本發(fā)明涉及一種推導(dǎo)方法，具體涉及一種黑土區(qū)土壤-作物系統(tǒng)中生物炭適宜用量的推導(dǎo)方法。

背景技術(shù)：

生物炭是指：在缺氧的條件下，把生物質(zhì)進(jìn)行高溫處理，使生物質(zhì)中的油和氣燃燒掉，燃燒后所剩下的有機(jī)物料。

生物炭幾乎是純碳，埋到地下后可以有幾百至上千年不會(huì)消失，等于把碳封存進(jìn)了土壤，有助于減緩全球變暖。

目前，全世界范圍內(nèi)引發(fā)了對(duì)生物炭的廣泛興趣。有不少科學(xué)家認(rèn)為，用生物炭捕捉碳元素相當(dāng)穩(wěn)定，不僅能將碳元素“鎖”在地下數(shù)百年，讓土壤變得更肥沃，而且還可以減少二氧化氮和甲烷等溫室氣體的排放。

現(xiàn)有的一些相關(guān)文獻(xiàn)(劉祥宏.生物炭在黃土高原典型土壤中的改良作用[D].中國(guó)科學(xué)院研究生院(教育部水土保持與生態(tài)環(huán)境研究中心)，2013；卜曉莉、薛建輝.生物炭對(duì)土壤生境及植物生長(zhǎng)影響的研究進(jìn)展[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2014，03:535-540.)表明：少量(<4t ha^-1)和過(guò)量(>45t ha^-1)的生物炭對(duì)土壤-作物系統(tǒng)均無(wú)顯著影響，甚至對(duì)土壤-作物系統(tǒng)有負(fù)效應(yīng)。但涉及到推薦用量時(shí)，這些相關(guān)文獻(xiàn)均是定性討論，并未給出具體建議。

此外，大多數(shù)文獻(xiàn)均是在有機(jī)物料投入土壤-作物系統(tǒng)后，作物生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)，針對(duì)作物農(nóng)學(xué)指標(biāo)(主要是作物產(chǎn)量)和有機(jī)物料的投入量作相關(guān)性分析，然后粗略計(jì)算有機(jī)物料(生物炭)的用量。

然而，真正干擾作物產(chǎn)量的因子是土壤中氮元素的吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)。土壤微生物(細(xì)菌、硝化細(xì)菌)在氮素循環(huán)中起著關(guān)鍵作用，目前的文獻(xiàn)針對(duì)土壤微生物與土壤-作物系統(tǒng)常用指標(biāo)(例如有機(jī)物料的投入量、化肥與有機(jī)物料配施量)的分析卻較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，從施入生物炭后土壤微生物的變化趨勢(shì)和微生物對(duì)氮素代謝影響的角度出發(fā)，提供一種黑土區(qū)土壤-作物系統(tǒng)中生物炭適宜用量的推導(dǎo)方法，通過(guò)該方法我們可以定量給出生物炭的適宜用量，從而為解決生產(chǎn)實(shí)踐問(wèn)題提供更深入、更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種黑土區(qū)土壤-作物系統(tǒng)中生物炭適宜用量的推導(dǎo)方法，其特征在于，包括以下步驟：

Step1：在土壤-作物系統(tǒng)中的敏感區(qū)域施入不同量的生物炭，然后運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤微生物的16s rRNA進(jìn)行測(cè)序；

Step2：對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，篩選出和生物炭施入量聯(lián)系最為緊密的土壤微生物，即敏感微生物；

Step3：運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)不同時(shí)間、空間下敏感微生物的量；

Step4：根據(jù)熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果，確定敏感微生物在不同生物炭施入量下的準(zhǔn)確的變化規(guī)律；

Step5：根據(jù)敏感微生物的變化規(guī)律建立土壤硝化細(xì)菌量與生物炭施用量的關(guān)系模型、土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性指標(biāo)MWD與生物炭施用量的關(guān)系模型；

