用其他檢測(cè)熒光的方法，例如，量子點(diǎn)法(例如，參見 Goldman 等人，J. Am. Chem. Soc. (2002 年)124 :6378-82 頁(yè)；Pathak 等人，J. Am. Chem.Soc. (2001) 123 :4103-4 頁(yè)；以及 Remade 等人，Proc. Natl. Sci. USA (2000) 18 :553-8 頁(yè)，各文獻(xiàn)均以引用的形式并入本文)以及共聚焦顯微鏡法。在一些實(shí)施方案中，以適用于電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)的標(biāo)簽對(duì)所述可激活兀件進(jìn)行標(biāo)記，其根據(jù)Tanner等人，Spectrochimica Acta Part B AtomicSpectroscopy，2007 年 3 月；62(3) :188-195 頁(yè)中的描述進(jìn)行。或者，可使用基于FRET的檢測(cè)系統(tǒng)，其在下文有詳細(xì)討論。FRET可用于本發(fā)明，例如，用于檢測(cè)涉及成簇或多聚化的激活狀態(tài)，其中兩個(gè)FRET標(biāo)記物的接近程度由于激活而被改變。在一些實(shí)施方案中，至少使用了兩種熒光標(biāo)記物，其為熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)的成員。本發(fā)明的方法和組合物也可使用標(biāo)記酶。標(biāo)記酶指的是當(dāng)存在標(biāo)記酶底物時(shí)可發(fā)生反應(yīng)的酶，所述底物可產(chǎn)生可檢測(cè)產(chǎn)物。用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)臉?biāo)記酶包括但不限于，辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。用于這些底物的方法在該領(lǐng)域中是被人所熟知的。所述標(biāo)記酶的存在一般通過(guò)該酶所催化的與標(biāo)記酶底物的反應(yīng)而被檢出，該反應(yīng)產(chǎn)生可辨識(shí)產(chǎn)物。這些產(chǎn)物可以是混濁物，如辣根過(guò)氧化物酶與四甲基聯(lián)苯胺的反應(yīng)，并且可具有多種顏色。產(chǎn)生熒光反應(yīng)產(chǎn)物的其他標(biāo)記酶底物如發(fā)光氨(來(lái)自Pierce Chemical Co.)已經(jīng)被開發(fā)。用于使用標(biāo)記酶底物辨識(shí)標(biāo)記酶的方法在該領(lǐng)域中是為人所熟知的，并且有眾多商業(yè)化試劑盒。使用多種標(biāo)記酶的實(shí)例和方法在Savage等人，Previews 247 :6_9頁(yè)(1998 年)，Young，J. Virol. Methods 24 :227-236 頁(yè)(1989 年)中有所描述，其全文均以引用的形式并入本文。放射性同位素是指任何放射性分子。用 于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)姆派湫酝凰匕ǖ幌抻?4C、3H、32P、33P、35S、125I和1311。放射性同位素作為標(biāo)記物的使用在本領(lǐng)域中為人所熟知的。如所描述，標(biāo)記物可被間接地檢測(cè)，即，所述標(biāo)簽是ー個(gè)結(jié)合分子對(duì)的成員?！敖Y(jié)合分子對(duì)的成員”指的是第一部分和第二部分中的ー個(gè)，其中所述第一部分和第二部分互相具有特異性結(jié)合親和力。用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合分子對(duì)包括但不限于，抗原/抗體(如，地高辛/地高辛抗體、ニ硝基苯(DNP)/DNP抗體、丹酰-X-丹?？贵w、熒光素/熒光素抗體、熒光黃/熒光黃抗體、以及羅丹明/羅丹明抗體)、生物素/親和素(或生物素/鏈霉親和素)以及鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(CBP)/鈣調(diào)素。其他的適當(dāng)結(jié)合分子對(duì)包括多肽，如FLAG肽[Hopp 等人，BioTechnology, 6 :1204-1210 頁(yè)(1988 年)；KT3 表位肽[Martin 等人，Science, 255 :192-194 頁(yè)(1992 年);微管蛋白表位肽Skinner 等人，J. Biol. Chem.，266 15163-15166頁(yè)(1991年)以及17基因10蛋白肽標(biāo)簽Lutz-Freyermuth等人，Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 87 :6393-63971990年)以及上述各個(gè)分子的抗體。本領(lǐng)域的人員應(yīng)當(dāng)了解，結(jié)合分子對(duì)成員可根據(jù)本文所述被用于標(biāo)記之外的用途。本領(lǐng)域的人員應(yīng)當(dāng)了解，一種結(jié)合分子對(duì)的成員也可以是另一種結(jié)合分子對(duì)的成員。例如，抗原(第一部分)可結(jié)合于第一抗體(第二部分)，該抗體反過(guò)來(lái)可以是第二抗體(第一部分)的抗原。應(yīng)當(dāng)了解，這樣的情況允許第一部分通過(guò)第二部分與第三部分的間接結(jié)合，所述第二部分是另兩種部分的結(jié)合分子對(duì)成員。本領(lǐng)域的人員應(yīng)當(dāng)了解，結(jié)合分子對(duì)的成員也可能根據(jù)上文所述包含標(biāo)記物。還應(yīng)當(dāng)了解，這實(shí)現(xiàn)了一種標(biāo)簽通過(guò)結(jié)合包含標(biāo)記物的結(jié)合分子對(duì)成員而被間接標(biāo)記。如剛才所述，作為結(jié)合分子對(duì)成員的標(biāo)簽與標(biāo)記物的連接在此被稱為“間接標(biāo)記”。“表面底物結(jié)合分子”或“結(jié)合標(biāo)簽”即語(yǔ)法上的等價(jià)物指的是對(duì)特定表面底物具有結(jié)合親和力的分子，其底物一般是結(jié)合分子對(duì)的ー員，其施用于、并入或在其他情況下連接于表面。適當(dāng)?shù)谋砻娴孜锝Y(jié)合分子和其表面底物包括但不限于多聚組氨酸(多聚His)或多聚組氨酸-甘氨酸(多聚his-gly)以及鎳金屬底物；谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽及其抗體底物(Pierce Chemical有售)；流感病毒HA標(biāo)簽多肽及其抗體12CA5底物Field等人，Mol. Cell. Biol.，8 :2159-2165 頁(yè)(1988 年);c_myc 標(biāo)簽和對(duì)其的 8F9、3C7、6E10、G4、B7 和9E10 抗體Evan 等人,Molecular and Cellular Biology, 5 :3610-3616 頁(yè)(1985 年)；以及單純皰疫病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)簽及其抗體底物Paborsky等人，Protein Engineering,3(6) :547-553頁(yè)(1990年)。一般情況下，用于本發(fā)明的表面結(jié)合底物分子包括但不限于結(jié)合鎳底物的多聚組氨酸結(jié)構(gòu)(His標(biāo)簽)、結(jié)合包含抗體的表面底物的抗原、結(jié)合親和素底物的半抗原(如生物素)以及結(jié)合包含鈣調(diào)素的表面底物的CBP。在一些實(shí)施方案中，所述可激活元件根據(jù)本文所述通過(guò)在該可激活元件中并入標(biāo)記物而被標(biāo)記。例如，可激活元件可在細(xì)胞中標(biāo)記，其通過(guò)將該細(xì)胞與包含放射性同位素的氨基酸進(jìn)行培養(yǎng)而進(jìn)行。所述被標(biāo)記可激活元件的測(cè)量可使用，例如質(zhì)譜。其他激活狀態(tài)指示劑用于本發(fā)明的其他激活狀態(tài)指示劑是通過(guò)顯示這些激活的結(jié)果而實(shí)現(xiàn)對(duì)激活的檢測(cè)的指示劑。例如，底物的磷酸化可被用于檢測(cè)負(fù)責(zé)該底物的磷酸化的激酶的激活。類似地，底物的切割可被用作負(fù)責(zé)此類切割的蛋白酶的指示劑。允許將這樣的跡象與可檢測(cè) 信號(hào)進(jìn)行關(guān)聯(lián)的方法在本領(lǐng)域中是為人所熟知的，所述可檢測(cè)的信號(hào)例子如上文有關(guān)結(jié)合元件描述中的標(biāo)記物和標(biāo)簽。例如，底物的切割可導(dǎo)致淬滅基團(tuán)的去除并且由此使可檢測(cè)信號(hào)從此前被淬滅的標(biāo)記物中產(chǎn)生。另外，結(jié)合元件可被用于被標(biāo)記的可激活元件的分離，其可隨后使用本領(lǐng)域中已知的エ藝進(jìn)行檢測(cè)，例如，使用質(zhì)譜。檢測(cè)在對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行實(shí)施中，所述ー種或更多種可激活元件的狀態(tài)的檢測(cè)可由人員承擔(dān)，例如實(shí)驗(yàn)室中的技術(shù)員。或者，所述ー種或更多種可激活元件的狀態(tài)的檢測(cè)可使用自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行。在任ー情況下，用于根據(jù)本發(fā)明的方法的用途的ー種或更多種可激活元件的狀態(tài)的檢測(cè)可根據(jù)本領(lǐng)域所廣為接受的標(biāo)準(zhǔn)エ藝和方案而實(shí)施。一種或更多種可激活元件可通過(guò)任何對(duì)目的可激活元件進(jìn)行檢測(cè)和/或定量的方法進(jìn)行檢測(cè)和/或定量。這些方法包括，放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、免疫組織化學(xué)、使用或不使用共聚焦顯微鏡法的免疫熒光組織化學(xué)、反相分析、均相酶免疫測(cè)定，以及相關(guān)的非酶學(xué)エ藝、Western印跡法、全細(xì)胞染色、免疫電子顯微鏡法、核酸擴(kuò)增、基因陣列、蛋白質(zhì)陣列、質(zhì)譜、膜片鉗技術(shù)、ニ維凝膠電泳、差示凝膠電泳、基于微球的多元蛋白質(zhì)分析、無(wú)標(biāo)記物細(xì)胞分析以及流式細(xì)胞儀等。美國(guó)專利第4，568，649號(hào)描述了配體檢測(cè)系統(tǒng)，其利用了閃爍計(jì)數(shù)法。這些エ藝特別地有用于蛋白質(zhì)參量的修飾?？墒褂脽晒饣蛟谄渌闆r下使用帶標(biāo)簽的報(bào)告者分子獲取蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞決定性因素的細(xì)胞讀出值。流式細(xì)胞儀方法可用于測(cè)量細(xì)胞內(nèi)參量。參見美國(guó)專利第10/898，734號(hào)以及 Shulz 等人,Current Protocols in Immunology, 2007年，78 :8. 17. 1-20頁(yè)，其全文以引用的方式并入本文。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于測(cè)定單細(xì)胞的可激活元件的激活水平方法。所述方法可包括通過(guò)流式細(xì)胞儀技術(shù)根據(jù)至少兩種可激活元件的激活水平而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的分析。結(jié)合元件(如激活狀態(tài)特異性抗體)被用于根據(jù)可激活元件的激活水平對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，并可根據(jù)下文所述被檢測(cè)。結(jié)合元件還可被用于分離可激活元件，其可隨后通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行分析。或者，非結(jié)合元件系統(tǒng)可根據(jù)上文所述被用于本文所述的任意系統(tǒng)。當(dāng)使用本發(fā)明的方法和組合物中的熒光標(biāo)記組分時(shí)，可以理解，不同類型的熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，如細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量設(shè)備系統(tǒng)，可被用于實(shí)施本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，使用了流式細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)或用于高通量篩選的系統(tǒng)，如96孔或更多孔的微滴度平板。實(shí)施對(duì)熒光材料的分析的方法在本領(lǐng)域中為人所熟知并被描述于，例如，Lakowicz, J. R. , Principles ofFluorescence Spectroscopy, New York Plenum Press (1983 年)；Herman, B. , Resonanceenergy transfer microscopy, in :Fluorescence Microscopy of Living Cells inCulture, Part B, Methods in Cell Biology, vol. 30, Taylor, D. L.和 Wang, Y. -L.編，San Diego Academic Press (1989 年)，第 219-243 頁(yè)；Turro, N. J. , Modern MolecularPhotochemistry, Menlo Park Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc. (1978 年)，果296-361 頁(yè)。
