一種脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)研究的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)研究的方法，該方法是基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記輔助的脂質(zhì)組學(xué)，并結(jié)合非靶向的同位素異構(gòu)體篩選。其特征在于，結(jié)合穩(wěn)定同位素標(biāo)記的細(xì)胞、動(dòng)物或人體的實(shí)驗(yàn)，高分辨的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(high?resolution-UHPLC-MS)的脂質(zhì)組學(xué)分析，非靶向的同位素異構(gòu)體篩選，在獲得靜態(tài)脂質(zhì)代謝指紋的同時(shí)，可以捕獲包含其中的動(dòng)態(tài)代謝過(guò)程（如脂質(zhì)分子的合成、轉(zhuǎn)化、分解等過(guò)程）。本發(fā)明具有高度的分子特異性和廣泛的網(wǎng)絡(luò)覆蓋能力，方法重復(fù)、穩(wěn)健、可靠。該方法為深入研究脂質(zhì)代謝開辟了新思路，以期對(duì)生物體系的病理生理過(guò)程、代謝擾動(dòng)獲得更深刻全面的理解。
【專利說(shuō)明】一種脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)研究的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分析化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域，是一種基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記輔助的脂質(zhì)組 學(xué)并結(jié)合非靶向的同位素異構(gòu)體篩選，用于脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)研究的新方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 脂質(zhì)是一類重要的代謝物，除了儲(chǔ)存能量外，是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要組成成分，也是 調(diào)節(jié)各類信號(hào)過(guò)程的關(guān)鍵因子。脂質(zhì)代謝的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。脂質(zhì)組學(xué) (Lipidomics)是研究脂質(zhì)代謝的有力手段。然而大部分的脂質(zhì)組學(xué)組學(xué)只能獲取到"快照 式（snapshot)"的靜態(tài)脂質(zhì)輪廓，無(wú)法對(duì)脂質(zhì)代謝的動(dòng)態(tài)過(guò)程(如合成、轉(zhuǎn)化、降解等）進(jìn)行 深入研究。
[0003] 將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的前體分子引入到實(shí)驗(yàn)體系中，可以捕獲脂質(zhì)代謝動(dòng)態(tài)過(guò) 程。經(jīng)典方法有氣相色譜-同位素比例質(zhì)譜（gas-chromatography-isotope ratio mass spectrometry, GC-IRMS)、基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas-chromatography coupled with mass spectrometry, GC-MS)的質(zhì)量同位素異構(gòu)體分布分析（mass isotopomer distribution analysis, MIDA)。然而這些方法涉及的GC-MS分析前的樣品預(yù)處理復(fù)雜繁 瑣，并且無(wú)法從分子水平上實(shí)現(xiàn)MID分析。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS)的分析手段 通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)(MS/MS)顯著提高了同位素富集研究的分子特異性。
[0004] 目前有報(bào)道，通過(guò)測(cè)定膽固醇酯（cholesterol esters)、磷脂（phospholipid)、三 酰甘油（triacylglycerol )、鞘脂（sphingolipid)或酯酰輔酶A (acyl-coA)等脂質(zhì)庫(kù)對(duì)外 源性穩(wěn)定同位素的吸收，來(lái)研究在飲食或藥物干預(yù)下的脂質(zhì)代謝應(yīng)答；或利用穩(wěn)定同位素 標(biāo)記追蹤脂肪酸碳鏈的延長(zhǎng)和降解。這些研究大大開拓了人們對(duì)脂質(zhì)代謝的認(rèn)識(shí)。然而， 到目前為止，這些研究只關(guān)注某一類或某幾種的脂質(zhì)，缺少一種非靶向的策略，可以實(shí)現(xiàn)對(duì) 盡可能多的標(biāo)記脂質(zhì)的檢測(cè)和覆蓋，從而進(jìn)一步獲取細(xì)胞、體液或組織中脂質(zhì)代謝動(dòng)態(tài)過(guò) 程的復(fù)雜信息。