Step6：對(duì)上述兩個(gè)模型求解，從而確定生物炭的適宜用量。

前述的方法，其特征在于，在Step1中，在土壤-作物系統(tǒng)中的敏感區(qū)域施入不同量的生物炭的具體方法為：

設(shè)置黑土定位小區(qū)，將不同量級(jí)生物炭施入各小區(qū)表土層，各處理隨機(jī)排列，定位試驗(yàn)三年。

前述的方法，其特征在于，在Step2中，篩選敏感微生物的依據(jù)是：

那些數(shù)量變少、16s rRNA變化大且種類變多的土壤微生物即為敏感微生物。

前述的方法，其特征在于，在Step4中，前述變化規(guī)律為能夠體現(xiàn)出敏感微生物與土壤氮素遷移之間的變化關(guān)系的規(guī)律。

前述的方法，其特征在于，在Step5中，建立模型的方法為：

以土壤硝化細(xì)菌量/土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性指標(biāo)MWD為因變量，生物炭施用量為自變量，分別帶入線性函數(shù)、冪函數(shù)、一元二次方程和指數(shù)函數(shù)中，求R²的值，R²的值最大的那個(gè)函數(shù)即土壤硝化細(xì)菌量/土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性指標(biāo)MWD與生物炭施用量的關(guān)系模型。

本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明的方法將土壤-微生物-肥料吸收利用率-作物體系聯(lián)系在一起，確定土壤微生物在施入生物炭后有利于提高養(yǎng)料吸收，提高作物生長(zhǎng)，改善土壤條件的活性敏感范圍(該活性敏感范圍指的是“土壤微生物的群落變化趨勢(shì)”)，為生物炭的定量施用方面做出了有價(jià)值的參考，即在黑土區(qū)進(jìn)行了推薦施用生物炭，在玉米秸稈無(wú)法大量還田的農(nóng)業(yè)背景下，為該農(nóng)業(yè)廢棄物以生物質(zhì)炭形式，合理施用量進(jìn)行土壤培肥和固碳減排，從而為大面積推廣生物炭還田培肥提供了理論基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1是多樣品相似度樹(shù)圖；

圖2是不同處理根際微生物細(xì)菌種群差異圖；

圖3是各生育時(shí)期不同處理對(duì)土壤氨氧化古菌(B)豐度的影響圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體的介紹。

一、施入不同量生物炭后對(duì)土壤微生物進(jìn)行測(cè)序

針對(duì)土壤-作物系統(tǒng)中的敏感區(qū)域的土壤微生物細(xì)菌群落，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行土壤微生物測(cè)序，以便更詳細(xì)、更準(zhǔn)確的描述生物炭定位施用小區(qū)施入生物炭后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化。

本發(fā)明主要探究在施入不同量的生物炭后土壤微生物細(xì)菌16s rRNA的群落結(jié)構(gòu)變化，以便得出土壤微生物在種的水平上的演替及變化情況。具體的：

設(shè)置黑土定位小區(qū)，將不同量級(jí)生物炭施入各小區(qū)表土層，各處理隨機(jī)排列，定位試驗(yàn)三年后，取同一時(shí)期(收獲期)不同處理根系土壤，對(duì)土壤微生物細(xì)菌16s rRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，三次平行，三次重復(fù)。

二、篩選出和生物炭施入量聯(lián)系最為緊密的微生物

對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分析不同生物炭施入量下土壤微生物的結(jié)構(gòu)變化、數(shù)量變化和種類變化，從而篩選出和生物炭施入量聯(lián)系最為緊密的土壤微生物，即敏感微生物，以該敏感微生物作為后續(xù)的研究對(duì)象。

生物炭對(duì)氮素代謝過(guò)程影響顯著，對(duì)作物吸收利用氮素影響成相關(guān)性，在氮素代謝過(guò)程中硝化作用起關(guān)鍵作用，進(jìn)過(guò)高通量數(shù)據(jù)分析，與硝化過(guò)程相關(guān)的微生物在屬的水平上變化不顯著，在種的水平上變化及其顯著。篩選出在硝化作用中起到關(guān)鍵作用的氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)作為敏感微生物的研究對(duì)象。

三、敏感微生物定量檢測(cè)

編碼氨單加氧酶AmoA亞基(ammonia monooxy-genase subsuit A，AmoA)的基因，amoA是硝化過(guò)程的核心基因，取作物根系土，根據(jù)微生物遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性、同一物種間基因的高度保守性，分別用引物amoA-1F/2R、amoA-AF/AR采用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)不同時(shí)間、空間(時(shí)間：整個(gè)生育期，空間：)下氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌基因表達(dá)量，同時(shí)測(cè)定細(xì)菌總量16s rRNA表達(dá)量。