樣品中的熒光可使用熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。一般情況下，來(lái)自激發(fā)源的具第一波長(zhǎng)的激發(fā)輻射通過(guò)激發(fā)光學(xué)設(shè)備。所述激發(fā)光學(xué)設(shè)備導(dǎo)致所述激發(fā)輻射對(duì)所述樣品進(jìn)行激發(fā)。與之相應(yīng)，所述樣品中的熒光蛋白質(zhì)進(jìn)行發(fā)射照射，其具有不同于所述激發(fā)波長(zhǎng)的波長(zhǎng)。收集光學(xué)設(shè)備隨后收集來(lái)自所述樣品的發(fā)射光。所述儀器可包括溫度控制器以在被掃描時(shí)將溫度維持于特定溫度。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方案，多軸轉(zhuǎn)換臺(tái)對(duì)載有多種樣品的微滴度平板進(jìn)行移動(dòng)用以定位待曝光的不同孔。所述多軸轉(zhuǎn)換臺(tái)、溫度控制器、自動(dòng)對(duì)焦功能以及與成像和數(shù)據(jù)收集相關(guān)的電子設(shè)備可通過(guò)經(jīng)適當(dāng)編程的數(shù)字計(jì)算機(jī)進(jìn)行管理。所述計(jì)算機(jī)可將分析期間所收集的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成另ー種格式以用于呈現(xiàn)。一般情況下，可使用已知的機(jī)器人系統(tǒng)和組件。也可使用其他檢測(cè)熒光的方法，例如，量子點(diǎn)法(例如，參見Goldman等人，J. Am.Chem. Soc. (2002 年)124 :6378-82 頁(yè)；Pathak 等人，J. Am. Chem. Soc. (2001) 123 :4103-4 頁(yè)；以及Remade等人，Proc. Natl. Sci. USA(2000) 18 :553_8頁(yè)，各文獻(xiàn)均以引用的形式并入本文)以及共聚焦顯微鏡法。一般情況下，流式細(xì)胞儀涉及個(gè)體細(xì)胞在激光束的光路中經(jīng)過(guò)。通過(guò)光電倍増管對(duì)所述光束和任何結(jié)合于所述細(xì)胞或在其中存在的熒光分子的散射進(jìn)行檢測(cè)以產(chǎn)生可讀取的輸出值，如大小、粒度或熒光強(qiáng)度。發(fā)明的方法的檢測(cè)、分選或分離步驟可需要熒光激活細(xì)胞分選(FACS)エ藝，其中FACS被用于從包含特定表面標(biāo)記物的群體中選擇細(xì)胞，或者所述選擇步驟可需要使用磁性反應(yīng)顆粒作為支持物用于目標(biāo)細(xì)胞捕獲和/或背景消除。多種FACS系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的并且可被用于本發(fā)明的方法(參見，例如，于1999年4月16日提交的W099/54494 ;于2001年7月5日提交的美國(guó)中請(qǐng)書第20010006787號(hào)，其均明確地以引用的形式并入本文)。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ACS細(xì)胞分選器(例如 FACSVantageTM Cell Sorter,BectonDickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Calif.)被用于對(duì)可用作調(diào)節(jié)劑或用作參比細(xì)胞群體的細(xì)胞進(jìn)行分選和收集。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)劑或參比細(xì)胞首先接觸經(jīng)熒光標(biāo)記的針對(duì)特定的元件的結(jié)合元件(如抗體)。在這樣的實(shí)施方案中，在各個(gè)細(xì)胞上結(jié)合的結(jié)合元件的量通過(guò)將包含該細(xì)胞的液滴通過(guò)所述細(xì)胞分選器而進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)對(duì)包含所述陽(yáng)性細(xì)胞的液滴施加電磁荷，所述細(xì)胞可從其他細(xì)胞分離開。所述陽(yáng)性選定細(xì)胞可隨后被收集于無(wú)菌的收集管中。這些細(xì)胞分選方法被詳細(xì)描述于，例如，F(xiàn)ACSVantageTM訓(xùn)練手冊(cè)，特別參見3-11至3-28以及10-1至10-17章節(jié)，該手冊(cè)全文以引用的形式并入本文。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，使用基于可激活元件的某種異構(gòu)型的存在的細(xì)胞磁性分離對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分選。在這樣的分離エ藝中，進(jìn)行陽(yáng)性選擇的細(xì)胞首先接觸特異性結(jié)合元件(如，結(jié)合可激活元件某種異構(gòu)型的抗體或試劑)。所述細(xì)胞隨后接觸可回收顆粒(如，磁性反應(yīng)顆粒)，該顆粒連接于結(jié)合所述特異性元件的試劑。所述細(xì)胞-結(jié)合元件-顆粒復(fù)合物可隨后與非陽(yáng)性或未標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行物理分離，例如，使用磁場(chǎng)進(jìn)行分離。當(dāng)使用磁性反應(yīng)顆粒之時(shí)，可使用磁場(chǎng)將所述陽(yáng)性或經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞保留于容器中，而所述陰性細(xì)胞被去除。這些以及類似分離方法被描述于，例如，Baxter Immunotherapy Isolex培訓(xùn)手冊(cè) ,其全文以引用的方式并入本文。在一些實(shí)施方案中，提供了用于對(duì)單細(xì)胞的受體元件激活狀態(tài)特征進(jìn)行測(cè)定的方法。所述方法包括提供細(xì)胞群體并且通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)所述細(xì)胞群體進(jìn)行分析。在優(yōu)選的情況下，根據(jù)至少一種可激活元件的激活水平對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)至少兩種可激活元件的激活水平對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。
在一些實(shí)施方案中，多種可激活元件激活狀態(tài)抗體被用于對(duì)多種元件的激活水平同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)流式細(xì)胞儀根據(jù)至少兩種元件的激活水平進(jìn)行的細(xì)胞分析與對(duì)其他流式細(xì)胞儀可讀輸出值的測(cè)定相組合，如表面標(biāo)記物的存在、粒度和細(xì)胞大小，從而提供多種元件的激活水平與可被流式細(xì)胞儀對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量的其他細(xì)胞特征之間的相關(guān)性。應(yīng)當(dāng)了解的是，本發(fā)明還提供了元件簇集事件在信號(hào)傳導(dǎo)中的次序測(cè)定。特別地，本發(fā)明使技術(shù)人員得以根據(jù)簇集水平與單細(xì)胞內(nèi)多種元件的激活之間的相關(guān)性而構(gòu)建元件簇集與激活層級(jí)。通過(guò)在單一時(shí)間點(diǎn)將細(xì)胞或細(xì)胞群體的激活水平與參照進(jìn)行對(duì)比或通過(guò)所在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)比細(xì)胞以觀察亞群體在其他細(xì)胞之中的顯現(xiàn)而完成該次序測(cè)定。應(yīng)當(dāng)了解的是，這些方法提供了在細(xì)胞群體中對(duì)于人為因素的和刺激性病狀的不同信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)所進(jìn)行的辨識(shí)，所述細(xì)胞群體的例子如外周血單核細(xì)胞或初始和記憶淋巴細(xì)胞。在必要的情況下，細(xì)胞被分散于單細(xì)胞懸液之中，例如通過(guò)用適當(dāng)?shù)牡鞍酌高M(jìn)行的酶學(xué)消化，該蛋白酶的例子如膠原酶、分散酶等等。適當(dāng)?shù)娜芤罕挥糜诜稚⒒驊腋?。這些溶液一般應(yīng)是平衡鹽溶液，如生理鹽水、PBS、漢克平衡鹽緩沖液(Hanks balanced saltsolution)等，其方便地補(bǔ)充以胎牛血清或其他天然因子，其結(jié)合于低濃度的可接受緩沖液，該濃度一般介于5-25mM。便用的緩沖液包括HEPESl磷酸緩沖液、乳酸鹽緩沖液等。所述細(xì)胞可被固定，例如，使用3%多聚甲醛而進(jìn)行，并且通常經(jīng)增透化，例如使用冰冷甲醇；使用含0. I %皂角苷、3% BSA的HEPES緩沖的PBS進(jìn)行；通過(guò)在-200C在丙酮內(nèi)浸沒(méi)2分鐘而進(jìn)行；以及本領(lǐng)域已知的類似方法并且根據(jù)本文所述的方法而進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，一種或更多種細(xì)胞被置于96孔平板或其他市售的多孔平板的孔中。在一個(gè)替代性的實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物或細(xì)胞處于細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量?jī)x器之中?？捎糜诒景l(fā)明的其他多孔平板包括但不限干，384孔平板和1536孔平板?？捎糜诒景l(fā)明的其他放置所述反應(yīng)混合物和細(xì)胞的器皿對(duì)于技術(shù)人員應(yīng)是很明了的。用于對(duì)可激活元件的激活水平或活性的進(jìn)行檢測(cè)分析的組分或?qū)@些激活水平或活性進(jìn)行調(diào)控的組分的加入可順序進(jìn)行或在適用于所分析的活性的條件下以預(yù)定的次序或分組進(jìn)行。這些條件在本文有所描述并在本領(lǐng)域中是已知的。另外，進(jìn)ー步的指導(dǎo)在下文提供(例如，參見實(shí)施例)。在一些實(shí)施方案中，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)對(duì)可激活元件的激活水平進(jìn)行測(cè)量。已被標(biāo)記以特異性元件的結(jié)合元件與所述可激活元件進(jìn)行結(jié)合。當(dāng)所述細(xì)胞被引入所述ICP之時(shí),其被霧化(atomized)和離子化。測(cè)量了所述細(xì)胞的元件組合物，其包括與所述可激活元件相結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合元件。對(duì)應(yīng)于所述結(jié)合元件之上的標(biāo)記物的信號(hào)的存在和強(qiáng)度顯示了該細(xì)胞中的可激活元件的水平(Tanner等人，SpectrochimicaActa Part B Atomic Spectroscopy, 2007 年 3 月，62 (3) :188-195 頁(yè))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，本方法和組合 物可用于除流式細(xì)胞儀分析之外的多種其他分析形式。例如，類似于DNA芯片的芯片可被用于本發(fā)明的方法。用于將核酸以預(yù)設(shè)陣列印跡于芯片之上的陣列儀和方法是已知的。另外，蛋白質(zhì)芯片和用于合成的方法是已知的。這些方法和材料可經(jīng)適應(yīng)性調(diào)整用于將激活狀態(tài)結(jié)合元件以預(yù)設(shè)陣列附著于芯片之上。在一些實(shí)施方案中，這樣的芯片包含多種元件激活狀態(tài)結(jié)合元件并且被用于對(duì)細(xì)胞表面存在的元件進(jìn)行元件激活狀態(tài)特征測(cè)定。參見美國(guó)專利第5，744，934號(hào)。在ー些實(shí)施方案中，使用了微流控成像細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Sun等人，Cancer Res ;70 (15) 2010年8月I曰)。在一些實(shí)施方案中，可使用共聚焦顯微鏡法以檢測(cè)個(gè)體細(xì)胞的激活特征。共聚焦顯微鏡法依賴于對(duì)來(lái)自經(jīng)空間濾波的個(gè)體樣品點(diǎn)的光進(jìn)行系列收集，其隨后經(jīng)電子處理以渲染所述樣品的放大圖像。共聚焦顯微鏡法所涉及的信號(hào)加工具有在單細(xì)胞中檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合元件的附加能力，因此在本實(shí)施方案中所述細(xì)胞可被標(biāo)記以一種或更多種結(jié)合元件。在一些實(shí)施方案中，與共聚焦顯微鏡法聯(lián)合使用的結(jié)合元件是偶聯(lián)于熒光標(biāo)記物的抗體，但是諸如其他蛋白質(zhì)或核酸這樣的其他結(jié)合元件也是可能的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可結(jié)合“細(xì)胞內(nèi)Western分析”進(jìn)行使用。在這樣的分析中，細(xì)胞使用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)エ藝最初生長(zhǎng)于標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)瓶中。一旦生長(zhǎng)至最佳匯合度，除去所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗和胰酶消化。所述細(xì)胞可隨后進(jìn)行計(jì)數(shù)并且將足以轉(zhuǎn)移適量細(xì)胞的體積分裝進(jìn)入微孔平板(例如，NuncTM 96 MicrowellTM平板)。隨后在完全培養(yǎng)基中將所述各個(gè)孔生長(zhǎng)至最佳匯合度，在此基礎(chǔ)上將所述培養(yǎng)基置換為無(wú)血清培養(yǎng)基。在此時(shí)刻對(duì)照是未處理的，但是實(shí)驗(yàn)組孔被與調(diào)節(jié)劑進(jìn)行孵育，如EGF。