刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型及構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型及構(gòu)建方法及應(yīng)用，構(gòu)建方法包括如下步驟：根據(jù)KEGG及NCBI數(shù)據(jù)庫中刺糖多孢菌基因組序列的注釋信息，添加多殺菌素生物合成的特征反應(yīng)和菌體合成反應(yīng)，并對網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)進(jìn)行手動精煉，獲得刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型。本發(fā)明利用刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，預(yù)測潛在基因靶點對多殺菌素產(chǎn)量提高的影響，最終確定改造方向，實現(xiàn)菌株的途徑分子改造方法。實驗證明，利用本發(fā)明的刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測的基因，經(jīng)改造得到的基因工程菌能使多殺菌素產(chǎn)量比野生型菌株提高了86.5%。為以后多殺菌素高效生產(chǎn)合成菌株的構(gòu)建、研究和分析提供了指導(dǎo)平臺。
【專利說明】刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型及構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物菌株代謝工程分子改造【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型及構(gòu)建方法及應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]多殺菌素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由刺糖多孢菌經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生。由于多殺菌素獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，它可以有效防治小菜蛾、甜菜夜蛾等多種鱗翅目害蟲，同時對哺乳動物、鳥類等沒有毒性(ACS symposium series.Discovery, isolation, andstructure elucidation of a family of structurally unique, fermentation-derivedtetracyclic macrolides.1992)。多殺菌素也因此被認(rèn)為是繼阿維菌素之后最為有效的生物殺蟲劑，成為新型生物農(nóng)藥研發(fā)的熱點。由于該化合物兼具化學(xué)農(nóng)藥的速效性和生物農(nóng)藥的安全性、低殘留等優(yōu)點，繼1999獲得美國“總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎”后，2008年其衍生物再一次獲得該獎(The Journal of antibiotics.The spinosyn family ofinsecticides!realizing the potential of natural products research.2010)。
[0003]由于野生型菌刺糖多孢菌菌株產(chǎn)多殺菌素能力弱，因此自其被發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)家采取多種手段對原始菌株進(jìn)行改良。目前，研究人員對多殺菌素發(fā)酵單位提高所做的努力主要集中在傳統(tǒng)的理化性質(zhì)誘變，利用基因工程手段對多殺菌素合成途徑基因進(jìn)行局部敲除或過表達(dá)改造。多殺菌素作為刺糖多孢菌的一種次級代謝物，其合成途徑復(fù)雜，局部水平的改造具有一定的盲目性，而且其改造結(jié)果也難以滿足生產(chǎn)需求。
[0004]近幾年內(nèi)，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，測序成本的降低，越來越多的物種全基因組被測序。如何利用如此龐大的基因組數(shù)據(jù)成為人們的研究熱點?；蚪M尺度網(wǎng)絡(luò)模型，以基因組注釋信息為基礎(chǔ)，提供了一個在整體水平上考察細(xì)胞代謝的理想視角(Currentopinion in biotechnology.Recent advances in reconstruction and applications ofgenome-scale metabolic models.2011)?；蚪M尺度網(wǎng)絡(luò)模型可以從整體上反應(yīng)系統(tǒng)對外界擾動的反應(yīng)，揭示與該擾動相關(guān)的`機(jī)理，確定不同表型的潛在原因，是系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要工具。魯棒性分析作為一種分析方法，它能反映目標(biāo)反應(yīng)對某特定反應(yīng)的敏感性。
