一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定的方法
【專利摘要】一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定方法，本發(fā)明屬于基因組分子標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，具體步驟如下：1）在Illumina?GoldenGate方法獲得的SNP數(shù)據(jù)庫中，搜索一類和二類SNP突變位點(diǎn)；2）建立子代和親本的基因型數(shù)據(jù)庫文件，利用Cervus3.0軟件獲得各SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)；3）利用Cervus3.0軟件，根據(jù)各位點(diǎn)的等位基因頻率進(jìn)行家系模擬鑒定分析，然后進(jìn)行實(shí)際家系鑒定分析，計(jì)算候選親本對的LOD值，選擇LOD值最高且為正值的親本對作為真正父母本。本發(fā)明開發(fā)出一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定的SNP標(biāo)記方法，并優(yōu)化了其反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增條件，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明這些引物具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、溶解曲線分辨率高等特點(diǎn)，為太平洋牡蠣的家系選育奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因組分子標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牡蠣隸屬軟體動物門、雙殼綱、珍珠貝目，其肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，從遠(yuǎn)古時(shí)代就被人類所食用，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。牡蠣為世界性分布類群，目前已發(fā)現(xiàn)100多種，世界各臨海國家?guī)缀醵加猩a(chǎn)，是目前我國及世界產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)貝類。
[0003]作為世界第一大養(yǎng)殖貝類，牡蠣的遺傳改良?xì)v來受到國內(nèi)外專家和學(xué)者的普遍重視，并開展了大量研究工作。我國雖然是牡蠣養(yǎng)殖大國，但還并不是牡蠣養(yǎng)殖強(qiáng)國，存在遺傳改良研究相對滯后、遺傳基礎(chǔ)研究相對薄弱、良種匱乏等問題，嚴(yán)重影響和制約了我國牡蠣的健康養(yǎng)殖及遺傳改良工作。家系選擇育種是保持優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀以及獲得優(yōu)良品種和品系的重要手段，已在動植物中廣泛應(yīng)用。完整、準(zhǔn)確的系譜信息能夠避免近交、保持物種的遺傳多樣性，對促進(jìn)貝類的遺傳改良工作有重要的現(xiàn)實(shí)意義。SNP (單核苷酸多態(tài)性)是指DNA序列上的單個(gè)堿基變異，是繼微衛(wèi)星標(biāo)記后的第三代分子遺傳標(biāo)記，具有基因組分布廣、易于檢測、高遺傳穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，在家系鑒定中有著明顯的優(yōu)勢。高分辨熔解曲線(HRM)是一種基于高分辨率溶解分析的SNP分型新技術(shù)，具有高通量、低成本、易操作的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、基因組學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域的研究。利用現(xiàn)代分子標(biāo)記新技術(shù)，建立一套適用于太平洋牡蠣的SNP家系鑒定體系，將為確定個(gè)體間親緣關(guān)系提供有效途徑，為避免近交衰退提供有力的科學(xué)依據(jù)，為牡蠣的家系選育、構(gòu)建近交系、種質(zhì)資源保護(hù)等研究工作奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定的方法，有助于快速、準(zhǔn)確鑒別不同家系的太平洋牡蠣，為太平洋牡蠣的家系選育和種質(zhì)資源保護(hù)有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0005]一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定的方法，具體步驟如下:
[0006]I)在Illumina GoldenGate方法獲得的SNP數(shù)據(jù)庫中，搜索一類和二類SNP突變位點(diǎn)，所述的突變位點(diǎn)為C/T&G/A和C/A&G/T ；
[0007]2)建立子代和親本的基因型數(shù)據(jù)庫文件，利用CervuS3.0軟件獲得各SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)；
[0008]3)利用CerVus3.0軟件，根據(jù)各位點(diǎn)的等位基因頻率進(jìn)行家系模擬鑒定分析，然后進(jìn)行實(shí)際家系鑒定分析，計(jì)算候選親本對的LOD值，選擇LOD值最高且為正值的親本對作為真正父母本，計(jì)算家系鑒定成功率。
[0009]進(jìn)一步，所述的實(shí)際家系鑒定分析的步驟包括提取親本和子代的DNA，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，在Roche LightCycIer480進(jìn)行HRM分析。[0010]進(jìn)一步，所述的實(shí)際家系鑒定分析中的PCR引物為表I中的任何一對。