與所述調(diào)節(jié)劑進(jìn)行孵育之后，細(xì)胞被固定并且使用針對(duì)受測(cè)激活元件的經(jīng)標(biāo)記抗體進(jìn)行染色。一旦所述細(xì)胞經(jīng)過(guò)標(biāo)記，使用諸如Odyssey Imager(LiCor, Lincoln Nebr.)這樣的成像儀對(duì)所述平板進(jìn)行掃描，該掃描使用Odyssey Operator' s Manual vl. 2中所描述的エ藝進(jìn)行，其全文以引用的形式并入本文。通過(guò)對(duì)所述多孔平板的掃描而獲取的數(shù)據(jù)可被分析并且根據(jù)下文所述測(cè)定激活特征。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)定通過(guò)高壓液相色譜(HPLC)進(jìn)行，如反相HPLC，并且在另ー個(gè)的方面中，所述檢測(cè)通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行。這些設(shè)備可安裝于無(wú)菌操作臺(tái)或通風(fēng)櫥中，或包裝入自含式系統(tǒng)之中，以用于細(xì)胞在多孔平板或試管中的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化或用于危險(xiǎn)操作。所述或細(xì)胞可在受控生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)，該生長(zhǎng)條件具有溫度、濕度和氣體控制以用于時(shí)間系列的活細(xì)胞分析。細(xì)胞的自動(dòng)化轉(zhuǎn)化和自動(dòng)化克隆挑取設(shè)備可輔助所需細(xì)胞的快速篩選。流式細(xì)胞儀或毛細(xì)管電泳配備可被用于磁性和其他微珠、顆粒、細(xì)胞和生物體的個(gè)體捕獲。具備可變性的硬件和軟件實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種用途的設(shè)備適應(yīng)性。軟件程序模塊實(shí)現(xiàn)了方法的創(chuàng)建、修改和運(yùn)行。系統(tǒng)診斷模塊實(shí)現(xiàn)了設(shè)備的調(diào)試、校正鏈接和運(yùn)動(dòng)操作。定制エ具、實(shí)驗(yàn)器材以及液體、顆粒、細(xì)胞和生物體轉(zhuǎn)移模式使得多種應(yīng)用可被實(shí)施。數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)現(xiàn)了方法和參量的存儲(chǔ)。機(jī)器人和計(jì)算機(jī)界面實(shí)現(xiàn)了設(shè)備間的通訊。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使用液體操作組件。所述液體操作系統(tǒng)可包含機(jī)器人系統(tǒng)，其包含任意數(shù)量的組件。另外，本文所述的任意或所有步驟可被自動(dòng)化進(jìn)行，因此，例如，所述系統(tǒng)可被完全或部分自動(dòng)化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員所應(yīng)了解的是，存在廣泛多種的組件可被使用，其包括但不限于，一種或更多種機(jī)器人手臂；用于微平板定位的平板操作器(Plate handler);用于取下非交叉污染平板的板蓋或?qū)⑵鋸?fù)位的自動(dòng)化板蓋或板帽操作器；用于使用可拋式吸頭進(jìn)行樣品分裝的吸頭裝配器；用于樣品分裝的可洗式吸頭裝配器；96孔裝樣模塊；經(jīng)冷卻的試劑架；微滴度平板微移液吸頭位(可選地經(jīng)冷卻)；用于平板和吸頭的堆疊塔；以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。參見美國(guó)專利申請(qǐng)書第61/048，657號(hào)，其全文以引用的方式并入本文。完全的機(jī)器人化或微流控系統(tǒng)包括自動(dòng)化液體_、顆粒_、細(xì)胞_、或生物體-操作，其包括高通量的微移液(pipetting)以實(shí)施篩選應(yīng)用的所有步驟。這包括液體、顆粒、細(xì)胞和生物體操作，如微移液吸頭的吸取、懸浮、混合、稀釋、清洗、精確體積轉(zhuǎn)移、回收和拋棄；以及等體積的重復(fù)性移液以用于從單樣品吸取物中進(jìn)行多次遞送。這些操作是無(wú)交叉污染的液體、顆粒、細(xì)胞和生物體轉(zhuǎn)移。該設(shè)備實(shí)施將微平板向?yàn)V膜、薄膜和/或下級(jí)平板(daughter plates)的自動(dòng)化復(fù)制,高密度轉(zhuǎn)移、全平板系列稀釋以及高體積操作。在一些實(shí)施方案中，使用了對(duì)所述分析組分具有特異性的化學(xué)衍生的顆粒、平板、卡盒、試管、磁性顆粒或其他固相介質(zhì)。微平板、試管或任意固相介質(zhì)的結(jié)合表面包括非極性表面、高度極性表面、以經(jīng)修飾葡聚糖包埋以促進(jìn)共價(jià)結(jié)合、抗體包埋、親和介質(zhì)以結(jié)合融合蛋白質(zhì)或肽、固定于表面的蛋白質(zhì)如重組蛋白質(zhì)A或G、核苷酸樹脂或包衣，以及本發(fā)明可用的其他親和性介質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，用于多孔平板、多試管、固定器、卡盒、微管、深孔平板、微離心管、冷凍瓶、方孔平板、濾膜、芯片、光線、微珠和其他固相介質(zhì)的平臺(tái)或具有多種體積的平臺(tái)被容納于可升級(jí)的模塊平臺(tái)之中以用于額外的容積。該模塊平臺(tái)包括變速軌道振蕩器，以及用于源樣品、樣品和試劑稀釋物的多位工作平臺(tái)、分析平板、樣品和試劑儲(chǔ)池、微移液吸頭以及活動(dòng)的洗滌站。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使用使用酶標(biāo)儀(Platereader)。參見美國(guó)專利申請(qǐng)書第048，657號(hào)。在一些實(shí)施方案中，熱循環(huán)儀和熱控系統(tǒng)被用于穩(wěn)定諸如受控模塊或平臺(tái)這樣的熱交換設(shè)施的溫度以提供對(duì)樣品孵育在0°c到100°C之間的精確溫控。在一些實(shí)施方案中，具有單或多磁性探針、親和探針或微量移液器的可交換的微移液接頭(單通道或多通道)對(duì)所述液體、顆粒、細(xì)胞和生物體進(jìn)行機(jī)器人化地操控。多孔或多管磁性分離器或平臺(tái)以單樣品或多樣品的形式操控液體、顆粒、細(xì)胞或生物體。在一些實(shí)施方案中，所述儀器設(shè)備應(yīng)包括檢測(cè)器，其可以是廣泛多種的不同檢測(cè)器，這取決于所述標(biāo)記物和分析方法。在一些實(shí)施方案中，可用的檢測(cè)器包括具有多通道熒光的顯微鏡；提供具備單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)終點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)能力的熒光、紫外和可見光分光光譜檢測(cè)的、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、發(fā)光、淬滅、雙光子激發(fā)和密度再分布的酶標(biāo)儀；CCD照相機(jī)以捕獲和將數(shù)據(jù)和圖像轉(zhuǎn)化成為可定量形式；以及計(jì)算機(jī)工作站。
在一些實(shí)施方案中，所述機(jī)器人設(shè)施包含中央處理器，其通過(guò)總線與內(nèi)存和ー組輸入/輸出設(shè)備(如鍵盤、鼠標(biāo)、顯示器、打印機(jī)等)進(jìn)行通訊。再一次，如下文所述，其可以添加于本發(fā)明的復(fù)合設(shè)備的CPU之上或?qū)ζ涮娲?。中央處理器、?nèi)存、輸入輸出設(shè)備以及總線之間的基本相互作用在本領(lǐng)域中是已知的。因此，根據(jù)準(zhǔn)備運(yùn)行的實(shí)驗(yàn)，多種不同的程序方法可存儲(chǔ)于 所述CPU內(nèi)存之中。參見美國(guó)專利申請(qǐng)書第61/048，657號(hào)，其全文以引用的方式并入本文。這些機(jī)器人液體操作系統(tǒng)可利用任意數(shù)量的不同試劑，包括緩沖液、試劑、樣品、清洗液、分析組分如標(biāo)記物探針等。可通過(guò)計(jì)算機(jī)程序?qū)嵤┥鲜鋈魏尾襟E，所述程序包含存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的計(jì)算機(jī)可執(zhí)行邏輯。例如，所述計(jì)算機(jī)程序可執(zhí)行以下功能的數(shù)種或全部(i)將不同的細(xì)胞群體暴露于ー種或更多種調(diào)節(jié)劑、(ii)將不同的細(xì)胞群體暴露于ー種或更多種結(jié)合元件、(iii)檢測(cè)ー種或更多種可激活元件的激活水平、以及(iv)根據(jù)所述不同群體中的一種或更多種可激活元件的激活水平作出診斷或預(yù)后。所述計(jì)算機(jī)可執(zhí)行邏輯可在任何計(jì)算機(jī)中工作，其可以示各種任意類型的通用計(jì)算機(jī)，如個(gè)人計(jì)算機(jī)、網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器、工作站或現(xiàn)今或以后開發(fā)出的其他計(jì)算機(jī)平臺(tái)。在ー些實(shí)施方案中，描述了包含計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)在內(nèi)的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，所述介質(zhì)包含存儲(chǔ)于其中的所述計(jì)算機(jī)可執(zhí)行邏輯(計(jì)算機(jī)軟件程序，包括程序代碼)。所述計(jì)算機(jī)可執(zhí)行邏輯可被處理器執(zhí)行，使得所述處理器得以實(shí)施本文所述的功能。在其他的實(shí)施方案中，某些功能主要在硬件使用中發(fā)揮輔助作用，例如硬件狀態(tài)機(jī)的使用。對(duì)所述硬件狀態(tài)機(jī)進(jìn)行的用以實(shí)施本文所述的功能的輔助對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員是很明了的。所述程序可提供測(cè)定個(gè)體狀態(tài)的方法，其通過(guò)獲取反映了參比細(xì)胞群體中的ー種或更多種可激活元件的激活水平的數(shù)據(jù)而進(jìn)行。病狀本發(fā)明的方法可應(yīng)用于個(gè)體中的任意病狀，所述病狀部分地或完全地涉及細(xì)胞中的變化生理狀態(tài)，由該變化生理狀態(tài)顯示和/或由其產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“生理狀態(tài)”包括細(xì)胞的機(jī)械性、物理性和生物化學(xué)功能。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)來(lái)自不同群體(如，不同細(xì)胞網(wǎng)絡(luò))的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞途徑的至少ー種細(xì)胞組分的特征進(jìn)行測(cè)量來(lái)測(cè)定細(xì)胞的生理狀態(tài)。細(xì)胞途徑在本領(lǐng)域中為人所熟知。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞途徑是信號(hào)傳導(dǎo)途徑。細(xì)胞途徑在本領(lǐng)域中也是為人所熟知的(例如，參見Hunter T.，Cell 100(1) :113-27頁(yè)(2000年)；Cell Signaling Technology, Inc. ,2002 年目錄,Pathway Diagrams 第 232-253 頁(yè)；Weinberg, The biology of Cancer,第 6 章，2007年；以及 Blume-Jensen 和 Hunter, Nature,卷411，2001年5月17日，第355-365頁(yè))。涉及或特征在于改變的生理狀態(tài)的病狀可被容易地辨識(shí)，例如，根據(jù)本文指導(dǎo)通過(guò)測(cè)定來(lái)自不同細(xì)胞群體的細(xì)胞中的一種或更多種可激活元件的狀態(tài)而進(jìn)行。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所述病狀是腫瘤、免疫性或造血機(jī)能的病狀。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤、免疫性或造血機(jī)能的病狀選自實(shí)體瘤，諸如包括腦部在內(nèi)的頭部和頸部癌癥、甲狀腺癌、乳腺癌、肺癌、間皮瘤、生殖細(xì)胞瘤、卵巣癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、膀胱癌、腎癌、前列腺癌、睪丸癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、肌肉瘤、平滑肌肉瘤及其他軟組織肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、腎母細(xì)胞瘤、和神經(jīng)母細(xì)胞瘤，敗血癥、過(guò)敏性疾病和障礙，包括但不限于過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎、過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性濕疹、過(guò)敏性皮炎以及食物過(guò)敏，免疫缺陷、包括但不限于重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)、高嗜酸性粒細(xì)胞增多綜合征、慢性肉芽腫病、I和II型白細(xì)胞粘附缺陷、高IgE綜合征、契-東綜合征、中性粒細(xì)胞增多癥、嗜中性白血球低下、成形不完全、丙種球蛋白血癥、高IgM綜合征、DiGeorge/Velocardial面部綜合征和干擾素Y -Thl途徑缺陷，自體免疫性疾病和免疫功能失調(diào)疾病、包括但不限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Grave氏病、Graves眼病、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、系統(tǒng)性硬化癥、甲狀腺腫大和甲狀腺腫(橋本氏甲狀腺炎、淋巴細(xì)胞性甲狀腺腫)、斑禿、自體免疫性心肌炎、硬化萎縮苔蘚、自體免疫性葡萄膜炎、阿狄森氏病、萎縮性胃炎、重癥肌無(wú)力、特發(fā)性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、原發(fā)性膽汁性肝硬化、韋格納肉芽腫、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、和發(fā)炎性腸道疾病、移植排斥反應(yīng)和緣于對(duì)傳染性微生物或環(huán)境抗原的過(guò)敏反應(yīng)的組織破壞，以及造血機(jī)能病狀，包括但不限于非霍奇金淋巴瘤淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或其他淋巴瘤、急性或慢性白血病、紅血球增多、血小板增多、多發(fā)性骨髓瘤或漿細(xì)胞疾病，如淀粉樣變和Waldenstoom氏巨球蛋白血癥、骨髄增生異常疾病、骨髓增生性疾病、骨髓纖維化、或非典型免疫性淋巴細(xì)胞增生。