本發(fā)明涉及離體組織的基因信息分析領(lǐng)域，具體地，涉及一種檢測流產(chǎn)組織dna拷貝數(shù)變異和嵌合體的方法。
背景技術(shù)：
：流行病學(xué)證據(jù)顯示基因的因素在流產(chǎn)發(fā)生中起重要作用。染色體異常例如三體，單體，多倍體是用傳統(tǒng)方法檢測出的常見致流產(chǎn)原因，為50～70％小于10周妊娠的流產(chǎn)做出了解釋。由于傳統(tǒng)方法的分辨率有限，-30～40％的流產(chǎn)胚胎的具有正常的檢測結(jié)果即二倍體，沒有更多發(fā)現(xiàn)用于解釋流產(chǎn)的原因。染色體嵌合體在不同的樣本中發(fā)生率不同。在羊水樣本中約0.20％～0.25％，在絨毛組織樣本中約0.8％～0.2％。由于染色體基因芯片用于檢測嵌合體只能檢出25～70％的嵌合，以及嵌合體的檢測收樣本采集的影響很大。所以在分析流產(chǎn)的原因時，嵌合體的發(fā)生率是被低估了。尤其是低比例的嵌合體。分子核型分析的方法，如多重?zé)晒庠浑s交(mfish)，多重連接依賴探針擴(kuò)增(mlpa)和實時定量酶連反應(yīng)(qpcr)，克服了傳統(tǒng)核型分析的劣勢，提供了比傳統(tǒng)核型分析更好的分辨率。但是這些分子核型方法的缺點是通量低、分辨率有限，對于衡量全部染色體的變異情況能力有限。在目前現(xiàn)有檢測方法中，g帶染色體核型分析技術(shù)是檢測染色體異常的“金標(biāo)準(zhǔn)”。g帶核型分析是一種傳統(tǒng)的染色體分析方法，在自發(fā)性流產(chǎn)原因的探索中占重要地位。但是細(xì)胞培養(yǎng)失敗，母源細(xì)胞污染，染色體制備失敗等因素在很大程度上限制了g帶核型分析的應(yīng)用。微陣列比較基因組雜交技術(shù)是一種新型高效的分子核型分析技術(shù)，其優(yōu)勢在于省去了細(xì)胞培養(yǎng)，一定程度上避免了母體細(xì)胞污染?？梢灾苯釉赿na水平上進(jìn)行分析并將分析結(jié)果比對數(shù)據(jù)庫做出診斷。很大程度上又要依賴于細(xì)胞樣品的質(zhì)量。如果樣本細(xì)胞量小或被污染，則很難或不能檢測出結(jié)果。利用高通量測序技術(shù)對流產(chǎn)組織進(jìn)行檢測的方法相比傳統(tǒng)方法具有明顯優(yōu)勢。該方法最低起始量只需3ngdna樣本，相比于微陣列比較基因組雜交技術(shù)對樣本量要求少，對樣本質(zhì)量要求不如微陣列方法嚴(yán)格。檢測的準(zhǔn)確性、靈敏度及可靠性都大大提高。通過低深度測序，能夠?qū)α鳟a(chǎn)組織dna的拷貝數(shù)變化進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，可以克服傳統(tǒng)檢測方法耗時長，需要細(xì)胞培養(yǎng)，分辨率低等缺點。目前，市場上基于高通量基因測序法檢測流產(chǎn)組織的診斷產(chǎn)品都是基于illumina測序平臺，沒有針對iontorrent平臺開發(fā)的配套的生物信息學(xué)算法。本發(fā)明旨在提供一套用于iontorrent測序平臺檢測流產(chǎn)組織中染色體dna拷貝數(shù)變異和嵌合體的算法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種基于iontorrent測序平臺檢測流產(chǎn)組織dna拷貝數(shù)變異和嵌合體的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：一種基于iontorrent測序平臺檢測流產(chǎn)組織dna拷貝數(shù)變異的方法，包括數(shù)據(jù)質(zhì)控、數(shù)據(jù)校正、確定拷貝數(shù)變異、結(jié)果展示、確定參考范圍；所述確定拷貝數(shù)變異包括：(1)校正后的數(shù)據(jù)根據(jù)circularbinarysegmentation算法確定拷貝數(shù)變異數(shù