專利名稱：Cyp450基因型別數(shù)據(jù)庫及基因分型、酶活性鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，特別涉及一種CYP450的標(biāo)準(zhǔn)基因型別數(shù)據(jù)庫，以及CYP450基因分型方法、酶活性鑒定方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞色素P450簡稱CYP450，目前已經(jīng)從人體中鑒定出了 57種CYP450氧化酶，其中參與藥物代謝主要集中于CYP1、CYP2及CYP3家族，參與代謝目前90%以上的藥物。CYP450在藥物代謝中的重要作用導(dǎo)致CYP450基因多態(tài)性成為影響藥物個體差異的最重要因素之一，其多態(tài)性包括點(diǎn)突變、插入或缺失、整個基因的缺失或復(fù)制，最終導(dǎo)致酶的活性增強(qiáng)、減弱或完全缺失。CYP450多態(tài)性可導(dǎo)致在標(biāo)準(zhǔn)的藥物劑量下可能產(chǎn)生個體嚴(yán)重的副反應(yīng)或不起作用。比如，華法林(warfarin)作為目前的一線口服抗凝藥，其預(yù)防和治療血栓栓塞的作用效果和口服給藥的便利性和經(jīng)濟(jì)性是顯而易見的，但是華法林治療窗口很窄，且給藥各個體差異和種族差異很大，要達(dá)到同樣的作用效果，高低劑量可相差10倍以上。研究表明，這與個體間的CYP2C9的基因多態(tài)性密切相關(guān)。再如，廣泛用于治療乳腺癌和卵巢癌的他莫昔芬(tamoxifen)需要經(jīng)過一系列的CYP450酶類代謝，才最終形成有活性的產(chǎn)物發(fā)揮治療效果，其中CYP2D6的基因型是影響他莫昔芬療效的主要限制因素，其缺陷型可導(dǎo)致無病生存期變短，而CYP2D6強(qiáng)代謝型只需要較小劑量的他莫昔芬即可達(dá)到同樣的效果。越來越多的研究顯示，CYP450基因除了影響藥物代謝外，其基因多態(tài)性與許多疾病的發(fā)生緊密相關(guān)。在先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥中，CYP21B基因缺陷占病因90% -95%左右，CYPlIBl基因突變約占5%，CYP17A1、CYP11A1的缺陷型突變也可導(dǎo)致此疾病的發(fā)生。CYP450在代謝以及疾病發(fā)生中的重要作用，使得CYP450基因多態(tài)性的檢測具有非常重要的社會意義和研究價值。

但是，目前對于CYP450突變檢測的技術(shù)主要集中于單個或幾個P450基因的已知突變；并且，各研究中的突變位點(diǎn)都是相對各自特定的序列而言的，彼此之間缺乏統(tǒng)一衡量比較的標(biāo)準(zhǔn)。另外，現(xiàn)有的CYP450檢測方法對CYP450基因中仍然存在的未知突變位點(diǎn)檢測效率不高；需要對大量樣本進(jìn)行檢測時，耗時長，不能很好的滿足研究和實(shí)踐應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種CYP450基因型別的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫及其構(gòu)建方法，以及基于該數(shù)據(jù)庫的快速檢測CYP450基因型的方法和CYP450酶活性鑒定方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:本發(fā)明公開了一種構(gòu)建CYP450基因標(biāo)準(zhǔn)型別數(shù)據(jù)庫的方法，包括以下步驟:將CYP450基因型別的突變信息對應(yīng)的特定序列與人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，獲得CYP450特定序列與人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列在每個堿基位置上的對應(yīng)關(guān)系；根據(jù)所獲得的對應(yīng)關(guān)系，將CYP450基因型轉(zhuǎn)換成以人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列為參考序列的基因型，獲得CYP450基因的標(biāo)準(zhǔn)化基因型別。優(yōu)選的，CYP450基因包括選自 CYP11A1、CYPlIBU CYP11B2、CYP17A1、CYPlAUCYP1A2、CYPlBU CYP20A1、CYP21A2、CYP24A1、CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1、CYP27A1、CYP27B1、CYP27C1、CYP2A13、CYP2A6、CYP2A7、CYP2B6、CYP2C18、CYP2C19、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP2F1、CYP2J2, CYP2R1、CYP2S1、CYP2U1、CYP2WU CYP39A1、CYP3A4、CYP3A43、CYP3A5、CYP3A7、CYP46A1、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F2、CYP4F22、CYP4F3、CYP4F8、CYP4V2、CYP4X1、CYP4Z1、CYP51A1、CYP5A1、CYP7A1、CYP7B1、CYP8A1、CYP8B1、POR等58個人類CYP450基因的至少一種；進(jìn)一步的，還包括步驟，將CYP450基因定位于人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列上，確定CYP450基因編碼序列的起始位置和終止位置，獲得CYP450基因型別突變信息對應(yīng)的特定序列；優(yōu)選的，所述CYP450基因型別突變信息對應(yīng)的特定序列包含CYP450基因編碼序列的起始位置上游5000bp至編碼序列終止位置下游500bp區(qū)域的DNA片段；優(yōu)選的，所述人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列為hgl9。