四、確定敏感微生物變化趨勢(shì)與生物炭、產(chǎn)量間的關(guān)系

根據(jù)熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果，確定敏感微生物在不同生物炭施入量下的準(zhǔn)確的變化規(guī)律，該變化規(guī)律能夠體現(xiàn)出敏感微生物與土壤氮素遷移(吸氮量和產(chǎn)量成正相關(guān)關(guān)系)之間的變化規(guī)律，同時(shí)觀察敏感微生物的活性狀態(tài)。

五、建立模型

1、建立土壤硝化細(xì)菌量與生物炭施用量的關(guān)系模型

以土壤硝化細(xì)菌量為因變量(y)，生物炭施用量為自變量(x)，分別帶入線性函數(shù)、冪函數(shù)、一元二次方程和指數(shù)函數(shù)中，求R²的值，R²的值最大的那個(gè)函數(shù)即土壤硝化細(xì)菌量與生物炭施用量之間的關(guān)系模型。

2、建立土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性指標(biāo)MWD與生物炭施用量的關(guān)系模型

以土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性指標(biāo)MWD為因變量(y)，生物炭施用量為自變量(x)，分別帶入線性函數(shù)、冪函數(shù)、一元二次方程和指數(shù)函數(shù)中，求R²的值，R²的值最大的那個(gè)函數(shù)即土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性指標(biāo)MWD與生物炭施用量之間的關(guān)系模型。

六、確定生物炭的適宜用量

對(duì)上述兩個(gè)模型求解，從而確定生物炭的適宜用量。

為了更清楚的描述本發(fā)明的方法，現(xiàn)以一具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。

1、施入不同量生物炭后對(duì)土壤微生物進(jìn)行測(cè)序

(1)2013年開(kāi)始，在哈爾濱市民主鄉(xiāng)設(shè)置黑土定位小區(qū)，將不同量級(jí)生物炭施入各小區(qū)表土層，各處理隨機(jī)排列，四個(gè)處理分別為：

對(duì)照組：0噸生物炭/公頃；

實(shí)驗(yàn)組I：15.75噸生物炭/公頃；

實(shí)驗(yàn)組II：31.5噸生物炭/公頃；

實(shí)驗(yàn)組III：47.25噸生物炭/公頃。

(2)定位試驗(yàn)三年后，取不同處理根系土壤，對(duì)土壤微生物細(xì)菌16s rRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，三次平行，三次重復(fù)。

表1施入不同生物炭對(duì)根際微生物細(xì)菌種群數(shù)量的影響

注：不同字母表示不同處理在P<0.05水平的差異顯著性。

圖1是多樣品相似度樹(shù)圖。

圖2是不同處理根際微生物細(xì)菌種群差異圖(不同字母表示不同處理對(duì)種群微生物在P<0.05水平的差異顯著性)。

細(xì)菌在土壤根際微生物組成中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，由圖1、圖2可知，施入不同生物炭后作物根際土壤微生物細(xì)菌總數(shù)量的變化表現(xiàn)為：

實(shí)驗(yàn)組II>實(shí)驗(yàn)組I>實(shí)驗(yàn)組III>對(duì)照組CK，差異顯著(P<0.05)。施入31.5噸生物炭/公頃時(shí)，細(xì)菌種群變化趨勢(shì)明顯。

2、篩選出和生物炭施入量聯(lián)系最為緊密的微生物

對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果的taxlevel文件夾進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將每個(gè)OUT的代表序列都與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)RDP庫(kù)中的參考序列對(duì)OTU進(jìn)行種屬鑒定篩選，將OTU綜合分類表中的信息按照界、門(mén)、綱、目、科、屬、種6個(gè)水平分別提取信息，分別統(tǒng)計(jì)各樣品在不同分類水平上的菌群組成及豐度。

表2不同水平的物種分類表

通過(guò)對(duì)四個(gè)樣本進(jìn)行高通量測(cè)序共獲得Unigene196716條，獲得注釋的Unigene138486條，另有28230條未被注釋，認(rèn)為可能是新基因。其中通過(guò)KEGG分析，注釋為與氮代謝途徑相關(guān)基因19054條，硝化途徑相關(guān)基因2998條。不同處理間與硝化細(xì)菌屬，菌群豐度變化明顯。

表3施入不同生物炭對(duì)土壤、植株氮吸收的影響

3、敏感微生物定量檢測(cè)

對(duì)種植玉米的實(shí)驗(yàn)根系土壤樣品進(jìn)行細(xì)菌16s rRNA，氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)以amoA基因，氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)以amoA基因進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，基因表達(dá)量如下：