[0011]進(jìn)一步，所述的實(shí)際家系鑒定分析中的PCR反應(yīng)體系為IOy I Ang/yL模板DNAl μ L , Roche HRM Master5 μ L，25ng/ul MgCl2L 2-1.4 μ L，lOng/ul 引物各0.2 μ L余量雙蒸水補(bǔ)足；PCR擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性10min，94°C變性10s，62_55°C退火10s，72°C延伸5s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
[0012]進(jìn)一步，所述的實(shí)際家系鑒定分析中PCR引物的篩選方法:
[0013]I)在Illumina GoldenGate方法獲得的SNP數(shù)據(jù)庫中，搜索一類和二類SNP突變位點(diǎn)(C/T&G/A,C/A&G/T),在位點(diǎn)的側(cè)翼序列利用 Primer3.0 (http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)引物；設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體的出現(xiàn)；2)利用Qiagen試劑盒提取個(gè)體太平洋牡蠣基因組DNA，用PicoGreen熒光染料試劑盒進(jìn)行DNA的定量分析，將樣品DNA濃度調(diào)整至5ng/ μ L，用于SNP標(biāo)記的篩選和優(yōu)化；
[0014]3)以定量后的DNA做模板使用Roche LightCycler480進(jìn)行HRM檢測，通過改變退火溫度和Mg2+濃度篩選出擴(kuò)增效率高、溶解曲線清晰的引物，并獲得最優(yōu)的PCR反應(yīng)體系和引物的最佳退火溫度。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果:
[0016]本發(fā)明開發(fā)出一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定的方法，并優(yōu)化了其反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增條件，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明這些引物具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、溶解曲線分辨率高等特點(diǎn)，可應(yīng)用于太平洋牡蠣的家系親權(quán)鑒定分析，為太平洋牡蠣的家系選育奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1:191-153位點(diǎn)中等位基因在親本和子代的遺傳；
[0018]圖2:親本鑒定的LOD值。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步解釋，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施例任何形式上的限制。
[0020]實(shí)施例1
[0021]I)引物設(shè)計(jì)和優(yōu)化。
[0022]在Illumina GoldenGate方法獲得的SNP數(shù)據(jù)庫中，搜索一類和二類SNP突變位點(diǎn)(C/T&G/A, C/A&G/T),在位點(diǎn)的側(cè)翼序列利用 Primer3.0 (http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體的出現(xiàn)。引物長度為18-30bp，退火溫度為55-65°C，擴(kuò)增片段長度為50-180bp。利用Qiagen試劑盒提取6個(gè)個(gè)體太平洋牡蠣基因組DNA，用PicoGreen熒光染料試劑盒進(jìn)行DNA的定量分析，將樣品DNA濃度調(diào)整至5ng/μ L，用于SNP標(biāo)記的篩選和優(yōu)化。以定量后的DNA做模板使用Roche LightCycler480進(jìn)行HRM檢測，通過改變退火溫度和Mg2+濃度篩選出擴(kuò)增效率高、溶解曲線清晰的引物，并獲得最優(yōu)的PCR反應(yīng)體系和引物的最佳退火溫度。IOyl PCR反應(yīng)體系如下:5ng/μ L模板DNAl μ L, Roche HRM Master5 μ L，25ng/ulMgCl2l.4 μ L，lOng/ul 引物各 0.2 μ L，余量雙蒸水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性10min，94°C變性10s，62_55°C退火10s，72°C延伸5s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0[0023]2)牡蠣基因組DNA提取及定量。
[0024]對所有18個(gè)候選親本和78個(gè)子代用Qiagen試劑盒提取基因組DNA，利用PicoGreen熒光染料試劑盒進(jìn)行DNA的定量分析，調(diào)整終濃度至5ng/ μ L，4°C保存用于家系鑒定分析。
[0025]3)基于HRM的SNP家系鑒定體系的構(gòu)建
[0026]在Roche LightCycler480 進(jìn)行 HRM 分析，10 μ I PCR 反應(yīng)體系如下:5ng/μ L 模板DNAl μ L, Roche HRM Master5 μ L，25ng/ul MgCl2L 4 μ L，lOng/ul 引物各 0.2 μ L，余量雙蒸水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性10min，94°C變性10s，Ta (各引物優(yōu)化的最佳退火溫度)退火10s，72°C延伸5s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律和特征溶解曲線的形狀，篩選出38對重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的SNP引物，能夠清楚地區(qū)分純合子和雜合子基因型(如圖1)，引物詳細(xì)信息見表1，應(yīng)用于太平洋牡蠣的家系鑒定與分析。