[0005] 鑒于此，我們提出一種基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記輔助的脂質(zhì)組學(xué)并結(jié)合非靶向的同位 素異構(gòu)體篩選，用于脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)研究的新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，提出一種脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)研究的方法，該方法是基 于穩(wěn)定同位素標(biāo)記輔助的脂質(zhì)組學(xué)，并結(jié)合非靶向的同位素異構(gòu)體篩選。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案和技術(shù)步驟如下：
[0008] 第一步，將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂質(zhì)合成前體分子(常用有13C全標(biāo)記的棕櫚酸或油 酸)引入生物體系中。實(shí)驗(yàn)體系包括細(xì)胞模型，植物、動(dòng)物模型或人體的在體模型，通過(guò)如培 養(yǎng)基、飲食、注射等方式在各個(gè)相應(yīng)模型中引入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂質(zhì)合成前體分子；
[0009] 第二步：脂質(zhì)提取物用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-high resolution MS)以全掃描的形式進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)采集。
[0010] 第三步：將得到的脂質(zhì)組學(xué)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰匹配和特征提取后，得到包含各個(gè) 樣品的所有離子的保留時(shí)間（tR)、質(zhì)荷比（m/z)以及強(qiáng)度的峰表，并進(jìn)行初步數(shù)據(jù)預(yù)處 理，包括修正80%原則除去缺失值（參考文獻(xiàn)1 :Bijlsma，S. ;Bobeldijk，L. ;Verheij，E. R. ; Ramaker, R. ;Kochhar, S. ;Macdonald, I. A. ; van Ommen, B. ; Smilde, A. K. Analytical ChemiStiT2006,78,567-574. )，QC重復(fù)性考察除去變異系數(shù)大的離子(參考文獻(xiàn)2 : Gika, H. G. ; Theodoridis, G. A. ; Wingate, J. E. ; Wilson, I. D. Journal of Proteome Research2007, 6, 3291-3303.)。 toon] 第四步：從處理后的峰表信息中篩選出同源的標(biāo)記了完整的初始前體分子的同位 素異構(gòu)體（isotopomer)，即標(biāo)記的同位素異構(gòu)體含有的穩(wěn)定同位素個(gè)數(shù)為前體分子中的穩(wěn) 定同位素個(gè)數(shù)或其整數(shù)倍，如，采用13C全標(biāo)記的棕櫚酸，相應(yīng)的同位素異構(gòu)體含有至少一 個(gè)13c 16，并將同源的，即屬于同一個(gè)標(biāo)記脂質(zhì)的所有篩選所得同位素異構(gòu)體歸屬到同一個(gè) 標(biāo)記脂質(zhì)分子；篩選原則包括：
[0012] 1)根據(jù)所采用的標(biāo)記前體分子，同源的同位素異構(gòu)體系列的理論m/z差為固定 值，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定中允許一定誤差范圍，在高分辨質(zhì)譜下允許±0.005?±0.001的誤差范 圍；
[0013] 2)同源的同位素異構(gòu)體的理論保留時(shí)間&完全對(duì)齊，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定中允許一定漂移 范圍，在可重復(fù)的色譜行為下允許±0. lmin以內(nèi)；
[0014] 3)各個(gè)同位素異構(gòu)體由于同位素富集程度(如13C富集度）的不同，同位素模式 (isotopic pattern)也不同；
[0015] 4)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的同位素異構(gòu)體在空白對(duì)照中檢測(cè)不到；
[0016] 根據(jù)上述篩選原則，從峰表數(shù)據(jù)中提取出同源的標(biāo)記了完整的初始前體分子的同 位素異構(gòu)體，并歸屬于同一個(gè)標(biāo)記脂質(zhì)分子。
[0017] 如在采用[U-13C]-palmitate為前體分子的例子中，同源的同位素異構(gòu)體系列的 m/z差=16X (13C-12C)=16.0536;該步驟篩選出一系列的同源同位素異構(gòu)體，包括，Μ (天然 不標(biāo)記形式的脂質(zhì)分子)，M+16 (13C16標(biāo)記形式)，M+32 (13C32標(biāo)記形式)，M+48 (13C48標(biāo)記形 式）系列同位素異構(gòu)體離子，并進(jìn)行匹配。
[0018] 第五步：在第四步基礎(chǔ)上篩選出標(biāo)記了前體分子代謝中間體的脂質(zhì)同位素異構(gòu) 體，篩選原則包括：
[0019] 1)標(biāo)記了前體分子代謝中間態(tài)的同位素異構(gòu)體，與第四步中篩選出的同源離子， m/z差是基于可能的中間代謝過(guò)程所導(dǎo)致的碳鏈的長(zhǎng)度變化，如脂肪酸鏈的縮短或延長(zhǎng)； 并在實(shí)驗(yàn)測(cè)定中允許一定誤差范圍，在高分辨質(zhì)譜下允許±0. 005?±0. 001的誤差范圍