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤或造血機(jī)能病狀是非B細(xì)胞系來(lái)源的，例如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、非B細(xì)胞淋巴瘤、骨髄增生異常、骨髓增殖失調(diào)、骨髄纖維變性、紅血球增多、血小板增多或非B細(xì)胞非典型性免疫性淋巴細(xì)胞增生、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、B淋巴細(xì)胞系白血病、B淋巴細(xì)胞系淋巴瘤、多發(fā)性骨髄瘤或漿細(xì)胞失調(diào)如淀粉樣變或Waldenstoom氏巨球蛋白血癥。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤或造血機(jī)能病狀是非B細(xì)胞系來(lái)源的。非B細(xì)胞系來(lái)源的腫瘤或造血機(jī)能病狀的實(shí)例包括但不限于急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、非B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、非B細(xì)胞淋巴瘤、骨髓增生異常、骨髓増殖失調(diào)、骨髄纖維變性、紅血球增多、血小板增多和非B細(xì)胞非典型性免疫性淋巴細(xì)胞增生。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤或造血機(jī)能病狀是B細(xì)胞來(lái)源的失調(diào)或B細(xì)胞系來(lái)源的失調(diào)。B細(xì)胞來(lái)源的或B細(xì)胞系來(lái)源的腫瘤或造血機(jī)能病狀的實(shí)例包括但不限于慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、B淋巴細(xì)胞系白血病、B淋巴細(xì)胞系淋巴瘤、多發(fā)性骨髄瘤和漿細(xì)胞失調(diào)，其包括淀粉樣變和Waldenstrom氏巨球蛋白血癥。本發(fā)明范圍內(nèi)的其他病狀包括但不限于，癌癥如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌。針對(duì)多種癌癥已經(jīng)描述了特定信號(hào)傳導(dǎo)途徑的變化，其包括前列腺癌中的PTEN的缺失以及所導(dǎo)致的Akt信號(hào)傳導(dǎo)的激活(Whang Y E. Proc Natl Acad Sci USA 1998年4月28日；95(9) :5246-50頁(yè))，前列腺癌中的IGF-I的增強(qiáng)表達(dá)(Schaefer等人，ScienceOctober 9 1998年，282 :199a)，神經(jīng)膠質(zhì)癌中的EGFR過(guò)表達(dá)以及所導(dǎo)致的ERK激活(Thomas C Y. Int J Cancer 2003 年 3 月 10 日；104(1) : 19-27 頁(yè))，乳腺癌中的 HER2 的表達(dá)(Menard 等人，Oncogene. 2003 年 9 月 29，22 (42) :6570-8 頁(yè))，以及結(jié)腸癌中的 APC 突變和激活的 fct 信號(hào)途徑(Bienz M. Curr Opin Genet Dev 1999 年 10 月，9 (5) :595-603頁(yè))。 涉及改變的生理狀態(tài)的非癌癥疾病也被本發(fā)明所涵蓋。例如，已經(jīng)表明糖尿病涉及其所基于的信號(hào)傳導(dǎo)變化，即，對(duì)胰島素的抗性以及對(duì)通過(guò)IRS的下游信號(hào)傳導(dǎo)激活的失靈(Burks D J, White M F. Diabetes，2001 年 2 月；50, Suppl I :S140_5 頁(yè))。類似地，心血管疾病已被表明涉及到心臟細(xì)胞肥大，其涉及諸如PKC家族這樣的多種途徑(MalhotraA.Mol Cell Biochem 2001年9月;225(1_) :97-107頁(yè))。已知諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎這樣的炎癥涉及趨化因子受體以及紊亂的下游信號(hào)傳導(dǎo)(D' Ambrosio D. J Immunol Methods2003年2月；273(1-2) :3_13頁(yè))并且也被本發(fā)明所涵蓋。移植排斥、感染(如病毒或細(xì)菌感染)以及疫苗狀態(tài)響應(yīng)(vaccines state responses)也被本發(fā)明所涵蓋?？杀槐疚乃龅姆椒ㄋ鶞y(cè)量的疫苗狀態(tài)響應(yīng)的實(shí)例被描述于美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/327，347號(hào)，出于所有目的其全文以引用的形式并入本文。本發(fā)明并不限于目前已知的涉及改變的細(xì)胞功能的疾病，而且包括今后被證明涉及生理變化或異常的疾病。試劑盒
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒可包含ー種或更多種本文所述的狀態(tài)特異性結(jié)合元件，諸如磷酸化特異性抗體。試劑盒可包括其他有用于本發(fā)明的試劑，諸如調(diào)節(jié)劑、固定劑、容器、平板、緩沖液、治療劑、說(shuō)明書等。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含一種或更多種磷酸化特異性抗體，其特異于選自下列的蛋白質(zhì):PI3_ 激酶(p85、pllOa、pllOb、pllOd)、Jakl、Jak2、SOC、Rac、Rho、Cdc42、Ras-GAP、Vav、Tiam、Sos、Dbl、Nek、Gab、PRK、SHPl、and SHP2、SHIPl、SHIP2、sSHIP、PTEN、She、Grb2、PDKU SGK, Akt I、Akt2、Akt3、TSCl 和 2、Rheb、mTor、4EBP-1、p70S6 激酶、S6、LKB-1、AMPK, PFK,こ酰輔酶 A 羧化酶、DokS、Rafs, Mos, Tpl2、MEK1/2、MLK3、TAK, DLK,MKK3/6、MEKK1、4、MLK3、ASK1、MKK4/7、SAPK/JNKI, 2, 3、p38s、Erkl/2、Syk、Btk、BLNK、LAT、ZAP70、Lck、Cbl、SLP-76、PLC y U PLCy 2, STATl、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、FAK、pl30CAS、PAKs、UMKl/2、Hsp90、Hsp70、Hsp27、SMADs、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、組蛋白 H2B、HATs, HDACs, PKR、Rb、細(xì)胞周期蛋白D、細(xì)胞周期蛋白E、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B、P16、pl4Arf、p27KIP、p21CIP、Cdk4、Cdk6、Cdk7、Cdkl、Cdk2、Cdk9、Cdc25、A/B/C、Abl、E2F、FADD, TRADD、TRAF2、RIP、Myd88、BAD、Bcl-2, Mcl_l、Bcl-XL、胱天蛋白酶 2、胱天蛋白酶 3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、IAP> Smac、胞襯蛋白、肌動(dòng)蛋白、Src, Lyn, Fyn、Lck、NIK、I k B、p65 (RelA)、IKK a、PKA, PKC a、PKC P、PKC 0、PKC 8、CAMK、Elk、AFT、Myc, Egr-U NFAT、ATF-2, Mdm2、p53、DNA-PK, Chkl、Chk2、ATM、ATR、^ 聯(lián)蛋白、CrkL、GSK3 a、GSK3 P以及F0X0。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含一種或更多種磷酸化特異性抗體，其特異于選自下列的蛋白質(zhì)Erk、Syk、Zap70、Lck、Btk、BLNK、Cbl、PLC Y 2、Akt、RelA、p38、S6。在一些實(shí)施方案中,所述試劑盒包含一種或更多種磷酸化特異性抗體，其特異于選自下列的蛋白質(zhì)Aktl、Akt2、Akt3、SAPK/JNKl，2，3、p38s、Erkl/2、Syk、ZAP70、Btk、BLNK、Lck、PLC y ,PLCy 2, STATl、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、CREB、Lyn、p_S6、Cbl、NF-k B、GSK3P、CARMA/BcllO 以及 Tcl-I0本發(fā)明的狀態(tài)特異性元件可被直接地或間接地偶聯(lián)于固相支持物以及偶聯(lián)于可檢測(cè)基團(tuán)。所述試劑還可包含輔助劑，諸如緩沖劑和穩(wěn)定劑，如多聚糖等。在必要的情況下，所述試劑盒可進(jìn)一歩包含所述可檢測(cè)基團(tuán)所屬的信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)的其他成員(例如，酶底物)、用于在測(cè)試中減低背景干擾的試劑，對(duì)照試劑、實(shí)施測(cè)試的儀器等。所述試劑盒可以任何適當(dāng)?shù)男问桨b，一般所有組件與用以實(shí)施該測(cè)試的打印說(shuō)明頁(yè)包裝于同一容器內(nèi)。
這樣的試劑盒允許通過(guò)諸如IHC和流式細(xì)胞儀這樣的敏感性細(xì)胞分析方法對(duì)可激活元件的檢測(cè)，其適用于臨床檢測(cè)、預(yù)后以及對(duì)來(lái)自患有涉及變化的途徑信號(hào)傳導(dǎo)的患者的細(xì)胞和組織的篩選，如白血病患者。這些試劑盒可另外包含ー種或更多種治療劑。所述試劑盒可進(jìn)一歩包含用于對(duì)生理狀態(tài)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的軟件包，該軟件包可包含參比特征以用于測(cè)試特征的對(duì)比。這些試劑盒還可包含信息，諸如科技文獻(xiàn)參考、包裝插頁(yè)材料、臨床試驗(yàn)結(jié)果、和/或這些資料的概要等，其表明或介紹所述組合物的活性和/或優(yōu)點(diǎn)，并且/或者其描述了劑量、施用、副作用、藥物相互作用或其他對(duì)醫(yī)療保健人員有用的信息。這些信息可基于多種研究的結(jié)果，例如，使用涉及體內(nèi)模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行的研究和基于人類臨床 試驗(yàn)的研究。本文所述的試劑盒可向醫(yī)療保健人員供應(yīng)、銷售和/或推廣，該醫(yī)療保健人員包括醫(yī)師、護(hù)士、藥劑師、處方官員(formulary officials)等。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還可直接對(duì)消費(fèi)者進(jìn)行銷售。