表4各生育時(shí)期不同處理土壤細(xì)菌16s rRNA豐度值

表5各生育時(shí)期不同處理土壤氨氧化古菌(B)豐度值

圖3是與表5對(duì)應(yīng)的柱形圖。

由表5和圖3可知：土壤氨氧化古菌(B)隨隨生育期豐度值先升高后下降，但在整個(gè)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，基因豐度值變化趨勢(shì)緩慢。處理Ⅰ、Ⅱ變化最大，說(shuō)明隨著生物炭施入量的增加會(huì)提高氨氧化古菌(B)表達(dá)量，當(dāng)生物炭施入量到達(dá)一定范圍，氨氧化古菌(B)表達(dá)量開(kāi)始下降，氨氧化古菌(B)可以作為生物炭施入量的考察指標(biāo)之一。

4、確定敏感微生物變化趨勢(shì)與生物炭、產(chǎn)量間的關(guān)系

表6施入不同生物炭對(duì)產(chǎn)量的影響

由表6可知：隨著生物炭量的增加，產(chǎn)量總體上顯著增加。當(dāng)生物炭量大于31.5t ha^-1時(shí)，產(chǎn)量略有降低，但整體上呈增增減的趨勢(shì)。而作為生物炭施入量的考察指標(biāo)之一(見(jiàn)表5)，氨氧化古菌(B)作為氮素轉(zhuǎn)化的直接影響因子，其整個(gè)生育期(播種到成熟，8個(gè)生育期)的變化趨勢(shì)也是先增加后減少，與產(chǎn)量的關(guān)系均為正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)分別為0.91、0.94、0.61、0.82、0.78、0.85、0.72、0.79)，體現(xiàn)出生物炭-微生物-氮素-產(chǎn)量的遞進(jìn)關(guān)系式。

5、建立模型

(1)建立土壤硝化細(xì)菌量與生物炭施用量的關(guān)系模型

以土壤硝化細(xì)菌量為因變量(y)，生物炭施用量為自變量(x)，分別帶入線性函數(shù)、冪函數(shù)、一元二次方程和指數(shù)函數(shù)中，求R²的值，具體的：

線性函數(shù)：y＝0.0009x+0.2589，R²＝0.124。

冪函數(shù)：部分趨勢(shì)數(shù)據(jù)含負(fù)值，不能計(jì)算。

一元二次方程：y＝-9×10^-5x²+0.006x+0.2009，R²＝0.7205

指數(shù)函數(shù)：0.2514e^0.0041x，R²＝0.1655。

R²的值最大的那個(gè)函數(shù)即土壤硝化細(xì)菌量與生物炭施用量的關(guān)系模型，即模型為一元二次方程：

y＝-9×10^-5x²+0.006x+0.2009

(2)建立土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性指標(biāo)MWD與生物炭施用量的關(guān)系模型

以土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性指標(biāo)MWD為因變量(y)，生物炭施用量為自變量(x)，分別帶入線性函數(shù)、冪函數(shù)、一元二次方程和指數(shù)函數(shù)中，求R²的值，具體的：

線性函數(shù)：y＝0.0028x+0.569，R²＝0.2568。

冪函數(shù)：部分趨勢(shì)數(shù)據(jù)含負(fù)值，不能計(jì)算。

一元二次方程：y＝-0.002x²+0.0126x+0.288，R²＝0.712

指數(shù)函數(shù)：0.5606e^0.0048x，R²＝0.291。

R²的值最大的那個(gè)函數(shù)即土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性指標(biāo)MWD與生物炭施用量的關(guān)系模型，即模型為一元二次方程：

y＝-0.002x²+0.0126x+0.288

研究結(jié)果表明，過(guò)量的生物炭(47.25噸/公頃)會(huì)導(dǎo)致土壤硝化細(xì)菌量降低，土壤結(jié)構(gòu)性變差。

6、確定生物炭的適宜用量

對(duì)上述兩個(gè)一元二次方程求根，結(jié)果為：x＝30.125。

生物炭量取整數(shù)(四舍五入)，以便生產(chǎn)實(shí)踐中簡(jiǎn)單易行，所以推薦生物炭量為30噸/公頃。

由此可見(jiàn)，通過(guò)運(yùn)用本發(fā)明的方法，我們可以從代謝機(jī)理和養(yǎng)分分解吸收角度為解決生產(chǎn)實(shí)踐問(wèn)題提供更深入、更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。

需要說(shuō)明的是，上述實(shí)施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。