[0020] 2)所有同源同位素異構(gòu)體的理論保留時(shí)間&完全對(duì)齊，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定中允許一定漂 移范圍，在可重復(fù)的色譜行為下允許±0. lmin以內(nèi)；
[0021] 3)各個(gè)同位素異構(gòu)體由于同位素富集程度(如13C富集度）的不同，同位素模式 (isotopic pattern)各不同；
[0022] 4)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的同位素異構(gòu)體在空白對(duì)照中檢測(cè)不到；
[0023] 根據(jù)上述篩選原則，從峰表數(shù)據(jù)中提取除同源的標(biāo)記了前體分子的代謝中間體的 同位素異構(gòu)體，并合并第四步中篩選得的標(biāo)記了完整前體分子的同位同位素異構(gòu)體，進(jìn)行 匹配。
[0024] 如在以[U-13C]_palmitate為標(biāo)記前體分子的例子中，篩選出M+12 (13C12標(biāo)記形 式)，M+14 (13C14 標(biāo)記形式)，M+18 (13C18 標(biāo)記形式)，M+20 (13C2(I 標(biāo)記形式），M+28 (13C28 標(biāo)記 形式)，M+30 (13C3Q 標(biāo)記形式)，M+34 (13C34 標(biāo)記形式)，M+36 (13C36 標(biāo)記形式），M+44 (13C44 標(biāo) 記形式)，M+46 (13C46標(biāo)記形式)，M+50 (13C5(I標(biāo)記形式)，M+52 (13C52標(biāo)記形式）系列同位素 異構(gòu)體離子，并將所有的同源離子(包括第四步篩選出的離子）進(jìn)行匹配，歸屬到同一個(gè)標(biāo) 記脂質(zhì)分子。
[0025] 第六步，基于精確m/z、二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)和數(shù)據(jù)庫(kù)LIPIDMAPS，HMDB搜索所得的 定性結(jié)果(分子式，含 13C標(biāo)記個(gè)數(shù))和13C的天然豐度（1. 08%)，對(duì)同位素異構(gòu)體的豐度進(jìn)行 天然同位素的校正，并進(jìn)行質(zhì)量同位素異構(gòu)體分布分析（mass isotopomer distribution analysis, MIDA)〇
[0026] 第七步，計(jì)算所有檢測(cè)到的脂質(zhì)的整體豐度

【權(quán)利要求】
1. 一種脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)研究的方法，是基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記輔助的脂質(zhì)組學(xué)并結(jié)合 非靶向的同位素異構(gòu)體篩選，其特征在于： 第一步，將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂質(zhì)合成前體分子引入生物體系中； 第二步，脂質(zhì)提取物用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-MS)進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)采 集； 第三步，將得到的脂質(zhì)組學(xué)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰匹配和特征提取后，得到包含各個(gè)樣品的 所有離子的保留時(shí)間（tK)、質(zhì)荷比（m/z)以及強(qiáng)度的峰表，并進(jìn)行初步數(shù)據(jù)預(yù)處理； 第四步，從處理后的峰表信息中，篩選出標(biāo)記了完整的原始前體分子的脂質(zhì)同位素異 構(gòu)體（isotopomer)，并將同源的，即屬于同一個(gè)標(biāo)記脂質(zhì)的所有篩選所得同位素異構(gòu)體歸 屬到同一個(gè)標(biāo)記脂質(zhì)分子； 第五步，在第四步基礎(chǔ)上篩選出標(biāo)記了前體分子代謝中間體的脂質(zhì)同位素異構(gòu)體，并 合并第四步篩選所得離子，將所有同源的同位素異構(gòu)體歸屬到同一個(gè)標(biāo)記脂質(zhì)分子； 第六步，對(duì)篩選得到的同位素異構(gòu)體進(jìn)行天然同位素的校正，并進(jìn)行質(zhì)量同位素異構(gòu) 體分布分析（mass isotopomer distribution analysis, MIDA); 第七步，計(jì)算所有檢測(cè)到的脂質(zhì)的整體脂質(zhì)豐度(靜態(tài)輪廓)，標(biāo)記脂質(zhì)的同位素標(biāo)記 摩爾百分比(動(dòng)態(tài)同位素富集)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于；第一步中，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)體系包括 細(xì)胞模型，植物、動(dòng)物模型或人體的在體模型，通過(guò)如于細(xì)胞模型培養(yǎng)基中添加、植物培養(yǎng) 體系中添加，動(dòng)物模型或人體飲食中添加或注射等方式在各個(gè)相應(yīng)模型中引入穩(wěn)定同位素 標(biāo)記的脂質(zhì)合成前體分子； 以細(xì)胞體系為例，將細(xì)胞培養(yǎng)于含穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂質(zhì)合成前體分子的培養(yǎng)基中 (如13C全標(biāo)記的棕櫚酸，[U-13C]-palmitate)，此外還需要，培養(yǎng)于不含穩(wěn)定同位素標(biāo)記的 前體分子的正常培養(yǎng)基中作為空白對(duì)照。