實(shí)施例實(shí)施例I :AML患者的分析患者樣品可對(duì)來(lái)自患者的成組新鮮樣品或凍存樣品進(jìn)行分析。所述組由來(lái)自AML患者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)樣品或骨髓單核細(xì)胞(BMMC)樣品組成。所有患者應(yīng)被征詢以同意進(jìn)行采集以及將其樣品被用于經(jīng)倫理審查委員會(huì)(IRB)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。所有臨床數(shù)據(jù)被匿名化(de-identified)以遵循健康保險(xiǎn)便利和責(zé)任法案(HIPAA)的規(guī)定。樣品納入標(biāo)準(zhǔn)可要求在起始誘導(dǎo)化療之前的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采集，根據(jù)法-美-英分類器(FAB)標(biāo)準(zhǔn)將AML分類為MO至M7 (M3除外)，以及適當(dāng)臨床評(píng)注的可用(例如，一輪或ニ輪誘導(dǎo)化療后的疾病響應(yīng))。誘導(dǎo)化療可由至少ー輪標(biāo)準(zhǔn)的基于阿糖胞苷的誘導(dǎo)治療組成(即，柔紅霉素60mg/m2X3天，阿糖胞苷100-200mg/m2連續(xù)灌注X7天)；在一輪誘導(dǎo)治療后測(cè)量響應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)可被用于定乂患者樣品中的完全響應(yīng)(CR)。猶自患者的不符合CR標(biāo)準(zhǔn)的白血病樣品以及或者獲自在誘導(dǎo)治療期間死亡的患者的樣品被認(rèn)為對(duì)于原始分析是不完全響應(yīng)(NR)。細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)特征分析細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)特征分析涉及在處于基線的以及受到多種調(diào)節(jié)劑擾動(dòng)后的不同細(xì)胞群體中測(cè)量蛋白質(zhì)水平的表達(dá)以及它們的翻譯后的磷酸化修飾?？杀环治龅娜后w包括骨髓白血病細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。也可分析諸如內(nèi)皮細(xì)胞這樣的其他細(xì)胞。途徑的“節(jié)點(diǎn)”被定義為在存在或缺乏特定治療劑的情況下的特定蛋白質(zhì)組讀出值的組合。信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)水平以及細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)(包括細(xì)胞系標(biāo)記物、膜受體和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體)通過(guò)多參量流式細(xì)胞儀使用針對(duì)所述靶蛋白的熒光團(tuán)偶聯(lián)的抗體進(jìn)行檢測(cè)。使用多種調(diào)節(jié)劑的多節(jié)點(diǎn)(包括表面受體和轉(zhuǎn)運(yùn)體)可在所述兩種研究中進(jìn)行估測(cè)。對(duì)于將每ー患者樣品歸類為可估測(cè)的，最低要使用100，000個(gè)活細(xì)胞并且在目的控門中為每被門控樣品500個(gè)細(xì)胞。在PBS，10% FBS和2mM EDTA中將凍存細(xì)胞在37°C解凍、清洗并離心。所述細(xì)胞在RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基，I % FBS中被重懸浮、過(guò)濾并且清洗，并且隨后使用Live/Dead FixableAqua Viability Dye (Invitrogen, Carlsbad, CA)進(jìn)行染色以區(qū)分無(wú)活力細(xì)胞。所述活力細(xì)胞被重懸浮于RPMI，I % FBS中，分裝成為100，000個(gè)細(xì)胞/條件，并且在進(jìn)行基于細(xì)胞的功能分析或?qū)Ρ硇蜆?biāo)記物染色之前在37°C靜置1-2小吋。各條件可包含2至5種表型標(biāo)記物(如⑶45、⑶33)，最多達(dá)3種細(xì)胞內(nèi)染色或者最多達(dá)3種另外的表面標(biāo)記物。在37°C將細(xì)胞與調(diào)節(jié)劑孵育3-15分鐘，隨后在37°C使用I. 6%的多聚甲醛(終濃度)進(jìn)行10分鐘固定離心并且使用100%的冰冷甲醇進(jìn)行增透化并保存于-20°c。對(duì)于功能性凋亡分析，將細(xì)胞與細(xì)胞毒性藥物(即，依托泊苷、Ara-C和柔紅霉素)進(jìn)行24小時(shí)孵育，隨后在固定和增透紙之前使用 Live/Dead Fixable Aqua Viability Dye (Invitrogen,Carlsbad, CA)進(jìn)行再染色以區(qū)分無(wú)活力細(xì)胞，使用FACS緩沖液(PBS，0. 5% BSA,0. 05%NaN3)清洗、離心并且使用偶聯(lián)于熒光染料的針對(duì)表面抗原(CD33、CD45)和所述信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)革巴的抗體(Becton Dickenson-Pharmingen, San Diego, California)進(jìn)行染色。數(shù)據(jù)獲取和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析使用FACS DIVA軟件在LSR II和CANTO II流式細(xì)胞儀(BD)上獲取數(shù)據(jù)。對(duì)于所有分析，根據(jù)FSC(前向角散射)、SSC(側(cè)向角散射)和AmineAqua Viability Dye測(cè)量來(lái)排除死亡細(xì)胞和碎片。白血病細(xì)胞被辨識(shí)為缺乏成熟淋巴細(xì) 胞(⑶45++、⑶33-)特征的細(xì)胞以及符合與骨髓白血病細(xì)胞一致的⑶45和⑶33對(duì)應(yīng)直角光散射特征的細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)記物辨識(shí)其他細(xì)胞群體。統(tǒng).計(jì)分析和分層節(jié)點(diǎn)選擇(stratifying node selection)a)度量:對(duì)處于目的控門的細(xì)胞強(qiáng)度水平的各個(gè)節(jié)點(diǎn)的中位熒光強(qiáng)度(MFI)進(jìn)行計(jì)算。所述MFI值隨后通過(guò)將其與多種基線或背景值(即未刺激條件、自體熒光和同位素對(duì)照)進(jìn)行比較而被用于計(jì)算多種度量。在這些研究中被計(jì)算的是下列度量掃描(I)基礎(chǔ)MFI =log2 (MFI未調(diào)控經(jīng)染色)-log2(MFI門控未染色(自發(fā)熒光))，被設(shè)計(jì)用于測(cè)量特定蛋白質(zhì)在未調(diào)控條件下的基礎(chǔ)水平；(2)變化倍數(shù)MFI = log2 (MFI經(jīng)調(diào)控經(jīng)染色)-log2 (MFI未調(diào)控經(jīng)染色)，是對(duì)處于調(diào)控條件下的蛋白質(zhì)的激活狀態(tài)的變化的測(cè)量；(3)總磷酸化MFI=log2(MFI經(jīng)調(diào)控經(jīng)染色)-log2(MFI門控未染色(自發(fā)熒光))，處于調(diào)控條件下的蛋白質(zhì)的總體水平；⑷超對(duì)照倍數(shù)MFI = log2 (MFI染色)-log2 (MFI對(duì)照)，相對(duì)于對(duì)照抗體染色的表面標(biāo)記物染色水平；(5)陽(yáng)性細(xì)胞百分比=具有的表面標(biāo)記物染色的強(qiáng)度水平超過(guò)對(duì)照抗體染色的95%的細(xì)胞頻度的度量。ー種另外的度量被設(shè)計(jì)用于測(cè)量響應(yīng)于細(xì)胞毒性藥物的細(xì)胞凋亡(6)象限(Quadrant)=表達(dá)高水平凋亡分子(如，經(jīng)切割PARP和低水平的p_Chk2)的細(xì)胞百分比度量。低信號(hào)傳導(dǎo)節(jié)點(diǎn)被定義為具有等于I log2 (倍數(shù))I >. 15的變化倍數(shù)度量或總磷酸蛋白質(zhì)信號(hào)的節(jié)點(diǎn)。但是，在本研究中使用將其用作排除標(biāo)準(zhǔn)并非必需。b)重現(xiàn)性分析對(duì)于每位可估測(cè)患者獲取了兩種或更多種凍存樣品管或新鮮樣品。所有的樣品管均分別處理以獲取所述分析重現(xiàn)性。對(duì)所述兩個(gè)數(shù)據(jù)組之間的各個(gè)節(jié)點(diǎn)/度量組合進(jìn)行皮爾森和斯皮爾曼秩相關(guān)計(jì)算。c)單變量分析分析以及跨樣品比較所有的細(xì)胞群體/節(jié)點(diǎn)/度量組合的其區(qū)分CR和NR樣品的能力。對(duì)于各個(gè)細(xì)胞群體/節(jié)點(diǎn)/度量組合均進(jìn)行了學(xué)生t檢驗(yàn)和Wilcoxon檢驗(yàn)p值的計(jì)算。另外，還對(duì)受試者工作特征曲線(ROC)下的區(qū)域(Hanley和McNeil, Radiology, 1982年，Hanley 和 McNeil, Radiology, 1983 年，Bewick 等人，Critical Care, 2004 年)進(jìn)行計(jì)算以獲取各個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)于某ー給定度量的診斷精確度。該敏感度(CR被正確辨識(shí)的患者比例)和特異性(NR被正確辨識(shí)的患者比例)數(shù)據(jù)被以ROC曲線的形式進(jìn)行作圖。隨機(jī)結(jié)果將產(chǎn)生0. 5的AUC值。具有100%的特異性和選擇性的(生物)標(biāo)記物應(yīng)產(chǎn)生I. 0的AUC值。所述細(xì)胞群體/節(jié)點(diǎn)/度量組合針對(duì)患者樣品之間的差別被獨(dú)立地進(jìn)行檢驗(yàn)，所述患者樣品對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)治療的響應(yīng)是CR對(duì)NR。對(duì)所述p值不進(jìn)行用于對(duì)多檢驗(yàn)進(jìn)行校正的校正步驟。取而代之的是進(jìn)行了模擬，其通過(guò)對(duì)所述臨床變量進(jìn)行過(guò)隨機(jī)變序以估測(cè)可能偶然具有顯著性的細(xì)胞群體/節(jié)點(diǎn)/度量組合的數(shù)量而進(jìn)行。對(duì)于各個(gè)變序隨機(jī)選擇了九個(gè)供體(無(wú)替換)并且將之指定為CR類別，其余被指定為NR類別。通過(guò)對(duì)將各個(gè)細(xì)胞群體/節(jié)點(diǎn)/度量組合與所述變序臨床變量進(jìn)行比較而計(jì)算了學(xué)生t檢驗(yàn)的p值。對(duì)所述過(guò)程進(jìn)行重復(fù)。來(lái)自這些模擬的結(jié)果隨后被用于在不同P值下對(duì)被預(yù)期偶然具有顯著性的細(xì)胞群體/節(jié)點(diǎn)/度量組合的數(shù)量進(jìn)行估測(cè)，并且與根據(jù)實(shí)際數(shù)據(jù)被發(fā)現(xiàn)具顯著性的細(xì)胞群體/節(jié)點(diǎn)/度量組合的數(shù)量的經(jīng)驗(yàn)P值進(jìn)行比較?？墒褂?. 7. 0版的統(tǒng)計(jì)軟件包R進(jìn)行所述統(tǒng)計(jì)分析。d)節(jié)點(diǎn)間相關(guān)性細(xì)胞群體/節(jié)點(diǎn)/度量組合的所有組對(duì)之間的相關(guān)性通過(guò)計(jì)算皮爾森和斯皮爾曼秩相關(guān)而獲得。e)節(jié)點(diǎn)組合有潛力在組合中互相補(bǔ)充以改善對(duì)治療響應(yīng)的預(yù)測(cè)的精確度的節(jié)點(diǎn)也被進(jìn)行考 察。對(duì)于小量的數(shù)據(jù)組，可調(diào)整使用用于挑選組合的簡(jiǎn)明的“角分類器”手段。顯現(xiàn)前景的組合還受到對(duì)其穩(wěn)定性的檢驗(yàn)，其通過(guò)下文所述的自舉法進(jìn)行。所述角分類器是一種基于規(guī)則的算法，其用于使用ー種或更多種數(shù)字變量(在本研究中定義為節(jié)點(diǎn)/度量組合)將對(duì)象分成兩類(在本情況下是對(duì)于治療的二分應(yīng)答)。本方法通過(guò)對(duì)各變量設(shè)置閾值并且隨后將產(chǎn)生的間隔(如，X < 10或Y > 50)同與(邏輯與)操作(參比)相組合而進(jìn)行。這產(chǎn)生了ー個(gè)矩形區(qū)間，其被預(yù)期涵蓋先前被辨識(shí)為目標(biāo)的類別的多數(shù)成員(在本研究中為CR或NR樣品)。通過(guò)在各類之中根據(jù)評(píng)定轉(zhuǎn)換錯(cuò)誤分類率(logit-transformed misclassification rate)對(duì)誤差標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的最小化而選擇閾值。所述方法假定所述ニ個(gè)類別(即，對(duì)誘導(dǎo)治療有響應(yīng)或無(wú)響應(yīng))傾向于隨所使用的變量而具有不同定位，并且在這些變量的單調(diào)轉(zhuǎn)換下是無(wú)變化的。裝袋算法(bagging)，亦稱為自舉集成法，被用于對(duì)上述統(tǒng)計(jì)模型的結(jié)果進(jìn)行交叉驗(yàn)證。自舉法復(fù)樣本從原始數(shù)據(jù)中抽取。各個(gè)分類器，即，細(xì)胞群體/節(jié)點(diǎn)/度量組合，被用于對(duì)所述復(fù)樣本進(jìn)行擬合并且隨后用于對(duì)被排除于所述復(fù)樣本之外的患者的類別歸屬關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。在充分重復(fù)進(jìn)行所述再取樣操作之后，各個(gè)患者獲得了根據(jù)使用其他患者進(jìn)行擬合的分類器而預(yù)測(cè)的類別歸屬關(guān)系列単。各個(gè)患者的列單被簡(jiǎn)化成為目標(biāo)類別預(yù)測(cè)的分?jǐn)?shù)；所述目標(biāo)類別的成員應(yīng)具有接近I的分?jǐn)?shù)，不同于其他類別的成員。這樣的成組分?jǐn)?shù)，與所述患者的真實(shí)分類歸屬關(guān)系一起被用于創(chuàng)建ROC曲線以及計(jì)算其AUC。實(shí)施例2 :類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的分析患者樣品可對(duì)來(lái)自患者的成組新鮮樣品或凍存樣品講行分析。所述樣品組由來(lái)自類風(fēng)濕患者的淋巴結(jié)、滑膜和/或滑膜液的細(xì)胞樣品組成。所有患者應(yīng)被征詢以同意進(jìn)行采集以及將其樣品被用于經(jīng)倫理審查委員會(huì)(IRB)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。所有臨床數(shù)據(jù)被匿名化(de-identified)以遵循健康保險(xiǎn)便利和責(zé)任法案(HIPAA)的規(guī)定。樣品納入標(biāo)準(zhǔn)可包含(i)根據(jù)1987年ACR標(biāo)準(zhǔn)作出的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷，