[0005]胞內(nèi)還原力水平對次級代謝物合成具有重要影響，NADPH的再生水平是限制生物轉(zhuǎn)化效率關(guān)鍵因素，目前，增加胞內(nèi)NADPH水平主要通過以下三條途:磷酸戊糖途徑；三羧酸循環(huán)途徑；轉(zhuǎn)氫酶途徑。對轉(zhuǎn)氫酶的改造，可以調(diào)節(jié)胞內(nèi)輔因子的平衡，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。在大腸中過表達(dá)pntAB，可以使苯乙酮到(R)-苯基乙醇I的轉(zhuǎn)化效率提高3.5倍(Biotechnology letters.1mproved synthesis of chiral alcohols with Escherichiacoli cells co-expressing pyridine nucleotide transhydrogenase, NADP.-dependent alcohol dehydrogenase and NAD+_dependent formate dehydrogenase.2004)在谷氨酸棒狀桿菌中過表達(dá)PntAB可以顯著提高L-1賴氨酸的產(chǎn)量(Applied microbiologyand biotechnology.Expression of the Escherichia coli pntAB genes encodinga membrane-bound transhydrogenase in Corynebacterium glutamicum improvesL-1ysine formation.2007).Bastian(Metabolic engineering.Engineered ketol-acidreductoisomerase and alcohol dehydrogenase enable anaerobic2-methylpropan-l_olproduction at theoretical yield in Escherichia col1.2011)在異丙醇生產(chǎn)過程中通過過表達(dá)PntAB解決了輔因子不平衡問題，使異丙醇的產(chǎn)量提高了 6.5倍。
[0006]然而截至目前為止，未見有人報道在刺糖多孢菌中通過改造轉(zhuǎn)氫酶途徑實現(xiàn)多殺菌素的聞效生廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的提供一種刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型。
[0008]本發(fā)明的第二個目的是提供一種刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建方法。
[0009]本發(fā)明的第三個目的是提供一種刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的應(yīng)用。
[0010]一種刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0011]根據(jù)KEGG及NCBI數(shù)據(jù)庫中刺糖多孢菌基因組序列的注釋信息，添加多殺菌素生物合成的特征反應(yīng)和菌體合成反應(yīng)，并對網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)進(jìn)行手動精煉，獲得刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型。
[0012]上述方法構(gòu)建的刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型。
[0013]一種刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型在預(yù)測與提高多殺菌素產(chǎn)量相關(guān)基因靶點的應(yīng)用。
[0014]上述應(yīng)用，包括如下步驟:
[0015]I)通過對刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行分析，利用魯棒性分析方法，確定SEQ IDN0.3所示的轉(zhuǎn)氫酶PntAB對多殺菌素生物合成的影響；
[0016]2)根據(jù)NCBI上的轉(zhuǎn)氫酶基因序列設(shè)計SEQ IDN0.1所示的上游引物和SEQ IDN0.2所示的下游引物，以刺糖多孢菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)氫酶PntAB基因，利用XbaI和NdeI雙酶切，將轉(zhuǎn)氫酶PntAB基因插入到經(jīng)相同酶切含鏈霉菌強(qiáng)啟動子ermE*質(zhì)粒p0J260上，得到質(zhì)粒p0J261(圖2)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567 (ATCC貨號:BAA_525),利用結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)ATCC49460中，以50 μ g/mL的安普霉素篩選得到刺糖多孢菌基因工程菌SP-PNT。
[0017]含鏈霉菌強(qiáng)啟動子ermE*質(zhì)粒p0J260的構(gòu)建步驟為:將pIB139質(zhì)粒用HindIIIand XbaI雙酶切，插入質(zhì)粒p0J260中，獲得含鏈霉菌強(qiáng)啟動子ermE*質(zhì)粒p0J260 ；
[0018]其中pIB139質(zhì)粒由pSET152(商業(yè)化)中插入ermE*強(qiáng)啟動子構(gòu)成，其構(gòu)建過程參考文獻(xiàn)(Journal of molecular microbiology and biotechnology.1ncreasing theefficiency of heterologous promoters in actinomycetes.2002)