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：第二步中，采集脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的質(zhì)譜需為高 分辨質(zhì)譜(如Orbitrap)，掃描模式為全掃描，采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的質(zhì)量精度和分辨率將直接 影響后續(xù)的篩選結(jié)果。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：第三步中，原始峰表的預(yù)處理包括修正80% 原則除去缺失值，QC重復(fù)性考察除去變異系數(shù)大的離子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：第四步中，篩選同源的標(biāo)記了完整的初始前 體分子的同位素異構(gòu)體的篩選原則包括： 1) 根據(jù)所采用的標(biāo)記前體分子，同源的同位素異構(gòu)體系列的理論m/z差為固定值，在 實(shí)驗(yàn)測(cè)定中允許一定誤差范圍，在高分辨質(zhì)譜下允許±0. 005?±0. 001的誤差范圍； 2) 同源的同位素異構(gòu)體的理論保留時(shí)間、完全對(duì)齊，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定中允許一定漂移范 圍，在可重復(fù)的色譜行為下允許±0. lmin以內(nèi)； 3) 各個(gè)同位素異構(gòu)體由于同位素富集程度(如13C富集度）的不同，同位素模式 (isotopic pattern)也不同； 4) 穩(wěn)定同位素標(biāo)記的同位素異構(gòu)體在空白對(duì)照中檢測(cè)不到； 根據(jù)上述篩選原則，從峰表數(shù)據(jù)中提取出同源的標(biāo)記了完整的初始前體分子的同位素 異構(gòu)體并進(jìn)行匹配。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：第五步中，篩選同源的標(biāo)記了前體分子代謝 中間體的各個(gè)脂質(zhì)同位素異構(gòu)體，篩選原則包括： 1) 標(biāo)記了前體分子代謝中間態(tài)的同位素異構(gòu)體，與第四步中篩選出的同源離子，m/z差 是基于可能的中間代謝過(guò)程所導(dǎo)致的碳鏈的長(zhǎng)度變化，如脂肪酸鏈的縮短或延長(zhǎng)；并在實(shí) 驗(yàn)測(cè)定中允許一定誤差范圍，在高分辨質(zhì)譜下允許±0. 005?±0. 001的誤差范圍 2) 所有同源同位素異構(gòu)體的理論保留時(shí)間&完全對(duì)齊，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定中允許一定漂移范 圍，在可重復(fù)的色譜行為下允許±0. lmin以內(nèi)； 3) 各個(gè)同位素異構(gòu)體由于同位素富集程度(如13C富集度）的不同，同位素模式 (isotopic pattern)各不同； 4) 穩(wěn)定同位素標(biāo)記的同位素異構(gòu)體在空白對(duì)照中檢測(cè)不到； 根據(jù)上述篩選原則，從峰表數(shù)據(jù)中提取除同源的標(biāo)記了前體分子的代謝中間體的同位 素異構(gòu)體，并合并第四步中篩選得的標(biāo)記了完整前體分子的同位同位素異構(gòu)體，將同源的 同位素異構(gòu)體歸屬到同一個(gè)標(biāo)記脂質(zhì)分子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：第六步中，基于精確m/z、二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS) 和數(shù)據(jù)庫(kù)LIPIDMAPS，HMDB搜索所得的定性結(jié)果(分子式，含 13C標(biāo)記個(gè)數(shù)）和13C的天然豐 度（1. 08%)，對(duì)同位素異構(gòu)體的豐度進(jìn)行天然同位素的校正，扣除天然背景豐度，得到由于 人為引入穩(wěn)定同位素標(biāo)記導(dǎo)致的真實(shí)豐度。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，第七步中，計(jì)算標(biāo)記脂質(zhì)的同位素 異構(gòu)體之和[12C+13C]，得到整體水平；計(jì)算 13C同位素異構(gòu)體在整體水平中的比例[13C/ (12C+13C)]，得到動(dòng)態(tài)的同位素富集水平； 結(jié)合兩者信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)過(guò)程研究。
【文檔編號(hào)】G06F19/00GK104063570SQ201310091384
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月20日
【發(fā)明者】許國(guó)旺, 李佳, 趙欣捷, 陳世禮, 曾仲大, 路鑫 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所