)值，(2)根據(jù)隱馬爾科夫模型hiddenmarkovmodel算法確定拷貝數(shù)變異數(shù)值，(3)根據(jù)z-score對區(qū)間內(nèi)拷貝數(shù)變異顯著性進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計；所述確定參考范圍為：r值的參考范圍在[-0.2,0.2]之間，z值的參考范圍是[-3,3]，對于r值大于0.2或小于-0.2，z值大于或小于3的區(qū)間，則提示該染色體區(qū)域存在拷貝數(shù)重復(fù)或缺失的情況。隱馬爾科夫模型是生物信息學(xué)中比較流行的機(jī)器學(xué)習(xí)和模式識別方法，具有對模型中一些隱性參數(shù)識別優(yōu)化的能力，可以隨著訓(xùn)練深入提高識別精度，能夠自適應(yīng)的實現(xiàn)檢測過程中的參數(shù)優(yōu)化，進(jìn)一步提高檢測靈敏度。所述數(shù)據(jù)質(zhì)控包括：(1)去除低質(zhì)量的reads：包括大于q15的堿基比例不小于80％、reads長度不小于50bp；(2)去重：同一條reads被多次復(fù)制的當(dāng)作一條reads；(3)比對reads唯一性：對于多次比對到基因組不同部位的reads，將其從結(jié)果中去除。所述數(shù)據(jù)校正包括：(1)基因組的端粒、著絲粒、衛(wèi)星、微衛(wèi)星區(qū)域進(jìn)行掩蓋；(2)將基因組切割成50kb一個的窗口，統(tǒng)計落在每一個窗口中的reads個數(shù)；(3)窗口內(nèi)如果參考基因組的n堿基的比例大于10％，直接去除該窗口，否者對reads進(jìn)行中位數(shù)校正；(4)對窗口內(nèi)的reads根據(jù)每個窗口的gc百分?jǐn)?shù)進(jìn)行l(wèi)oess校正；(5)對窗口內(nèi)的reads根據(jù)每個窗口的實際比對率進(jìn)行l(wèi)owess校正；(6)根據(jù)女性或者男性樣本的基線數(shù)據(jù)分別根據(jù)性別進(jìn)行校正。一種基于iontorrent測序平臺檢測流產(chǎn)組織嵌合體的存在和比例的方法，包括數(shù)據(jù)質(zhì)控、數(shù)據(jù)校正、采用人工模擬染色體嵌合體配比樣本log2ratio值和嵌合體比例之間的關(guān)系，具體如下：設(shè)立了7個梯度的模擬嵌合體比例，分別為12.5％，35％，47.5％，50％，62.5％，75％，87.5％。經(jīng)過測序數(shù)據(jù)分析得出不同比例的嵌合體log2ratio值。然后將log2ratio值轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)化讀長頻率。做標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線從標(biāo)準(zhǔn)化讀長頻率可以推測出樣本是否存在嵌合體以及嵌合體比例。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明提供的基于iontorrent測序平臺檢測流產(chǎn)組織dna拷貝數(shù)變異和嵌合體的方法，可以用于流產(chǎn)原因分析，進(jìn)一步具體地闡述基因因素在流產(chǎn)發(fā)生中的重要作用。附圖說明圖1為樣本基因組dna打斷后2100質(zhì)控圖。圖2為樣本基因組dna片段選擇后質(zhì)控圖。圖3為染色體具體區(qū)間拷貝數(shù)變異圖。圖4為染色體拷貝數(shù)變異的核型圖。圖5為采用人工模擬染色體嵌合體配比樣本log2ratio值和嵌合體比例之間的關(guān)系做的標(biāo)準(zhǔn)曲線；上圖為圖a，下圖為圖b，其中a為按人工配的不同比例嵌合做拷貝數(shù)擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，b為按人工配的不同比例嵌合做拷貝數(shù)缺失的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實施方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實施例1一種基于iontorrent測序平臺檢測流產(chǎn)組織dna拷貝數(shù)變異和嵌合體的方法，具體步驟如下：1、全血基因組dna提?。