(ii)明確的骨侵蝕，(iii)發(fā)病年齡超過(guò)18歲，(iv)患者未患有牛皮癬、炎癥性腸病或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。標(biāo)準(zhǔn)的臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)可被用于定義能夠?qū)颊邩悠分械闹委燀憫?yīng)的RA患者。獲自未滿足患者標(biāo)準(zhǔn)的患者的RA樣品被認(rèn)為 是對(duì)于主分析的未完全響應(yīng)者?？赡艿闹委煹膶?shí)例包括抗炎藥物(NSAID)如こ酰水楊酸(阿司匹林)、萘普生(消痛靈)、布洛芬(Advil、Medipren、Motrin)和依托度酸(Lodine);皮質(zhì)甾類；輕化氯喹；柳氮磺胺卩比唳(Azulfidine);金鹽如葡糖硫金(Solganal)、金硫丁ニ酸鹽(Myochrysine)和金諾芬(瑞得)；D_青霉胺(DeperuCuprimine);免疫抑制藥物如氨甲蝶呤(Rheumatrex、Trexall)、硫唑嘌呤(依木蘭)、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、苯丁酸氮芥(留可然)和環(huán)孢菌素(山地明)?？墒褂脤?shí)施例I中所述的方法進(jìn)行分析的群體包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。也可分析諸如間葉細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞這樣的其他細(xì)胞。盡管本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案已在本文中進(jìn)行演示和描述，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言很明顯這些實(shí)施方案僅以示例性的方式進(jìn)行提供。本領(lǐng)域的技術(shù)人員現(xiàn)應(yīng)考慮到在不脫離本發(fā)明的情況下的大量的變型、變動(dòng)和替換現(xiàn)應(yīng)。應(yīng)當(dāng)了解本文所述的本發(fā)明實(shí)施方案的多種不同的替代方案可被用于實(shí)施本發(fā)明。目的在于，下列權(quán)利要求定義了本發(fā)明的范圍并且這些權(quán)利要求中的方法和結(jié)構(gòu)及它們的等同物因此被涵蓋在內(nèi)。實(shí)施例3 :跨多健康個(gè)體間的全血中細(xì)胞因子JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)的特征分析定義“正?！痹煅?xì)胞中的異常JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)已被證明參與特定的造血和免疫疾病，因此，JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控是重要的研究領(lǐng)域。對(duì)免疫系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中不同細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)途徑特異性響應(yīng)和細(xì)胞類型特異性響應(yīng)可引起廣泛的生物學(xué)結(jié)果，這些結(jié)果由有限組類的激酶和STAT蛋白質(zhì)的組合使用而導(dǎo)致。盡管在掲示有關(guān)細(xì)胞因子信號(hào)途徑的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制中取得了一定進(jìn)展，所述生物學(xué)結(jié)果可根據(jù)所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的組合物和激活狀態(tài)而變換。通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行的單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)特征分析(SCNP)允許對(duì)諸如未分離的全血這樣的異質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的探索。我們應(yīng)用SCNP來(lái)研究在跨健康人供體(n = 11)的全血中細(xì)胞因子誘導(dǎo)的JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)，用以I)測(cè)量跨多個(gè)細(xì)胞亞組的信號(hào)傳導(dǎo)的相對(duì)分布；2)測(cè)量跨細(xì)胞因子和細(xì)胞亞組的信號(hào)傳導(dǎo)激活和解析的動(dòng)力學(xué)；3)在供體中測(cè)量其整體信號(hào)傳導(dǎo)特征的變化程度。我們的目的在于對(duì)跨健康個(gè)體的“正?！奔?xì)胞因子響應(yīng)進(jìn)行特征分析以作為最終描述異常狀態(tài)的基礎(chǔ)。方法根據(jù)實(shí)施例5中的描沭,在37 °C下對(duì)96孔板中的來(lái)自11位健康供體(20_65歲，7位男性，4位女性，8位高加索人種、2位非裔人種、I位東亞人種)的全血中各自分開加入低、中和高劑量的GM-CSF、IFN-a、IL_27和IL-6進(jìn)行刺激。對(duì)各個(gè)劑量，在3到45分鐘內(nèi)以6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行刺激時(shí)程。各孔具有終濃度為90%的全血。使用熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體混合物進(jìn)行所述SCNP分析以在六個(gè)不同細(xì)胞群體中同時(shí)測(cè)量信號(hào)傳導(dǎo)，所述細(xì)胞群體包括嗜中性粒細(xì)胞、⑶20+B細(xì)胞、⑶3+⑶4+T細(xì)胞、⑶3+⑶4-T細(xì)胞(富集⑶8)、⑶3-⑶20-淋巴細(xì)胞(富集NK細(xì)胞)和CD14+單核細(xì)胞。在各個(gè)定義細(xì)胞群體中以各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件測(cè)量磷酸化(P) -STATl (Y701)、p-STAT3 (Y705)和 p_STAT5 (Y694)的中位熒光強(qiáng)度。結(jié)果該SCNP分析具有相對(duì)高通量并且提供了高內(nèi)容數(shù)據(jù)，其相當(dāng)于通過(guò)Western分析進(jìn)行的19，000個(gè)凝膠泳道(11位供體X4種細(xì)胞因子X4終濃度X6個(gè)時(shí)間點(diǎn)X6中細(xì)胞亞組X3中P-讀出值)?？傮w上，對(duì)于各個(gè)經(jīng)分析 細(xì)胞類型各細(xì)胞因子表現(xiàn)出獨(dú)特的劑量依賴的信號(hào)傳導(dǎo)特征(例如，激活/終止動(dòng)力學(xué)、響應(yīng)級(jí)別)，并且在某些情況下，對(duì)于相同細(xì)胞因子相同細(xì)胞亞型內(nèi)的P-STAT讀出值有不同的動(dòng)力學(xué)。例如，IL-6誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)僅僅見于CD4+T細(xì)胞和單核細(xì)胞中，在3分鐘時(shí)出現(xiàn)峰值P-STAT3水平，繼之以在10-15分鐘時(shí)的p-STATl和P-STAT5。另外，單核細(xì)胞內(nèi)信號(hào)解析在45分鐘時(shí)降至基礎(chǔ)水平，而所述CD4+T細(xì)胞表現(xiàn)出持續(xù)升高的信號(hào)傳導(dǎo)，顯示出細(xì)胞類型特異性調(diào)控。與IL-6呈對(duì)比，IFN-a刺激激活了全部3種STAT蛋白質(zhì)，峰值位于10分鐘時(shí)，其在所有細(xì)胞亞組中具有類似的動(dòng)力學(xué)。但是，在單核細(xì)胞中IFN-a信號(hào)傳導(dǎo)解析較快并在45分鐘時(shí)幾乎完全，而在所有其他亞組中所述信號(hào)被維持。單核細(xì)胞中的有效信號(hào)終止也見于GM-CSF — pSTAT5，而嗜中性粒細(xì)胞維持了穩(wěn)定的p_STAT5水平。IL-27在T細(xì)胞亞組、B細(xì)胞和單核細(xì)胞誘導(dǎo)的P-STATl和P-STAT3峰值位于30分鐘時(shí)?？傮w上信號(hào)傳導(dǎo)特征在跨健康個(gè)體中具有顯著的同一性。IL-6 — P-STAT3在跨時(shí)間點(diǎn)和配體濃度下尤為一致，而P-STATl和P-STAT5表現(xiàn)出較高的變化度。實(shí)施例5中提供了更多的結(jié)果。通過(guò)觀察生理?xiàng)l件(全血)下的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)而進(jìn)行的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分析允許對(duì)復(fù)合組織的信號(hào)傳導(dǎo)狀態(tài)的更為全面和臨床相關(guān)的了解。隨著眾多JAK/STAT靶向小分子化合物進(jìn)入臨床，本研究提供了重要的參比點(diǎn)，用于同信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比較，所述信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)或因病理疾病或因治療而具有變化。實(shí)施例4 :對(duì)來(lái)自健康供體的外周血單核細(xì)胞內(nèi)的IFN-a信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行的單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)特征分析(SCNP):疾病特征、治療原則和藥物發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)IFN-a的抗病毒和抗腫瘤效果已被用于治療諸如丙型肝炎(HCV)這樣的病毒感染以及多種惡性腫瘤，如毛細(xì)胞白血病和黑色素瘤。然而，IFN-a對(duì)于這些和其他適應(yīng)癥的廣泛應(yīng)用嚴(yán)重受限于顯著的副作用，其可對(duì)患者的生活質(zhì)量造成重大影響。因此，由IFN-a所調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的更好了解可指導(dǎo)患者的選擇，所述患者所患疾病對(duì)該細(xì)胞因子具有最佳響應(yīng)并具可容忍的副作用。特別地，所述信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活(STAT)的轉(zhuǎn)錄因子已知在轉(zhuǎn)導(dǎo)IFN-a信號(hào)中起關(guān)鍵性作用。單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)特征分析(SCNP)是ー種基于多參量流式細(xì)胞儀的方法，其可被用于在響應(yīng)于外部添加的調(diào)節(jié)劑的個(gè)體細(xì)胞內(nèi)對(duì)細(xì)胞外標(biāo)記物和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)行同時(shí)測(cè)量。在此，我們使用SCNP以在來(lái)自健康供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)內(nèi)的多細(xì)胞亞組中探索信號(hào)傳導(dǎo)途徑。本研究被設(shè)計(jì)用于應(yīng)用SCNP來(lái)在來(lái)自健康供體的PBNC中產(chǎn)生IFN- a介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)響應(yīng)的示圖，其重點(diǎn)在于Stat蛋白質(zhì)。該數(shù)據(jù)提供了參比以用于使用來(lái)自患者樣品的PBMC進(jìn)行的下一歩研究，在所述患者樣品中IFN-a -介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)受到異常調(diào)控。方法通過(guò)SCNP在來(lái)自12位健康供體的PBMC樣品中測(cè)量了 IFN- a -介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)響應(yīng)。通過(guò)固定和增透化并繼之以與偶聯(lián)熒光團(tuán)的抗體進(jìn)行孵育而對(duì)PBMC進(jìn)行針對(duì)流式細(xì)胞儀的加工處理，所述抗體識(shí)別細(xì)胞外細(xì)胞系標(biāo)記物和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分析。根據(jù)實(shí)施例6所述，在暴露于IFN-a之后的15分鐘、1、2、4小時(shí)對(duì)多種細(xì)胞群體(⑶14+單核細(xì)胞、CD20+B細(xì)胞、CD4+CD3+T細(xì)胞和CD4-CD3+T細(xì)胞)中的多種磷酸化蛋白質(zhì)(p-Statl、p_Stat3、p_Stat4、p_Stat5、p_Stat6 和 p-p38)的水平進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果該數(shù)據(jù)揭示了在響應(yīng)于IFN-a暴露的PBMC內(nèi)不同細(xì)胞亞組中的不同磷酸化蛋白質(zhì)激活模式。例如，p_Stat4的激活在T細(xì)胞亞組(⑶4+和⑶4-的T細(xì)胞)中被檢出，但在單核細(xì)胞或B細(xì)胞中未被檢出。這些細(xì)胞類型特異性激活模式可能在響應(yīng)于IFN- a的不同細(xì)胞類型內(nèi)對(duì)特異性功能的介導(dǎo)中起到關(guān)鍵作用。對(duì)于不同的磷酸化蛋白質(zhì)觀察到了由IFN-a激活的動(dòng)力學(xué)上的差異。在本研究所探索的多數(shù)細(xì)胞類型中p-Statl、p_Stat3和P-Stat5的峰值處于15分鐘時(shí)，而對(duì)于多數(shù)受測(cè)細(xì)胞類型中p_Statl4、p_Stat63和p-p38的激活該峰值出現(xiàn)在I小時(shí)處。通過(guò)計(jì)算皮爾森相關(guān)系數(shù)而測(cè)定了該細(xì)胞亞組中的磷酸化蛋白質(zhì)讀出值之間的關(guān)聯(lián)。例如，在B細(xì)胞和T細(xì)胞中p-Statl和p-Stat5在15分鐘時(shí)的激活是正相關(guān)的。