[0019]3)將刺糖多孢基因工程菌SP-PNT在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)量比野生型提高，證明轉(zhuǎn)氫酶pntAB基因?qū)Χ鄽⒕厣锖铣捎杏绊懀?br> [0020]所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:葡萄糖77g/L，棉籽餅粉28g/L，胨化牛奶20g/L，玉米漿膏 14.5g/L，油酸甲酯 40g/L, CaC035g/L,鼠李糖 lg/L，余量為水，pH=7.0。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0022]本發(fā)明利用刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，預(yù)測潛在基因靶點對多殺菌素產(chǎn)量提高的影響，最終確定改造方向，實現(xiàn)菌株的途徑分子改造方法。實驗證明，利用本發(fā)明的刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測的基因，經(jīng)改造得到的基因工程菌能使多殺菌素產(chǎn)量比野生型菌株提高了 86.5%。為以后多殺菌素高效生產(chǎn)合成菌株的構(gòu)建、研究和分析提供了指導(dǎo)平臺。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為轉(zhuǎn)氫酶活性對多殺菌素合成速率的影響。
[0024]圖2為轉(zhuǎn)氫酶擴(kuò)增質(zhì)粒構(gòu)建。
[0025]圖3為轉(zhuǎn)氫酶擴(kuò)增質(zhì)粒驗證。
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0027]實施例1
[0028]一種刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0029]根據(jù)KEGG，NCBI數(shù)據(jù)庫中的刺糖多孢菌基因組序列的注釋信息，添加多殺菌素生物合成的特征反應(yīng)(見表1)和菌體合成反應(yīng)(見表2):
[0030]表1多殺菌素生物合成反應(yīng)
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建方法，其特征包括如下步驟: 根據(jù)KEGG及NCBI數(shù)據(jù)庫中刺糖多孢菌基因組序列的注釋信息，添加多殺菌素生物合成的特征反應(yīng)和菌體合成反應(yīng)，并對網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)進(jìn)行手動精煉，獲得刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型。
2.權(quán)利要求1的方法構(gòu)建的刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型。
3.一種刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型在預(yù)測與提高多殺菌素產(chǎn)量相關(guān)基因靶點的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是包括如下步驟: .1)通過對刺糖多孢菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行分析，利用魯棒性分析方法，確定SEQ IDN0.3所示的轉(zhuǎn)氫酶PntAB對多殺菌素生物合成的影響； .2)根據(jù)NCBI上的轉(zhuǎn)氫酶基因序列設(shè)計SEQIDN0.1所示的上游引物和SEQ IDN0.2所示的下游引物，以刺糖多孢菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)氫酶pntAB基因，利用XbaI和NdeI雙酶切，將轉(zhuǎn)氫酶PntAB基因插入到經(jīng)相同酶切含鏈霉菌強(qiáng)啟動子ermE*質(zhì)粒p0J260上，得到質(zhì)粒P0J261，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567，利用結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入刺糖多抱菌(Saccharopolyspora spinosa) ATCC49460中，以50 μ g/mL的安普霉素篩選得到刺糖多孢菌基因工程菌SP-PNT ； 含鏈霉菌強(qiáng)啟動子ermE*質(zhì)粒p0J260的構(gòu)建步驟為:將pIB139質(zhì)粒用HindIII andXbaI雙酶切，插入質(zhì)粒P0J260中，獲得含鏈霉菌強(qiáng)啟動子ermE*質(zhì)粒p0J260 ； 表達(dá)載體 pIB139,構(gòu)建方法參考 J MolMicrobiol Biotechnol4 (4):417-426,由pSET152中插入ermE*強(qiáng)啟動子構(gòu)成。 .3)將刺糖多孢基因工程菌SP-PNT在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)量比野生型提高，證明轉(zhuǎn)氫酶pntAB基因?qū)Χ鄽⒕厣锖铣捎杏绊懀? 所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:葡萄糖77g/L，棉籽餅粉28g/L，胨化牛奶20g/L，玉米漿膏14.5g/L，油酸甲酯 40g/L，CaC035g/L，鼠李糖 lg/L，余量為水，ρΗ=7.0。
【文檔編號】G06F19/18GK103729576SQ201310756418
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】盧文玉, 王曉陽, 張傳波, 薛超友 申請人:天津大學(xué)