喊凑誨neasyblood&tissuekit(50)(廠家：qiagen，貨號：69504)試劑盒操作說明書進(jìn)行全血基因組dna提取。dna溶液可置于-20℃保存。2、dna打斷：將從健康未孕女性混合血細(xì)胞中提取的基因組dna用covarism220超聲波打斷，設(shè)置10個重復(fù)，用qubit2.0和dsdnahsassaykit測定dna的濃度，agilent2100bioanalyzer測定dna片段長度分布，見圖1。3、回收100～200bp長度的dna片段：往以上打斷的基因組dna中加入相應(yīng)比例的磁珠(ampurexpbeads)，去除大片段和小片段，用超純水洗脫，回收目的dna片段。用qubit2.0和dsdnahsassaykit測定dna的濃度，agilent2100bioanalyzer測定dna片段長度分布，見圖2。4、文庫構(gòu)建(1)將末端補(bǔ)平試劑置于冰上溶解，根據(jù)實驗樣本數(shù)計算各反應(yīng)體系的具體用量，并配置反應(yīng)混合液。渦旋混勻，離心機(jī)低速離心數(shù)秒，使管壁和蓋子上無明顯液滴。每個樣本所需的末端反應(yīng)體系如下：試劑體積(μl)h2o9.55xendrepairbuffer10endrepairenzyme0.5總體積20磁珠純化末端修復(fù)產(chǎn)物dna片段末端加接頭2)將接頭連接試劑置于冰上溶解。3)將p1母液及1～32號接頭母液分別與無核酸酶水以1:5的比例稀釋備用。4)按根據(jù)操作說明。根據(jù)實驗樣本數(shù)計算各反應(yīng)體系的具體用量，并配置反應(yīng)混合液。每個樣本所需的末端反應(yīng)體系如下：金屬浴中25℃反應(yīng)20min。5)磁珠純化連接產(chǎn)物6)pcr擴(kuò)增dna片段根據(jù)實驗樣本數(shù)計算各反應(yīng)體系的具體用量，并配置反應(yīng)混合液。每個樣本所需的末端反應(yīng)體系如下：試劑1x(μl)platinumpcrsupermixhighfidelity47.5libraryamplificationprimermix2.5總體積507)磁珠純化pcr產(chǎn)物8)文庫質(zhì)檢采用qubit2.0和2100bioanalyzer分別進(jìn)行dna初步濃度和片段大小檢測。5、按照ionpgmtmhiqtmot2reagents200(廠家：lifetechnologies，貨號：a26428)和ionpgmtmhiqtmot2solutions200(廠家：lifetechnologies，貨號：a26429)的試劑盒操作說明書進(jìn)行模板制備和模板富集。6、按照ionpgmitmhiqtmsequencing200reagents(廠家：lifetechnologies，貨號：a26431)、ionpgmtmhiqtmsequencing200solutions(廠家：lifetechnologies，貨號：a26430)和ionpgmtmsequencingnucleotides(廠家：lifetechnologies，貨號：a26432)的試劑盒操作說明書進(jìn)行上機(jī)測序。