本發(fā)明另一方面，還公開了采用本發(fā)明的方法構(gòu)建的CYP450基因標(biāo)準(zhǔn)型別數(shù)據(jù)庫。優(yōu)選的，CYP450基因型別標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中，CYP450基因的各標(biāo)準(zhǔn)化基因型別對應(yīng)有酶活性信息；CYP450基因包括以下58個人類CYP450基因的至少一種。表I人類CYP450基因
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建CYP450基因標(biāo)準(zhǔn)型別數(shù)據(jù)庫的方法，其特征在于，包括以下步驟: 將CYP450基因型別的突變信息對應(yīng)的特定序列與人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，獲得CYP450特定序列與人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列在每個喊基位置上的對應(yīng)關(guān)系； 根據(jù)所述的對應(yīng)關(guān)系，將CYP450基因型別轉(zhuǎn)換成以人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列為參考序列的基因型，獲得CYP450基因的標(biāo)準(zhǔn)化基因型別； 其中，任選地，所述 CYP450 基因包括選自 CYPl IAl、CYPl IBl、CYPl 1B2、CYP17A1、CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP20A1、CYP21A2、CYP24A1、CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1、CYP27A1、CYP27B1、CYP27C1、CYP2A13、CYP2A6、CYP2A7、CYP2B6、CYP2C18、CYP2C19、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP2F1、CYP2J2、CYP2R1、CYP2S 1、CYP2U1、CYP2W1、CYP39A1、CYP3A4、CYP3A43、CYP3A5、CYP3A7、CYP46A1、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F2、CYP4F22、CYP4F3、CYP4F8、CYP4V2、CYP4X1、CYP4Z1、CYP51A1、CYP5A1、CYP7A1、CYP7B1、CYP8A1、CYP8B1、POR等58個人類CYP450基因的至少一種； 任選地，進(jìn)一步包括步驟，定位CYP450基因于人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列上，確定CYP450基因編碼序列的起始位置 和終止位置，獲得CYP450基因型別突變信息對應(yīng)的特定序列； 任選地，所述CYP450基因型別突變信息對應(yīng)的特定序列包含CYP450基因編碼序列的起始位置上游5000bp至編碼序列終止位置下游的500bp區(qū)域； 任選地，所述人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列為hgl9。
2.—種CYP450基因標(biāo)準(zhǔn)型別數(shù)據(jù)庫，其特征在于，所述數(shù)據(jù)庫采用權(quán)利要求1所述的方法構(gòu)建。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的CYP450基因型別標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，其特征在于:所述CYP450基因型別標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中，CYP450基因的各標(biāo)準(zhǔn)化基因型別對應(yīng)有酶活性信息； 任選地，所述 CYP450 基因包括選自 CYP11A1、CYPlIBU CYP11B2、CYP17A1、CYPlAUCYP1A2、CYPlBU CYP20A1、CYP21A2、CYP24A1、CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1、CYP27A1、CYP27B1、CYP27C1、CYP2A13、CYP2A6、CYP2A7、CYP2B6、CYP2C18、CYP2C19、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP2F1、CYP2J2, CYP2R1、CYP2S1、CYP2U1、CYP2WU CYP39A1、CYP3A4、CYP3A43、CYP3A5、CYP3A7、CYP46A1、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F2、CYP4F22、CYP4F3、CYP4F8、CYP4V2、CYP4X1、CYP4Z1、CYP51A1、CYP5A1、CYP7A1、CYP7B1、CYP8A1、CYP8B1、POR 基因的至少一種。