[0027]4)太平洋牡蠣家系的親權(quán)鑒定分析
[0028]建立子代(n=78)和親本(N=18)的基因型數(shù)據(jù)庫文件,在Illumina GoldenGate方法獲得的SNP數(shù)據(jù)庫中，搜索一類和二類SNP突變位點(diǎn)，利用CervuS3.0軟件獲得各SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)，包括等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量、排除概率及累積排除概率等信息(見表2)。利用Cervus3.0軟件，根據(jù)各位點(diǎn)的等位基因頻率進(jìn)行家系模擬鑒定分析，然后進(jìn)行實(shí)際家系鑒定分析。所述的實(shí)際家系鑒定分析具體步驟如下:利用步驟2)定量后的DNA，在Roche LightCycler480進(jìn)行HRM分析，PCR反應(yīng)體系:10 μ I PCR反應(yīng)體系如下:5ng/μ L 模板 DNAl μ L, Roche HRM Master5 μ L,25ng/ul MgCl2L 4 μ L,10ng/ul 引物各0.2 μ L(引物為 _F-TCTCATCCTCATCCAAGTC，R-CACACGTGTAAGAAAGGATG，也可以是表 I 引物中的任何一對)，余量雙蒸水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性10min，94°C變性10s，56°C退火10s，72。。延伸5s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
[0029]計(jì)算最佳候選親本對的LOD值(見圖2)，選擇LOD值最高且為正值的親本對作為真正父母本，計(jì)算家系鑒定成功率。結(jié)果表明，93.2%的個(gè)體被成功分配到了 9個(gè)家系中，另夕卜，有6.8%的個(gè)體未指定到正確的親本，可能因?yàn)橛H本樣品缺失導(dǎo)致的。
[0030]表I太平洋牡蠣家系鑒定體系的38個(gè)SNP標(biāo)記的引物信息
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定方法，其特征在于具體步驟如下: 1)在IlluminaGoldenGate方法獲得的SNP數(shù)據(jù)庫中，搜索一類和二類SNP突變位點(diǎn)，所述的突變位點(diǎn)為C/T&G/A和C/A&G/T ； 2)建立子代和親本的基因型數(shù)據(jù)庫文件，利用CervuS3.0軟件獲得各SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)； 3)利用Cervus3.0軟件，根據(jù)各位點(diǎn)的等位基因頻率進(jìn)行家系模擬鑒定分析，然后進(jìn)行實(shí)際家系鑒定分析，計(jì)算候選親本對的LOD值，選擇LOD值最高且為正值的親本對作為真正父母本，計(jì)算家系鑒定成功率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定方法，其特征在于所述的實(shí)際家系鑒定分析的步驟包括提取親本和子代的DNA，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，在RocheLightCycIer480 進(jìn)行 HRM 分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定方法，其特征在于所述的實(shí)際家系鑒定分析中的PCR引物為表1中的任何一對。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定方法，其特征在于所述的實(shí)際家系鑒定分析中的PCR反應(yīng)體系為10μ 1^:5叩/^14莫板0嫩1口 L , Roche HRMMaster5 μ L , 25ng/ul MgCl2L 2 ~1.4 μ L , 10ng/ul 引物各 0.2 μ L 余量雙蒸水補(bǔ)足；PCR擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性10min，94°C變性10s，62~55°C退火10s，72°C延伸5s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種適用于太平洋牡蠣家系鑒定方法，其特征在于所述的實(shí)際家系鑒定分析中PCR引物的篩選方法: 1)在IlluminaGoldenGate方法獲得的SNP數(shù)據(jù)庫中，搜索一類和二類SNP突變位點(diǎn)，所述的突變位點(diǎn)為C/T&G/A和C/A&G/T，在位點(diǎn)的側(cè)翼序列利用Primer3.0設(shè)計(jì)引物；設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體的出現(xiàn)； 2)利用Qiagen試劑盒提取個(gè)體太平洋牡蠣基因組DNA，用PicoGreen熒光染料試劑盒進(jìn)行DNA的定量分析，將樣品DNA濃度調(diào)整至5ng/ μ L，用于SNP標(biāo)記的篩選和優(yōu)化； 3)以定量后的DNA做模板使用RocheLightCycler480進(jìn)行HRM檢測，通過改變退火溫度和Mg2+濃度篩選出擴(kuò)增效率高、溶解曲線清晰的引物，并獲得最優(yōu)的PCR反應(yīng)體系和引物的最佳退火溫度。
【文檔編號】G06F19/24GK103605913SQ201310660177
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】孫秀俊, 楊愛國, 吳彪 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所