二、iontorrent平臺開發(fā)的配套的生物信息學(xué)算法如下：1、數(shù)據(jù)質(zhì)控(1)去除低質(zhì)量的reads：包括大于q15的堿基比例不小于80％、reads長度不小于50bp；(2)去重：由于建庫過程中擴(kuò)增步驟而導(dǎo)致的同一條reads被多次復(fù)制的當(dāng)作一條reads；(3)比對reads唯一性：對于多次比對到基因組不同部位的reads，將其從結(jié)果中去除；2、數(shù)據(jù)校正(1)基因組的端粒、著絲粒、衛(wèi)星、微衛(wèi)星區(qū)域進(jìn)行掩蓋；(2)將基因組切割成50kb一個的窗口，統(tǒng)計落在每一個窗口中的reads個數(shù)；(3)窗口內(nèi)如果參考基因組的n堿基的比例大于10％，直接去除該窗口，否者對reads進(jìn)行中位數(shù)校正；(4)對窗口內(nèi)的reads根據(jù)每個窗口的gc百分?jǐn)?shù)進(jìn)行l(wèi)oess校正；(5)對窗口內(nèi)的reads根據(jù)每個窗口的實際比對率進(jìn)行l(wèi)owess校正；(6)根據(jù)女性或者男性樣本的基線數(shù)據(jù)分別根據(jù)性別進(jìn)行校正；3、確定拷貝數(shù)變異(1)校正后的數(shù)據(jù)根據(jù)circularbinarysegmentation(cbs)算法確定拷貝數(shù)變異數(shù)值；(2)同樣根據(jù)hiddenmarkovmodel(hmm)算法確定拷貝數(shù)變異數(shù)值；(3)根據(jù)z-score對區(qū)間內(nèi)拷貝數(shù)變異顯著性進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計，并綜合以上的結(jié)果給出明確的判定；4、結(jié)果展示(1)所有染色體拷貝數(shù)變異的核型圖；(2)每條染色體具體區(qū)間拷貝數(shù)發(fā)生變異的詳細(xì)圖；(3)變異結(jié)果的圖標(biāo)展示；(4)變異結(jié)果的遺傳學(xué)解讀；5、參考范圍的確定：通過對88例明確拷貝數(shù)位點區(qū)域的測序結(jié)果評估，計算假陽性、假陰性并給出特異性和敏感性的roc曲線后可以確定r值的參考范圍在[-0.2,0.2]之間，高于或者低于以上范圍則是拷貝數(shù)變異的位點。同時結(jié)合z值對拷貝數(shù)進(jìn)一步確定，z值的參考范圍是[-3,3]。對于r值大于0.2(或小于-0.2)，z值大于(或小于)3的區(qū)間，則提示該染色體區(qū)域存在拷貝數(shù)重復(fù)(或缺失)的情況，需要進(jìn)一步的臨床診斷確認(rèn)，進(jìn)一步確診方法主要是對該區(qū)域進(jìn)行核型分析或fish等其他方法進(jìn)行驗證。6、判斷嵌合體的存在和比例：上機(jī)后的數(shù)據(jù)按照前面步驟1、2的數(shù)據(jù)質(zhì)控和數(shù)據(jù)校正后，采用人工模擬染色體嵌合體配比樣本log2ratio值和嵌合體比例之間的關(guān)系，具體如下：設(shè)立了7個梯度的模擬嵌合體比例，分別為12.5％，35％，47.5％，50％，62.5％，75％，87.5％。經(jīng)過測序數(shù)據(jù)分析得出不同比例的嵌合體log2ratio值。然后將log2ratio值轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)化讀長頻率。做標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖5)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線從標(biāo)準(zhǔn)化讀長頻率可以推測出樣本是否存在嵌合體以及嵌合體比例。通過對88例樣本中的116個染色體缺失或重復(fù)片段檢測和9例核型分析驗證過的嵌合體樣本中嵌合比例的測序結(jié)果評估，結(jié)果顯示大于1mb的染色體缺失重復(fù)可以100％檢測，并且和微陣列芯片驗證結(jié)果一致。9例嵌合體樣本嵌合體全部檢出。表1為88例樣本中116個拷貝數(shù)變異大小和檢出情況以及與微陣列芯片驗證的符合率表2為ngs檢測嵌合體與核型分析比較a指ngs檢測嵌合體與核型分析檢測嵌合體兩者結(jié)果的變異系數(shù)。當(dāng)前第1頁12