實(shí)施例6中提供了更多的結(jié)果。以來(lái)自健康供體的PBMC亞組的Stat轉(zhuǎn)錄因子為重點(diǎn)測(cè)量了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白 質(zhì)的激活。我們分析了 IFN-a信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的磷酸化蛋白質(zhì)的激活狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。來(lái)自健康供體的樣品中的IFN-a信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)提供了網(wǎng)絡(luò)示圖，其可作為參比以用于辨識(shí)IFN-a信號(hào)傳導(dǎo)中的變化，該變化為疾病和/或治療干預(yù)的結(jié)果。使用SCNP對(duì)來(lái)自患有諸如病毒感染或癌癥這樣的疾病的患者的PBMC中的IFN- a信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行特征分析的進(jìn)ー步研究可允許IFN-a劑量的最優(yōu)化以及患者分級(jí)生物標(biāo)記物的辨識(shí)以及新型治療劑的發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例5 :正常細(xì)胞對(duì)促紅細(xì)胞生成素(EPO)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的響應(yīng)通過(guò)與在來(lái)自患有骨髄增生異常綜合征(MDS)的患者亞類的樣品中所觀察到的信號(hào)傳導(dǎo)響應(yīng)進(jìn)行比較而對(duì)正常細(xì)胞對(duì)EPO和G-CSF的響應(yīng)進(jìn)行特征分析，所述患者本文中被稱為“低風(fēng)險(xiǎn)”患者。健康BMMC(來(lái)自無(wú)已知疾病診斷的患者)的15個(gè)樣品和來(lái)自屬于患骨髄增生異常綜合征患者亞類的患者的BMMC的14個(gè)樣品被用于對(duì)正常細(xì)胞響應(yīng)進(jìn)行特征分析。低風(fēng)險(xiǎn)患者的14個(gè)樣品獲自得克薩斯州MD Anderson Cancer Center。所述低風(fēng)險(xiǎn)患者根據(jù)MD Anderson Cancer Center的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理被診斷。健康BMMC的15個(gè)樣品獲自 Williamson Medical Center 以及商業(yè)來(lái)源(AllCells, Emeryville, CA)。獲自Williamson Medical Center的樣品根據(jù)進(jìn)行諸如膝部或髖部置換這樣的手術(shù)的患者的知情同意而采集。所述各正常和低風(fēng)險(xiǎn)樣品被各自単獨(dú)分裝。所述分裝樣品使用3IU/ml濃度的促紅細(xì)胞生成素、50ng/ml濃度的G-CSF和3IU/ml濃度的促紅細(xì)胞生成素以及50ng/ml濃度的G-CSF進(jìn)行處理。使用流式細(xì)胞儀在用所述調(diào)節(jié)劑進(jìn)行處理后15分鐘之時(shí)對(duì)pStatl、pStat3和pStat5的激活水平進(jìn)行測(cè)量。除被測(cè)量的Stat蛋白質(zhì)外，還對(duì)多種其他元件進(jìn)行測(cè)量以根據(jù)細(xì)胞類型將所述細(xì)胞分成分離的群體。這些標(biāo)記物包括CD45、CD34、CD71和CD235ab。CD45被用于分離淋巴細(xì)胞、骨髓(pi)細(xì)胞和nRBC。根據(jù)CD71和CD235ab :ml、m2、m3和m4的表達(dá),所述nRBC被進(jìn)ー步分成為四個(gè)不同的細(xì)胞群體。這些細(xì)胞群體對(duì)應(yīng)RBC的成熟度并且在圖2中顯示。在所述不同的分離的細(xì)胞群體中觀察到了不同的信號(hào)傳導(dǎo)響應(yīng)。圖2顯示了在經(jīng)EPO、G-CSF和EPO+G-CSF處理的淋巴細(xì)胞、nRBCl細(xì)胞、骨髓(pi)細(xì)胞和干細(xì)胞中pStatl、pStat3和pStat5的不同激活水平。在來(lái)自正常和低風(fēng)險(xiǎn)群體的不同樣品中觀察到的激活水平被成點(diǎn)作圖。如圖2所示，不同的分離的細(xì)胞群體顯示了不同的誘導(dǎo)激活水平。盡管這在所述健康和低風(fēng)險(xiǎn)患者中均為事實(shí)，所述不同的分離的細(xì)胞群體在所述正常樣品中表現(xiàn)出比低風(fēng)險(xiǎn)樣品更狹窄的誘導(dǎo)激活水平范圍。這些觀察與患病細(xì)胞表現(xiàn)出比正常細(xì)胞更為廣泛的不同信號(hào)傳導(dǎo)表型的常識(shí)一致。此外，疾病中的細(xì)胞分化被抑制或阻礙，這導(dǎo)致細(xì)胞表現(xiàn)出不同于相同類型的其他細(xì)胞的特征。 實(shí)施例6 :對(duì)于不同濃度的GM-CSF、IL-27、IFN和IL-6的正常細(xì)胞響應(yīng)在正常樣品(即，來(lái)自無(wú)疾病診斷的人)中對(duì)不同濃度的調(diào)節(jié)劑的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)進(jìn)行研究。11個(gè)正常樣品由具備知情同意的Nodality Inc.雇員提供并且在位于South SanFrancisco, CA的Nodality Inc.進(jìn)行加工處理。所述樣品使用在4種不同的濃度下的4種不同的調(diào)節(jié)劑(GM-CSF、IL-27、IFN和IL-6)進(jìn)行處理并且在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量pStatl、pStat3和pStat5的激活水平。在3、5、10、15、30和45分鐘使用基于流式細(xì)胞術(shù)的單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)特征分析對(duì)激活水平進(jìn)行測(cè)量。所述刺激物的濃度表列于下文表I :刺激物濃度
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定個(gè)體狀態(tài)的方法，所述方法包括 a)使來(lái)自所述個(gè)體的第一細(xì)胞群體的第一細(xì)胞至少與第一調(diào)節(jié)劑進(jìn)行接觸； b)使來(lái)自所述個(gè)體的不同的第二細(xì)胞群體的第二細(xì)胞至少與第二調(diào)節(jié)劑進(jìn)行接觸； c)在所述第一細(xì)胞和所述第二細(xì)胞內(nèi)測(cè)定至少一種可激活元件的激活水平； d)為所述個(gè)體創(chuàng)建包含來(lái)自所述第一細(xì)胞的所述可激活元件和來(lái)自所述第二細(xì)胞的所述可激活元件的所述測(cè)定的激活水平的響應(yīng)表單； e)根據(jù)所述響應(yīng)表單確定所述第一細(xì)胞和所述第二細(xì)胞之間的因果關(guān)聯(lián)，其中所述因果關(guān)聯(lián)是細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)的指征； f)對(duì)所述響應(yīng)表單和/或所述細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)應(yīng)用分類器，其中所述分類器包括一組激活水平值，并且其中所述分類器被用于測(cè)定所述響應(yīng)表單和/或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)是否與狀態(tài)相關(guān)聯(lián)；以及 f)辨識(shí)所述個(gè)體的狀態(tài)，其中所述辨識(shí)使用所述分類器根據(jù)所述響應(yīng)表單和/或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)與狀態(tài)之間的所述關(guān)聯(lián)而進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括根據(jù)所述響應(yīng)表單產(chǎn)生分類數(shù)值，其中所述分類數(shù)值明確了所述個(gè)體是否與所述個(gè)體的狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一調(diào)節(jié)劑和所述第二調(diào)節(jié)劑選自生長(zhǎng)因子、絲裂原、細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子調(diào)節(jié)劑、激素、小分子、多核苷酸、抗體、天然化合物、內(nèi)酯、化療劑、免疫調(diào)節(jié)劑、碳水化合物、蛋白酶、離子、活性氧物質(zhì)和放射物。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一調(diào)節(jié)劑與所述第二調(diào)節(jié)劑相同。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述第一細(xì)胞的所述接觸與所述第二細(xì)胞的所述接觸在同一培養(yǎng)物中進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至3所述的方法，其中所述第一調(diào)節(jié)劑不同于所述第二調(diào)節(jié)劑，并且所述第一細(xì)胞的所述接觸與所述第二細(xì)胞的所述接觸在分開的培養(yǎng)物中進(jìn)行。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一細(xì)胞的所述接觸和/或所述第二細(xì)胞的所述接觸在所述第一細(xì)胞和/或第二細(xì)胞從所述個(gè)體中分離之前進(jìn)行。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述激活水平基于選自下列的激活狀態(tài)細(xì)胞外蛋白酶暴露、新異寡聚體形成、糖基化狀態(tài)、磷酸化狀態(tài)、乙?；癄顟B(tài)、甲基化狀態(tài)、生物素化狀態(tài)、谷氨?；癄顟B(tài)、甘氨酰化狀態(tài)、羥基化狀態(tài)、異構(gòu)化狀態(tài)、異戊烯化狀態(tài)、豆蘧?；癄顟B(tài)、脂化狀態(tài)、磷酸泛酰巰基乙胺基化狀態(tài)、硫酸化狀態(tài)、ISG化狀態(tài)、亞硝基化狀態(tài)、棕櫚?；癄顟B(tài)、SUMO化狀態(tài)、泛素化狀態(tài)、類泛素化狀態(tài)、瓜氨酸化狀態(tài)、脫酰胺基狀態(tài)、二硫鍵形成狀態(tài)、蛋白酶水解切割狀態(tài)、轉(zhuǎn)位狀態(tài)、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)中的變化、多蛋白復(fù)合物狀態(tài)、氧化狀態(tài)、多脂質(zhì)復(fù)合物、以及細(xì)胞膜的生化變化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述激活狀態(tài)是磷酸化狀態(tài)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可激活元件選自蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、核酸和代謝物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述可激活元件是具有磷酸化狀態(tài)和/或去磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括在所述第一細(xì)胞和/或所述第二細(xì)胞內(nèi)測(cè)定一種或更多種細(xì)胞表面標(biāo)記物、細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物或其組合的存在與否。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述細(xì)胞表面標(biāo)記物和所述細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物獨(dú)立地選自蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、核酸和代謝物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中對(duì)一種或更多種細(xì)胞表面標(biāo)記物或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物存在與否的所述測(cè)定包括對(duì)所述細(xì)胞表面標(biāo)記物或所述細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的激活和非激活狀態(tài)下的表位的存在與否均進(jìn)行測(cè)定。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述個(gè)體的狀態(tài)基于所述可激活元件的激活水平以及基于所述一種或更多種細(xì)胞表面標(biāo)記物、細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物或其組合的存在與否兩者。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述激活水平通過(guò)一種方法進(jìn)行測(cè)定，該方法包括與特異于所述特定可激活元件的特定激活狀態(tài)的結(jié)合元件相結(jié)合。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述結(jié)合元件包括抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述結(jié)合元件為可識(shí)別標(biāo)記的。