4.一種CYP450基因分型的方法，所述方法包括:獲取待測樣本CYP450基因的外顯子序列，采用高通量測序平臺測序并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將分析結(jié)果與權(quán)利要求2所述的CYP450基因標(biāo)準(zhǔn)型別數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，從而得到待測樣本的基因型別。
5.一種CYP450酶活性鑒定方法，所述方法包括:獲取待測樣本CYP450基因的外顯子序列，采用高通量測序平臺測序并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將分析結(jié)果與權(quán)利3所述的CYP450基因標(biāo)準(zhǔn)型別數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，得到待測樣本的基因型別，并根據(jù)基因型別對應(yīng)的酶活信息獲得待測樣本的CYP450酶活性結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述獲取待測樣本CYP450基因外顯子序列的過程包括: A、制備能夠捕獲CYP450基因外顯子序列的芯片，所述芯片上含有與CYP450基因外顯子序列反向互補(bǔ)的寡核苷酸探針；B、用待測樣本的基因組DNA制備序列捕獲文庫，包括將待測樣本基因組DNA打斷為200 500bp大小的片段，進(jìn)行末端處理后擴(kuò)增得到序列捕獲文庫； C、將步驟B制備得到的序列捕獲文庫與步驟A的芯片雜交，從而獲取得到待測樣本的CYP450基因外顯子文庫。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述步驟A中，所述芯片含有能分別與58個人類CYP450基因的所有外顯子序列反向互補(bǔ)的寡核苷酸探針，寡核苷酸探針的長度為55_105bp ； 所述步驟B中，待測樣本基因組DNA打斷為200 300bp大小的片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述步驟B中，末端處理包括進(jìn)行末端修復(fù)形成平末端磷酸化的DNA片段，并在平末端DNA的3’末端加上“A”堿基，并進(jìn)一步連接標(biāo)簽。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述步驟C中，雜交之前將來自多個不同待測樣本的序列捕獲文庫混合后再同時與步驟A的芯片雜交，每個文庫帶有不同的Index堿基序列而相互區(qū)別，所述Index堿基序列長度優(yōu)選為6 8bp。
10.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述測序后的數(shù)據(jù)分析包括 i、過濾去掉影響信 息分析的低質(zhì)量測序序列，ii.以人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列為參考序列，將步驟i得到的序列用比對軟件進(jìn)行比對，比對軟件優(yōu)選用SOAP或BWA ； ii1、選取比對到目標(biāo)區(qū)域的序列進(jìn)行后續(xù)分析，所述目標(biāo)區(qū)域是指CYP450基因外顯子序列所在區(qū)域； iv、數(shù)據(jù)質(zhì)控合格后進(jìn)行變異分析，所述變異分析包括檢測以下中的至少一種:單核苷酸多態(tài)性SNP、插入和刪除INDEL、結(jié)構(gòu)性變異SV、拷貝數(shù)變異CNV。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種構(gòu)建CYP450基因標(biāo)準(zhǔn)型別數(shù)據(jù)庫的方法，包括先將CYP450基因型別的突變信息對應(yīng)的特定序列與人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，獲得其與人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列的對應(yīng)關(guān)系；然后根據(jù)所述對應(yīng)關(guān)系，將CYP450基因型轉(zhuǎn)換成以人類全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列為參考序列的基因型。本發(fā)明還公開了一種由上述方法構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫，以及，基于該數(shù)據(jù)庫的CYP450基因分型和酶活性鑒定方法。本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫方便了CYP450的研究，基因分型方法為CYP450基因分型提供了統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，為疾病或藥物等提供更精確的判斷依據(jù)；能夠有效的對CYP450基因中未知突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測；可實(shí)現(xiàn)同時檢測多達(dá)上百個樣本；覆蓋范圍全面廣泛。
文檔編號G06F19/22GK103198236SQ20121000297
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者劉曉, 徐懷前, 張偉, 蘇政, 王冠 申請人:深圳華大基因科技有限公司, 深圳華大基因研究院