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述可識(shí)別標(biāo)記的結(jié)合元件是用可檢測(cè)的標(biāo)記物直接標(biāo)記的。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記物選自放射性同位素、重同位素、熒光劑、FRET標(biāo)記物、酶、微粒和化學(xué)發(fā)光物。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測(cè)定所述激活水平的步驟包括使用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、共聚焦顯微鏡法、免疫組織化學(xué)、免疫電子顯微鏡法、核酸擴(kuò)增、基因陣列、蛋白質(zhì)陣列、質(zhì)譜、膜片鉗技術(shù)、二維凝膠電泳、差示凝膠電泳、基于微球的多元蛋白質(zhì)分析、ELISA以及無(wú)標(biāo)記物細(xì)胞分析，用以在單個(gè)細(xì)胞中測(cè)定一種或更多種細(xì)胞內(nèi)可激活元件的激活水平。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測(cè)定所述激活水平的步驟包括使用流式細(xì)胞術(shù)。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測(cè)定是定量的。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測(cè)定是相對(duì)于對(duì)照值的。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述對(duì)照值被包括在所述響應(yīng)表單之中。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分類器被用于辨識(shí)所述個(gè)體的狀態(tài)，并且其中所述辨識(shí)的AUC值高于O. 6。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述狀態(tài)是病狀的分類、診斷或預(yù)后。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其所述病狀的分類、診斷或預(yù)后中的AUC值高于O. 6。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其所述病狀的分類、診斷或預(yù)后中的P值低于O.05。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其所述病狀的分類、診斷或預(yù)后中的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)高于 80%。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其所述病狀的分類、診斷或預(yù)后中的陰性預(yù)測(cè)值(NPV)高于 80%。
32.根據(jù)權(quán)利要求27至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病狀是免疫性疾病、炎癥、移植排斥、感染、疫苗狀態(tài)響應(yīng)、惡性或增殖性疾病或其組合。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述病狀是惡性疾病。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述惡性疾病是實(shí)體腫瘤或惡性血液病。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述惡性疾病是非B細(xì)胞系來(lái)源的。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述非B細(xì)胞系來(lái)源的惡性疾病選自急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、非B細(xì)胞淋巴瘤、骨髓增生異常、骨髓增殖失調(diào)、骨髓纖維變性、紅血球增多、血小板增多和非B細(xì) 胞非典型性免疫性淋巴細(xì)胞增生。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述非B細(xì)胞系來(lái)源的惡性疾病是AML。
38.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述惡性疾病是B細(xì)胞來(lái)源的失調(diào)或B細(xì)胞系來(lái)源的失調(diào)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述惡性疾病是選自下列的B細(xì)胞來(lái)源的失調(diào)或B細(xì)胞系來(lái)源的失調(diào)慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、B淋巴細(xì)胞系白血病、B淋巴細(xì)胞系淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和漿細(xì)胞失調(diào)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述B細(xì)胞來(lái)源的失調(diào)或B細(xì)胞系來(lái)源的失調(diào)是 CLL。
41.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述狀態(tài)是對(duì)病理前或病理病狀的治療的預(yù)測(cè)性響應(yīng)，或是對(duì)病理前或病理病狀的治療響應(yīng)。
42.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)病理前或病理病狀的治療的響應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中對(duì)治療響應(yīng)所進(jìn)行的預(yù)測(cè)的AUC值高于O.6。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中對(duì)治療響應(yīng)所進(jìn)行的預(yù)測(cè)的P值低于O.05。
45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中對(duì)所述病狀的治療響應(yīng)所進(jìn)行的預(yù)測(cè)的PPV值聞?dòng)?0 。
46.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中對(duì)治療響應(yīng)所進(jìn)行的預(yù)測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值(NPV)聞?dòng)?0 。
47.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)定了所述第一和/或第二細(xì)胞中的多個(gè)細(xì)胞內(nèi)可激活元件的激活水平。
48.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)所述第一細(xì)胞和所述第二細(xì)胞之間的因果關(guān)聯(lián)的測(cè)定。
49.一種計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的方法，其根據(jù)特征對(duì)來(lái)自細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，所述方法包括 提供包括內(nèi)存和處理器的計(jì)算機(jī)； 對(duì)關(guān)聯(lián)于個(gè)體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行辨識(shí)，其中所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)來(lái)自采樣于個(gè)體的至少兩種分離的細(xì)胞群體； 產(chǎn)生分類數(shù)值，其中所述分類數(shù)值明確了所述個(gè)體與一種健康狀態(tài)是否關(guān)聯(lián)，所述健康狀態(tài)響應(yīng)于對(duì)與所述個(gè)體關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)應(yīng)用分類器；其中所述分類器包括一組激活狀態(tài)值，所述激活狀態(tài)值被用于測(cè)定不同的分離的細(xì)胞群體中的細(xì)胞是否與所述狀態(tài)相關(guān)聯(lián)；以及將所述分類數(shù)據(jù)存儲(chǔ)于所述計(jì)算機(jī)的內(nèi)存內(nèi)。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述分類數(shù)值代表以下一種或多種診斷、預(yù)后和對(duì)治療的預(yù)測(cè)性響應(yīng)。
51.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)來(lái)自第三方，并且所述方法進(jìn)一步包括 將所述分類數(shù)據(jù)傳送至所述第三方。
52.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括 根據(jù)可激活元件所關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)的至少第一水平，辨識(shí)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)是否與分離的第一細(xì)胞群體或不同的第二細(xì)胞群體相關(guān)聯(lián)。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中對(duì)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)是否與所述分離的第一細(xì)胞群體或所述不同的第二細(xì)胞群體相關(guān)聯(lián)的辨識(shí)包括根據(jù)所述可激活元件所關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)的至少第一水平對(duì)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行門控。
54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中對(duì)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)是否與所述分離的第一細(xì)胞群體或所述分離的第二細(xì)胞群體相關(guān)聯(lián)的辨識(shí)包含根據(jù)關(guān)聯(lián)于可激活元件的激活狀態(tài)的至少第一水平對(duì)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代分組。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述分離的第一細(xì)胞群體是一種稀有的細(xì)胞群體，并且所述分離的第一細(xì)胞群體被識(shí)別為根據(jù)可激活元件所關(guān)聯(lián)的激活狀態(tài)的至少第一水平響應(yīng)于對(duì)所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)所進(jìn)行的迭代分組。
56.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括產(chǎn)生所述分類器，其基于來(lái)自已知與所述狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的多個(gè)分離的細(xì)胞群體和已知不與所述狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的多個(gè)分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)數(shù)據(jù)。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述激活狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)一步與多個(gè)時(shí)間點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，并且所述分類器的產(chǎn)生進(jìn)一步包括 建立隨不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)的模型，其中所述模型代表所述異源細(xì)胞群體之間隨多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的通訊； 根據(jù)所述模型產(chǎn)生一系列的描述性數(shù)值；以及 根據(jù)所述一系列的描述性數(shù)值產(chǎn)生所述分類器。
58.據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中分類器的產(chǎn)生包括所述分類器的交叉驗(yàn)證。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于測(cè)定個(gè)體內(nèi)多個(gè)分離的細(xì)胞群體的激活狀態(tài)和/或一種或更多種細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)的方法。多個(gè)分離的細(xì)胞群體的狀態(tài)和/或一種或更多種細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)可與病狀的診斷、預(yù)后、治療的選擇和調(diào)整、以及/或者監(jiān)測(cè)相關(guān)。
文檔編號(hào)G06F7/00GK102625932SQ201080047909
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者A·塞薩諾, G·P·諾蘭 申請(qǐng)人:諾達(dá)利蒂公司